Abstract
uttrykk nivåer av anoctamin 1 (ANO1, TMEM16A), en kalsium-aktiverte klorid kanal (CACC), er betydelig økt i flere svulster, og hemming av ANO1 er kjent for å redusere celleproliferasjon og migrasjon. Her, utførte vi celle-basert screening av et utvalg av naturlige produkter og narkotikalignende forbindelser for å identifisere inhibitorer av ANO1. Som et resultat av screeningen, idebenone, mikonazol og plumbagin ble identifisert som nye ANO1 inhibitorer. Elektrofysiologiske studier viste at Idebenone, en syntetisk analog av koenzym Q10, fullstendig blokkert ANO1 aktivitet i FRT celler som uttrykker ANO1 uten noen effekt på intracellulær kalsium signalisering og CFTR, en cAMP-regulert klorid kanal. CACC aktiviteter i PC-3 og CFPAC-1 celler uttrykker rikelig endogen ANO1 var sterkt blokkert av Idebenone. Idebenone hemmet celleproliferasjon og apoptose i PC-3 og CFPAC-1-celler, men ikke i A549-celler, som ikke uttrykker ANO1. Disse data antyder at idebenone, en roman ANO1 inhibitor, har potensial for anvendelse i cancerterapi
relasjon:. Seo Y, Park J Kim M, Lee HK, Kim J-H, Jeong J-H, et al. (2015) Hemming av ANO1 /TMEM16A klorid Channel av Idebenone og dens Cytotoksisitet til kreft cellelinjer. PLoS ONE 10 (7): e0133656. doi: 10,1371 /journal.pone.0133656
Redaktør: Johannes Reisert, Monell Chemical Senses Center, UNITED STATES
mottatt: 15 april 2015; Godkjent: 29 juni 2015; Publisert: 21.07.2015
Copyright: © 2015 Seo et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Yonsei-universitetet Globalt fordypningsprosjekt fra 2014, en Grant av Korea Healthcare teknologi R D Project, departementet for Health . Velferdsdepartementet, Republic of Korea (HI08C2149) og Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi [NRF-2012R1A1A1040142] Hotell
Konkurrerende interesser: The forfatterne har erklært at noen konkurrerende interesser eksistere
Innledning
Kalsium-aktiverte Cl
-. kanaler (CaCCs) er allment uttrykt i forskjellige celletyper og vev, og de er innblandet i mange fysiologiske aktiviteter som epitelial fluidsekresjon, kontraksjon av glatt muskulatur, og sensoriske signaltransduksjon [1-3]. CaCCs ble først beskrevet over 3 tiår siden, men den molekylære identitet CaCCs har nylig blitt identifisert [4]. I 2008, tre uavhengige forskergrupper rapportert at anoctamin-en (ANO1, TMEM16A) genet koder for et CACC, viser kalsiumaktiverte Cl
– strøm når det ble uttrykt i egg og pattedyrceller [5-7]. ANO1 er uttrykt i ulike celletyper, inkludert tracheal, intestinal, og kjertel epitel, glatte muskelceller, tarmpacemakerceller, sensoriske nevroner, og flere svulster [5, 7-9].
ANO1 var også kjent som oppdaget på GIST-en (DOG1), tumor forsterket og overexpressed sekvens 2 (TAOS2), og kreft i munnhulen overexpressed 2 (ORAOV2) [10, 11]. DOG1, TAOS2 og ORAOV2 er navngitt slik fordi ANO1 er sterkt overuttrykt i gastrointestinal stromal tumor (GIST) og muntlig plateepitelkarsinom. ANO1 er kartlagt til kromosom bandet 11q13 som ofte forsterket i en rekke menneskelige karsinomer inkludert hode-og-hals plateepitelkarsinom (HNSCC), GIST, bryst og prostata kreft. Nye bevis tyder på ANO1 involvering i celleproliferasjon, cellemigrering, tumorigenese og progresjon av kreft [12, 13]. For eksempel, hemming av ANO1 ekspresjon i prostatakreft PC-3-celler i betydelig grad redusert spredning, metastase og invasjon, og blokkerte tumorvekst i en xenograft musemodell [14]. Farmakologisk hemming av ANO1 av T16A
inh-A01, en selektiv ANO1 hemmer, redusert spredning av interstitiell celler av Cajal (ICC) og CFPAC-1 kreft i bukspyttkjertelen celler uttrykker endogen ANO1 [15]. I brystcancerceller, nedregulering av den ANO1 genekspresjon redusert proliferasjon, apoptose provosert, og hemmet tumorvekst i en xenograft modell. I tillegg farmakologisk hemning av CACC aktivitet av ANO1 redusert cellelevedyktighet i HNSCC, esophageal squamous cellekreft (ESCC) og brystkreftceller via hemming av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) og kalmodulin-avhengig protein-kinase II (CaMKII) signal [16 ].
de fleste bevis indikerer at farmakologisk hemming av ANO1 kanal aktivitet kan ha potensial til å gi terapeutiske fordeler til HNSCC, ESCC, GIST, bryst og prostata kreftpasienter. Siden ANO1 har nylig blitt identifisert, ble bare noen få forbindelser identifisert som potente ANO1 hemmere som CACC
inh-A01, garvesyre, T16A
inh-A01, digallic syre, diklorofen, benzbromarone, og N – ((4 metoksy) -2-naftyl) -5-nitroanthranilic syre (MONNA). Videre farmakologisk eiendom og virkningsmekanismer av hemmere er fortsatt uklart [17-21].
For identifisering av nye ANO1 hemmere, vi utført en cellebasert screening med en samling av naturlige produkter og narkotika -lignende forbindelser under anvendelse av en cellebasert high-throughput screening-analyse etablert for identifisering av inhibitorer ANO1 i tidligere studie [19]. Vi fant noen narkotika-lignende forbindelser og naturlige produkter som viser potent ANO1 hemmende aktivitet, og undersøkte effekten av treff forbindelser på vekst hemming av kreftcellelinjer som uttrykker ANO1 endogent.
Materialer og Metoder
Idebenone, koenzym Q10, plumbagin, mikonazol og andre kjemikalier, med mindre annet er angitt, ble kjøpt fra Sigma h3> Materialer og løsninger. Mus ANO2 ble kjøpt fra Origene Technologies Inc. (Rockville, MD, USA, katalogisere Ingen MC205812). Den sammensatte samlingen brukes til screening (Spectrum Collection, 2320 forbindelser) ble kjøpt fra MicroSource Discovery Inc. (Gaylordsville, CT). Dette biblioteket består av humane terapeutiske legemidler eller narkotika-lignende forbindelser og naturlige produkter. Forbindelsene ble fortynnet med DMSO for å oppnå en konsentrasjon på 2,5 mM. Dette ble anvendt som 100 x konsentrert stamløsning, som ble behandlet på cellene.
Cellekultur
Fisher-rotte thyroid (FRT) celler ble stabilt transfektert med human ANO1 (ABC) eller human vill skriver CFTR hver for seg, og begge celler ble stabilt transfektert med den halogenidet sensor YFP-H148Q /I152L /F46L eller YFP-H148Q som beskrevet i foregående studie [20, 22]. FRT celler ble stabilt transfektert med musen ANO2 (Origene Technologies Inc.) og halogen sensor YFP-F46L /H148Q /I152L. FRT-celler dyrket i Coon`s modifisert F12 medium supplert med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. PC3 og HT-29-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. A549-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) inneholdende 10% FBS, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. CFPAC-1-celler ble dyrket i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM) supplert med 10% FBS, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin.
Cell basert screening
ANO1 /TMEM16A og YFP uttrykker FRT-celler ble sådd ut i 96-brønners sorte vegger mikroplater (Corning Inc., Corning, New York) ved en tetthet på 20.000 celler per brønn i F12-medium supplert med 10% FBS, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin. Analysene ble gjort ved hjelp av FLUOstar Omega mikroplateleser (BMG Labtech, Ortenberg, Tyskland) og MARS dataanalyse programvare (BMG Labtech). Hver brønn i 96-brønns plate ble vasket 3 ganger i PBS (200 pl /vask), slik at 100 ul PBS. Test-forbindelsene (1 ul) ble tilsatt til hver brønn ved 25 pM sluttkonsentrasjon. Etter 10 min, ble 96-brønners plater overføres til en plateleser for fluorescens-analyse. Hver brønn ble analysert individuelt for TMEM16A-mediert jeg
– tilstrømningen av opptak fluorescens kontinuerlig (400 ms per punkt) for 2 s (baseline), deretter 100 ul 140 mM jeg
– løsning inneholdende 200 mM ATP ble lagt 2 s og deretter YFP fluorescens ble registrert for 6 s. Initial jodid tilstrømningen hastighet ble bestemt ut fra den første skråningen av fluorescens reduksjon, ved ikke-lineær regresjon, etter infusjon av jod med ATP.
Ussing Chamber studie
Snapwell inserts inneholder ANO1- eller CFTR-uttrykke FRT celler ble montert i Ussing-kammere (fysiologisk Instruments, San Diego, California). Den basolateral Badet ble fylt med HCO
3
– bufret oppløsning inneholdende (i mM): 120 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl
2, 1 CaCl
2, 10 D-glukose, 2,5 HEPES, og 25 NaHCO
3 (pH 7,4), og den apikale badekaret var fylt med en halv-Cl
– løsning. I halv-Cl
– løsning 65 mM NaCl i den HCO
3
– bufret løsning som ble erstattet av Na-glukonat. Den basolateral Membranen ble permeabilisert med 250 ug /ml amfotericin B. Celler ble badet i en 20 minutters stabiliseringsperiode, og gjennomluftet med 95% O
2/5% CO
2 ved 37 ° C. ATP ble påført den apikale badet løsning for å indusere intracellulær kalsium økning; Idebenone, forskolin og CFTR
inh-172 ble lagt til den apikale og basolateral bad løsning. Apikale membran strømmer ble målt med en EVC4000 Multi-Channel V /I Clamp (World presisjonsinstrumenter, Sarasota, FL) og registreres ved hjelp PowerLab 4/35 (AD Instruments, Castle Hill, Australia). Data ble samlet inn og analysert med ADInstruments oppkjøpet programvare Labchart Pro 7 programvare. Samplingsfrekvensen var 4 Hz.
Patch-clamp
Hel-celle patch-clamp opptakene ble utført på ANO1-uttrykker FRT celler og PC3 celler. Badoppløsningen inneholdt (i mM): 140 NMDG-Cl, 1 CaCl
2, 1 MgCl
2, 10 glukose og 10 HEPES (pH 7,4). Pipetten løsning inneholdt (i mM): 130 CsCl, 0,5 EGTA, 1 MgCl
2, 1 Tris-ATP, og 10 HEPES (pH 7,2). Pipettes ble trukket fra borsilikatglass og hadde motstander på 3-5 Megohm etter brann polering. Etter etablering av hel-celle-konfigurasjon, ble ANO1 aktivert av ATP (100 uM). Hel-celle strømmer ble utløst ved å påføre Hyperpolarizing og depolariserende spenningspulser fra et holdingselskap potensial fra 0 mV til potensialer mellom -80 mV og 80 mV i trinn på 20 mV. Opptakene ble gjort i romtemperatur ved hjelp av en Axopatch-200B (Axon Instruments, Union City, CA). Currents ble digitalisert og analysert ved hjelp av en Digidata 1440A konverter (Axon Instruments), og pCLAMP 10,2 programvare (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Currents ble low-pass filtrert ved 1 kHz og samplet på 5 kHz.
Immun
Cell ekstrakter og immunoblotting ble fremstilt som beskrevet tidligere [23]. FRT-ANO1, PC3, CFPAC-1 og A549-celler ble lysert med cellelyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% Nonidet P-40, 0,25% natrium-deoksycholat, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM na
3VO
4, og proteasehemmer blanding). Helcellelysater ble sentrifugert ved 15 000 g i 10 min ved 4 ° C for å fjerne celleavfall, og like mengder (80 pg protein /spor) av supernatant protein ble separert ved 4-12% Tris-glysin prefabrikerte gel (KOMA BIOTECH, Seoul, Korea) og deretter overført til PVDF-membran (Millipore, Billerica, Massachusetts). Membranen ble blokkert med 5% fettfri skummet melk i Tris-bufret saltvann (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl) som innbefatter 0,1% Tween 20 i 1 time ved romtemperatur. Denne membranen ble deretter inkubert over natten med primær ANO1 antistoff (en sjenerøs gave av Young Duk Yang, CHA University). Etter vasking med 0,1% Tween 20 i Tris-bufret saltvann (TBST), blotten ble ytterligere inkubert i 45 minutter ved romtemperatur med et anti-kanin-sekundært antistoff (Cell Signaling). Membranen ble deretter vasket tre ganger med TBST i 5 minutter og deretter visualisert ved anvendelse av ECL western blotting Plus deteksjonssystem (GE Healthcare Amersham, Piscataway, NJ).
Intracellulær kalsium måling
FRT og HT-29 celler ble dyrket i 96-brønn svart vegger mikroplater og lastet med Fluo-4 NW per produsentens protokoll (Invitrogen, Carlsbad, California). Kort fortalt ble cellene inkubert med 100 pl forsøksbuffer (1X Hanks «balanserte saltløsning med 2,5 mM probenecid og 20 mM HEPES) innbefattende Fluo-4 NW. Etter en times inkubasjon ble 96-brønners plater overføres til en plateleser for fluorescens-analyse. Fluo-4 fluorescens ble målt med en FLUOstar Omega mikroplateleser (BMG Labtech) utstyrt med sprøytepumper og tilpassede Fluo-4 eksitasjon /emisjonsfiltre (485/538 nm). Intracellulær kalsium var økningen ved bruk av 100 mikrometer ATP.
celleproliferasjon analyser
PC3, CFPAC-en og A549-celler ble sådd ut på 96-brønners mikroplater. Etter 24 timers inkubering ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av idebenone (3, 10, 30 uM), koenzym Q10 (100 uM) og T16A
inh-A01 (10 uM), og de ble deretter inkubert i 2 dager. En lik mengde DMSO ble tilsatt til alle kontroll. Kulturmediet, og forbindelsene ble skiftet hver 12 timer. For å vurdere celleformering, etter 48 timers inkubering med forbindelsene, BrdU (sluttkonsentrasjon: 10 uM) ble tilsatt og cellene reinkubert i ytterligere 2 timer. BrdU innlemmelse ble bestemt ved Cell Proliferation ELISA, BrdU (kolo) kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). For MTS-analyse, etter 48 timers inkubering ble cellene reinkubert med MTS i 1 time. Den oppløselige formazan produsert av cellulære reduksjon av MTS ble kvantifisert ved å måle absorbansen ved 490 nm med Infinite M200 (Tecan, Grödig, Østerrike) mikroplateleser. MTS analysen ble gjort ved hjelp CellTiter 96 vandige løsning Cell Proliferation Assay kit (Promega, Madison, WI, USA).
sårtilheling analysen
Cell mobilitet ble vurdert ved hjelp av en ripe såret analysen. PC3-celler ble dyrket i en 96-brønns plate før det var sammenflytende. Cellelaget ble såret ved bruk av en 96-brønns WoundMaker (Essen BioScience, Michigan, USA) og vasket to ganger med friskt serumfritt medium. Cellene ble inkubert med serumfritt medium, og bilder av sårene ble automatisk tatt hver 2 timer i 48 timer ved hjelp av IncuCyte ZOOM (Essen BioScience). Bildene ble analysert av IncuCyte programvarepakken (Essen BioScience).
tunel analyser
PC3, CFPAC-1 og A549-celler ble sådd ut på 96-brønn svart vegger mikro. Etter 24 timers inkubering ble cellene behandlet med idebenone (30 uM) og deretter inkubert i 2 dager. Cellene ble fiksert og farget med TUNEL (terminal deoksynukleotid transferase-mediert dUTP nick-end merking, grønn) ved hjelp av ApopTag Fluorescein direkte In Situ apoptose Detection Kit (Millipore, Billerica, MA, USA), og deretter kjernen ble farget med DAPI ( 4,6-diamidino-2-fenylindol, blå).
Statistisk analyse
resultatene av flere eksperimenter er presentert som gjennomsnitt ± SE Statistisk analyse ble utført med t-test eller ved analyse av varians etter behov. En verdi på
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Identifikasjon av ANO1 /TMEM16A hemmere
En cellebasert screening av en samling av naturlige produkter og narkotika-lignende forbindelser ble gjort for identifisering av ANO1 inhibitorer. ANO1 klorid kanal aktivitet ble målt ved hjelp av Fischer rotte skjoldbruskkjertelen (FRT) celler som stabilt uttrykker menneskelig ANO1 og genetisk kodet jod-sensing fluorescerende protein, YFP-F46L /H148Q /I152L. Som vist i figur 1A, for screening for å identifisere ANO1 inhibitorer, de FRT cellene ble pre-inkubert med testforbindelser i PBS før tilsetning av et jodid og ATP, en agonist av P2 purinergiske reseptor som forårsaker en økning i intracellulær kalsiumkonsentrasjon, inneholdende oppløsning. I nærvær av ANO1 inhibitor, vil YFP fluorescensslukking av jodid inntak gjennom ANO1 bli hemmet.
(A) Prinsipp for cellebasert, fluorescens high-throughput screening-analyse. (B) Kjemiske strukturer av ANO1 hemmere. (C) YFP fluorescens målt i enkelte brønner av 96-brønners plater, som viser inhiberende effekt av idebenone, mikonazol og plumbagin på ANO1 kanal aktivitet. Indikerte konsentrasjoner av Idebenone, mikonazol og plumbagin ble lagt 20min før ANO1 aktivering av 100 mikrometer ATP
Screening av 2320 forbindelser ga 24 forbindelser som blokkerte jodid tilstrømningen av 70% ved 25 uM. Vi fant tre nye ANO hemmere, Idebenone, plumbagin og mikonazol, fra primær hit forbindelser. Idebenone, plumbagin og mikonazol hemmet betydelig ANO1 klorid kanal aktivitet på en doseavhengig måte og fullt hemmet ANO1 30 mikrometer (fig 1c).
Karakterisering av Idebenone
Idebenone ble videre undersøkt fordi Idebenone , en syntetisk analog av koenzym Q10 (CoQ10) viser potent og selektiv hemming av ANO1, og er mye brukt som en kraftig antioksidant. Apikale membran strøm måling i ANO1-uttrykker FRT celler ga en IC
50 på 9,2 mikrometer for Idebenone og viser nesten fullstendig hemming av ANO1 klorid strømninger med 30 mikrometer Idebenone (Fig 2A og 2B). For å undersøke effekten av idebenone på intracellulær kalsiumsignalisering, ble HT-29 og FRT-celler lastet med Fluo-4 NW, en fluorescerende kalsium sensor. Cellene ble forbehandlet med 30 mM idebenone og deretter ATP påført ved en konsentrasjon på 100 uM indusert forbigående økning i cytosol-kalsiumkonsentrasjonen. ATP-indusert cytosolic kalsium økningen var ikke signifikant påvirket av Idebenone (Fig 2C). For å belyse om Idebenone endrer andre klorid kanaler, cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR) og ANO2 (TMEM16B), som deler en høy aminosyre homologi til ANO1, målte vi apikale membran strømninger i FRT-celler som uttrykker human villtype CFTR og mus ANO2 (mANO2). CFTR kanal aktivitet ble rammet bare litt av Idebenone. Det hemmet CFTR ved 8,2 ± 0,2% ved 30 uM, en konsentrasjon som fullstendig inhiberer ANO1 (figur 2D), men ikke overraskende idebenone sterkt inhibert 100 uM ATP-indusert aktivering av mANO2 på en doseavhengig måte i FTR-mANO2 celler ( fig 2E). Vi målte apikale membran strømninger å observere effekten av Q10 på ANO1 kanal aktivitet i FTR-ANO1 celler fordi Idebenone er en kort-kjeden analog av Q10. Som vist i figur 2F, hadde 100 uM CoQ10 ikke inhiberer ATP-indusert ANO1 klorid strømmer. For å undersøke om Idebenone reversibelt hemmer ANO1, målte vi apikale membran strømninger i FTR-ANO1 celle med E
handling, en spesifikk aktivator av ANO1. Forbehandling av 100 mikrometer Idebenone fullstendig hemmet E
handling-indusert ANO1 aktivering (figur 2G). Som vist i figur 2H, forbehandling av 100 uM idebenone fullstendig hemmet ATP-indusert ANO1 aktivering. Men etter utvasking, det meste av den hemmende effekten av Idebenone på ANO1 aktivering av E
akt ble fjernet. Idebenone dermed reversibelt hemmer ANO1 uten endringer i intracellulær kalsium signalisering.
(A) apikale membran strømninger ble målt i FRT-ANO1 celler. Idebenone ble tilsatt 10 min før aktivering ved ANO1 100 uM ATP. (B) Oppsummering av dose-respons (gjennomsnitt ± S.E., n = 3-4). (C) Intracellulær kalsiumkonsentrasjonen ble målt under anvendelse av Fluo-4 i HT-29 og FRT-celler. 30 mikrometer Idebenone (IDE), mikonazol (MCZ) og plumbagin (PLB) ble forbehandlet i 20 minutter og deretter 100 mikrometer ATP ble brukt. (D) Virkning av idebenone på CFTR kloridkanal-aktivitet ble målt i FRT-celler som uttrykker human villtype CFTR. CFTR ble aktivert med 20 mikrometer forskolin og hemmet med 10 mikrometer CFTR
inh-172. (E) Effekt av Idebenone på mus ANO2 (mANO2) ble målt i FRT-mANO2 celler. (F) Effekt av Koenzym Q10 (CoQ10) på ANO1 kanal aktivitet ble observert i FRT-ANO1 celler. 100 uM CoQ10 ble forbehandlet i 20 min og deretter 100 uM ATP ble påført. (Høyre) Oversikt over toppstrøm (gjennomsnitt ± S.E., n = 3-4). (G) Effekt av Idebenone på ANO1 aktivering av E
handle i ANO1-uttrykke FRT celler. 100 mikrometer Idebenone (grå linje) ble forbehandlet i 20 min og ANO1 ble aktivert med 10 mikrometer E
handling. De resterende ANO1 strømninger ble hemmet av T16A
inh-A01. (Høyre) Sammendrag av toppstrøm (gjennomsnitt ± S.E., n = 3). (H) Idebenone reversibilitet. Etter vanishment av 100 uM ATP-indusert ANO1 strøm, ble cellene vasket tre ganger i 5 minutter hver, og deretter ANO1 ble aktivert ved 10 pM E
akt. (Høyre) Sammendrag av toppstrøm (gjennomsnitt ± S.E., n = 3). ** P 0.01, *** P 0.001, Studentenes uparet t-test.
Hel-celle patch clamp i FRT-ANO1 og PC-3 celler
I figur 3, hel-celle patch clamp analyse ble gjort å bestemme hemming mekanismer Idebenone. I FRT celler som uttrykker ANO1, anvendelse av 10 uM inhiberte idebenone ATP-induserte ANO1 klorid strømmer ved alle spenninger, noe som indikerer at den har den hemmende effekten gjennom en spenningsuavhengig mekanisme (figur 3A). Patch clamp måling av hel-celle strømmer i PC-3 (human prostata adenokarsinom avledet) som uttrykker høyt nivå av ANO1 viste at idebenone ved 10 uM og 30 uM inhiberer ATP-induserte CaCCs klorid strømmer med ~ 54% og ~ 90%, respektivt (fig 3B).
(A) (til venstre) Hel-celle ANO1 nåværende registrert ved et holdingselskap potensial på 0 mV og pulserende til spenninger mellom ± 80 mV (i trinn på 20 mV) i fravær og nærvær av 10 mikrometer Idebenone. ANO1 ble aktivert ved 100 uM ATP. (Midten) Current /spenning (I /V) tomt på gjennomsnitts strømmer på midten av hver spenningspuls. (Høyre) De søylediagram oppsummerer data strømtettheten målt til + 80 mV (gjennomsnitt ± S.E., n = 4). (B) (til venstre) Hel-celle patch clamp opptak av PC3 celler. CACC strømmer registrert i fravær og nærvær av Idebenone. CACC ble stimulert av 100 mikrometer ATP. (Midten) Current /spenning (I /V) tomt på gjennomsnitts strømmer på midten av hver spenningspuls. (Høyre) De søylediagram oppsummerer data strømtettheten målt til + 80 mV (gjennomsnitt ± S.E., n = 4). ** P 0,01, Studentenes uparet t-test.
ANO1 hemmere redusere celleproliferasjon og migrasjon i adenokarcinomceller
Tre typer menneskelig adenokarsinom cellelinjer ble testet for å bestemme effekten av Idebenone på den endogene CaCCs aktivitet og cellevekst og migrasjon. Western blotting viste at endogen ANO1 blir uttrykt ved høye nivåer i PC3 og CFPAC-1 (human pankreatisk duktus adenokarsinom avledet) celler, men ikke i A549 (human lunge adenokarsinom avledet) celler (figur 4A). YFP fluorescens bråkjøling analysen med CFPAC-1-celler som uttrykker den halogenidet avføling mutant YFP avslørte at idebenone potente blokkerte ATP-indusert CACC klorid kanal aktivering i en doseavhengig måte (figur 4B). For å undersøke hvorvidt ANO1 inhibitorene påvirker cellevekst, idebenone, mikonazol og plumbagin ble påført på PC3-celler som uttrykker høye nivåer av ANO1 og A549-celler som ikke uttrykker ANO1. Resultatene er vist i figur 4C, og de viser at idebenone vesentlig hemmet cellevekst i PC3-celler, men ikke i A549-celler. Mikonazol og plumbagin viste sterk inhibering av cellevekst i begge PC3 og A549-celler, men det var ikke overraskende fordi i flere tidligere undersøkelser, ble det vist at mikonazol og plumbagin inhiberte cellevekst av forskjellige humane cancerceller gjennom ulike mekanismer [24-29] . Effekten av ANO1 hemming av Idebenone på cellemigrasjon ble bestemt ved hjelp av en sårtilheling analyse i PC3 celler. I analysen styre PC3-celler omfattet 63,6 ± 2,5% (n = 5) av såret, mens T16A
inh-A01 (30 uM) og idebenone (10 og 30 uM) behandlede celler omfattet 39,6 ± 2,5, 26,1 ± 1,8 og 13,8 ± 0,8% (n = 5) av såret på 48 timer post-vikling, henholdsvis (figur 4D).
(A) Immunoblot av ANO1 protein i FRT-ANO1, PC3, CFPAC-1 og A549 celler. Representanter for tre sett med studier er vist. (B) Effekt av Idebenone på CaCCs ble målt i CFPAC-1 celler uttrykker halogen sensitiv mutant YFP. CaCCs ble aktivert av 100 mikrometer ATP. (C) PC3 og A549-celler ble behandlet med idebenone (30 uM), mikonazol (30 uM) og plumbagin (30 uM), og celleproliferasjon ble målt etter 2 dager ved bruk av MTS-assays (gjennomsnitt ± S.E., n = 6). (D) sårtilheling analyse i PC3 celler. Cellene ble behandlet med T16A
inh-A01 (30 mm) og Idebenone. (Venstre) for lukking av sår ble kvantifisert ved hver 2 timer etter sår (gjennomsnitt ± S.E., n = 5). (Høyre) Representative bilder tatt ved 0 timer og 48 timer etter såret (× 10). ** P 0,01, Studentenes uparet t-test.
For ytterligere å bestemme effekten av Idebenone på celleproliferasjon, observerte vi celleproliferasjon i respons til Idebenone hjelp MTS analysen og BrdU analysen i PC3, CFPAC-en og A549-celler (fig 5). I denne studien ble koenzym Q10 anvendt som negativ kontroll, fordi det ikke inhiberer ANO1 /CaCCs selv om idebenone er en syntetisk analog av koenzym Q10 (figur 2F). Cellene ble behandlet med idebenone (3, 10 og 30 uM), koenzym Q10 (100 uM) og T16A
inh-A01 (10 uM), og den celleformering ble kvantitativt beregnet etter 2 dager. I PC3 og CFPAC-1-celler, idebenone hemmet celleviabilitet og BrdU-inkorporering i en doseavhengig måte, men idebenone og T16A
inh-A01did ikke påvirke cellenes levedyktighet og BrdU-inkorporering i A549-celler (figur 5A-5C). Koenzym Q10 blokkerte ikke celleformering i alle cellelinjer. Nedregulering av ANO1 induserer apoptose i flere kreftcellelinjer som overuttrykker ANO1 [14, 16, 30]. For å undersøke hvorvidt idebenone induserer apoptose i ANO1 uttrykkende celler, ble TUNEL-farging utført i adenocarcinom-cellelinjer. PC3, CFPAC-1 og A549 celler ble inkubert med 30 pM idebenone i 48 timer, og deretter DNA-skade ble overvåket ved hjelp av TUNEL-analysen. TUNEL-positive celler ble detektert i PC3 og CFPAC-1-celler, men ikke i A549-celler (figur 5D-5F).
(AC) PC3, CFPAC-1 og A549-celler ble sådd ut i 96-brønners plater, og etter 24 timers inkubasjon ble de behandlet med de indikerte konsentrasjoner av Idebenone (IDE), 100 mikrometer koenzym Q10 (Q10) og 10 mikrometer T16A
inh-A01 (A01) i MTS analysen. IDE (30 uM), koenzym Q10 (100 uM) og T16A
inh-A01 (10 uM) ble applisert på cellene i BrdU-analyse. Celleproliferasjon ble anslått etter 2 dager via MTS (venstre) eller BrdU (høyre) analyse (gjennomsnitt ± S.E., n = 6). (D-F) PC3, CFPAC-1 og A549-celler ble behandlet med 30 uM idebenone. Cellene ble farget med TUNEL (terminal deoksynukleotid-transferase-mediert dUTP nick-endemerking, grønn) og DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindol, blå). Skala barer representerer 20 mikrometer. * P 0,05, Studentenes uparet t-test.
Diskusjoner
ANO1, en nylig identifisert CACC, er sterkt overuttrykt i ulike krefttyper, inkludert HNSCC, GIST, bryst og prostata kreft. Spesielt, tyder Nyere bevis sterkt ANO1 involvering i celleproliferasjon, cellemigrering, tumorigenese og progresjon av kreft [12, 13, 16, 31]. Flere studier har indikert at ANO1 kan anvendes som et terapeutisk mål av tumorer på grunn nedregulering av ANO1 viste potensielle terapeutiske fordeler på HNSCC, ESCC, GIST, brystkreft og prostatakreft [14, 16, 30, 32, 33]. Takket være siste identifisering av ANO1, noen lite molekyl ANO1 hemmere er tilgjengelige for eksempel CACC
inh-A01, garvesyre, T16A
inh-A01, og MONNA [17, 19-21], men den farmakologiske eiendom og virkningsmekanismer av hemmere er fortsatt uklart. I denne studien, utførte vi et celle-basert screening for å identifisere nye ANO1 inhibitorer med en samling av legemiddel-lignende forbindelser og naturlige produkter. Interessant nok, oppdaget vi at idebenone sterkt inhibert ANO1.
Idebenone [2,3-dimetoksy-5-metyl-6- (10-hydroksydecyl) -21,4-benzokinon] er et syntetisk kortkjedet benzokinon som en analog ubiquinone (Koenzym Q10). Idebenone blir for tiden studert for behandling av en rekke mitokondrielle og nevromuskulære sykdommer, slik som Friedreichs ataksi (FRDA), mitokondriell encefalopati med laktisk acidose og slag-lignende episode (Melas) og Duchenne muskeldystrofi (DMD), på grunn av sin evne for å tjene som en elektronbærer i det mitokondrielle elektrontransportkjeden og dens kraftig antioksidant-aktivitet. Gunstig klinisk effekt av Idebenone har blitt rapportert i Idebenone pasienter behandlet med FRDA (300-2250 mg /dag; 0,5-5 år), Melås (90-270 mg /dag, 163 dager) og DMD (450 mg /dag, 12 måneder) [34-36]. I tillegg resultater fra store kliniske studier viste at Idebenone var trygt og godt tolerert [37, 38].
Vi viste at Idebenone potent hemmet ANO1 aktivitet i YFP fluorescens quenching analysen (figur 1C) og elektrofysiologiske studier ( 2A og 3A). For å finne ut hvorvidt antioksidant og elektronbærer aktivitet av idebenone påvirke ANO1 kanal funksjon, observerte vi effekten av Q10 på ANO1 kanalaktivitet fordi idebenone og Q10 har samme substitusjonsmønster av kinon-delen og skiller seg bare i alkyl halen festet til C6 -karbonatomet av deres kinon ring. Som vist i figur 2F, forbehandling av 100 uM Q10 litt (men ikke vesentlig) øket ANO1 strømmer i stedet for å inhibere ATP-induserte strømmer i ANO1 ANO1 uttrykker FRT-celler. I tillegg gjorde CoQ10 ikke blokkere celleviabilitet og proliferasjon i flere ANO1 uttrykkende cellelinjer (figur 5), og idebenone påvirket ikke CFTR og intracellulær kalsiumsignalisering (figur 2C og 2D). Sammen utgjør de ovenfor angitte resultater antyder at virkningsmekanismen til idebenone på ANO1 inhibering kan være direkte i stedet for gjennom sin antioksidant og elektronbærer evne. Det er fortsatt en mulighet for at Idebenone påvirke celledeling og apoptose via andre veier. Men Idebenone viste potent hemming av ANO1 og celleproliferasjon i ANO1 uttrykke celler, og en ANO1 spesifikk hemmer T16A
inh-A01 viste tilsvarende reaksjon på celleproliferasjon (fig 5). Dette resultatet tyder på at idebenone indusert ANO1 inhibering er i det minste delvis er involvert i den cytotoksiske effekt av idebenon. I figur 4D, viste vi at sterk hemming av cellevandring inn i et sår område av Idebenone. I sårheling assay, vi brukte serumfritt cellekulturmedier for å redusere cellevekst fordi begge celleproliferasjon og migrering påvirke hastigheten av sårheling. Serum deprivasjon resulterte i ~ 54% vekstinhibering (data ikke vist), og den inhiberende effekt av idebenone på sårtilheling var sterkere enn den for idebenone på celleformering (figurene 4D og 5A). Disse resultatene tyder på at Idebenone hemmer cellemigrasjon selv om veksthemming av Idebenone kan påvirke resultatet.
I den kliniske studien, pasienter har blitt behandlet med Idebenone opp til 2250 mg /dag.
