Abstract
Bakgrunn
De mekaniske egenskapene til den ekstracellulære matrise har en viktig rolle i cellevekst og differensiering. Det er imidlertid uklart i hvilken grad kreftceller reagerer på endringer i de mekaniske egenskaper (stivhet /stivhet) av mikromiljøet og hvordan denne responsen varierer mellom kreft cellelinjer.
metodikk /hovedfunnene
i denne studien vi brukte en nylig utviklet 96-brønns plate system som matriser ekstracellulære matriks-konjugert polyakrylamidgeler som øker i stivhet av i det minste 50-ganger på tvers av platen. Denne platen ble benyttet for å bestemme hvordan endringer i stivheten av den ekstracellulære matriks modulere de biologiske egenskapene til tumorceller. Cellelinjene testet faller inn i en av to kategorier basert på deres spredning på substrater av forskjellig stivhet: «stivhet avhengige» (de som viser en økning i cellevekst som ekstracellulære stivhet økes), og «stivhet uavhengig» (de som vokser like på både myke og stive underlag). Cellene som vokste dårlig på myke gelene viste også redusert spredning og migrering under disse betingelser. Enda viktigere, såing cellelinjene inn i lungene hos nakne mus viste at evnen av celler til å vokse på myke geler
in vitro
korrelert med deres evne til å vokse i et miljø bløtvev
in vivo
. Den lungekarsinom linjen A549 svart på kultur på myk gele ved å uttrykke differensiert epitel markør E-cadherin og redusere uttrykket av mesenchymale transkripsjonsfaktor Slug.
Konklusjon /Betydning
Disse observasjonene tyder på at de mekaniske egenskapene til matriksen miljø spiller en betydelig rolle i regulering av proliferasjon og de morfologiske egenskaper til kreftceller. Videre flere brønner formatet på soft-plate analysen er et nyttig og effektivt supplement til etablerte tre-dimensjonale cellekultur modeller
Citation. Tilghman RW, Cowan CR, Mih JD, Koryakina Y, Gioeli D, Slack -Davis JK, et al. (2010) Matrix Stivhet Regulerer kreft celle vekst og Cellular Phenotype. PLoS ONE 5 (9): e12905. doi: 10,1371 /journal.pone.0012905
Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Storbritannia
mottatt: 15 juli 2010; Godkjent: 24 august 2010; Publisert: 23.09.2010
Copyright: © 2010 Tilghman et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd NIH-NCI CA40042 (National Institutes of Health-National Cancer Institute) (www.nih.gov) og finansiering fra Coulter Foundation Translasjonsforskerne Partners Award (www.whcf.org) (JTP), NIH HL092961 (DJT) og NIH CA124706 (DG). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kontroll av epitelceller (EF) differensiering og proliferasjon er kritisk for vev homeostase [1], [2]. EC spredning er regulert av komplekse interaksjoner med det omgivende mikromiljøet, inkludert eksponering for vekstfaktorer, kontakt med tilstøtende celler, og adhesjon til komponenter i den ekstracellulære matriks (ECM) [3] – [6]. Endring av signalveier som regulerer svar på disse microenvironmental signaler er en kritisk hendelse i startfasen, progresjon og metastasering.
De mekaniske egenskapene til ECM har blitt identifisert som en viktig faktor som regulerer differensiering og spredning av en rekke celletyper både
in vitro Hotell og
in vivo
. Nærmere bestemt stivhet ( «stivhet») av det ECM, definert av dets elastisitetsmodul (
E
) i enheter av kraft per areal (Pa), påvirker vekst, differensiering og funksjon av mange celletyper, inkludert stamceller, fibroblaster, gliaceller, og kardiomyocytter [7] – [11]. I tillegg er sykdomstilstander ofte ledsaget av en lokal økning i ECM stivhet [12], [13]. Cancer progresjon i mykt vev er vanligvis assosiert med en økning i stivhet på grunn av lokal akkumulering av en tett, tverrbundet kollagen matriks som tillater påvisning av tumoren ved fysisk palpasjon [14], [15]. Følgelig nontumorigenic mammary epitelceller, som normalt bor i myk (
E
= 150 pascal [Pa] eller N /m
2) mikromiljøet av brystet, økt showet spredning når dyrket på stivere matriser (
E
= 4500 Pa), sammen med økt migrasjon, utvidet ERK signalering, og tap av mobilnettet polaritet [16]. Disse attributtene blir betraktet kjennetegnene til tumorceller og er karakterisert ved å være en integrert del av en overgang fra en forholdsvis stillestående til en «ondartet» fenotype, som drives av en lokal økning i ECM stivhet [16].
utstrekning og variasjon i hvilke menneskelige kreftcellelinjer er lydhør overfor variasjoner i microenvironmental stivhet er uklart. Fibroblaster transformert med onkogent H-Ras ikke lenger viser inhibering av vekst på myke underlag [11]. Dessuten er vekstegenskapene til klonale populasjoner av brystkreftcellelinjen MDA-MB-231 varierer i respons til stivhet, og de korrelerer med evnen til å vokse i bløt lunge eller stive ben
in vivo product: [ ,,,0],17]. Dette tyder på at vekstegenskapene til en spesiell kreftcellelinje som respons på substratet stivhet kan bestemmes av dens genetiske eller epigenetisk blandingen.
Analyse av humane kreftcellelinjer blir generelt utført ved hjelp av celler dyrket på stiv plast, eller i Matrigel eller bløt agar, blir de mekaniske egenskaper som dårlig definert og /eller vanskelige å modulere. I denne studien har vi tilpasset en fremgangsmåte for dyrking av celler på biologisk relevante «myke» substrater ved hjelp av ECM-konjugert polyakrylamid (PA) geler som kan strekke seg over stivheten området 100 Pa-150000 Pa. Vi brukte en nylig utviklet 96-brønners analysesystem som arrays PA gels av varierende stivhet i brukerdefinerte intervaller over hele platen. Dette system ble anvendt for å bestemme hvordan endringer i stivheten av ECM modulere de biologiske egenskapene til tumorceller, inkludert vekst, morfologi, og trekkende egenskaper. Cellelinjene som ble testet splittet i to kategorier basert på deres sprednings profiler: «stivhet avhengige» linjer generelt utstilt øke cellevekst som ekstracellulære stivhet økt, mens «stivhet uavhengig» linjer vokste like godt over hele testet spekteret av matrise stivhet. Viktigere, celler som vokste dårlig på myke gelene viste også redusert spredning og migrering under disse betingelser. Vi vurderte veksten av fire representative cellelinjer valgt fra disse to kategoriene
in vivo
ved innføring av cellene i det myke vevet omgivelsen i lungen. De to stivhet uavhengige cellelinjer (PC-3 og mPanc96) vokste godt i mykt vev (lunge), mens stivhet avhengige cellelinjer (A549 og MDA-MB-231) ikke vokser godt i lungen. Den lungekarsinom linje A549 svarte til kulturen på myke geler ved å uttrykke den differensierte epiteliale markør E-cadherin og redusere ekspresjonen av mesenchymale transkripsjonsfaktor Slug. Disse observasjoner tyder på at de mekaniske egenskapene til matriksen miljø spiller en betydelig rolle i regulering av proliferasjon og de morfologiske egenskaper til kreftceller, og at den «stivhet profil» er en iboende egenskap av hver kreftcellelinje.
resultater
stivhet avhengig vekst av kreftcellelinjer
for å måle veksten av kreftcellelinjer som en funksjon av matrise stivhet vi tilpasset en roman 96-brønn analysesystem ( «soft-plate96» ) som bruker kollagen kovalent bundet til polyakrylamidgeler som substrat i stedet for ECM-belagt stiv plast. De myke plater besto av fem deler, som hver inneholder to kolonner av kollagen-belagte PA-geler av en spesifikk elastisitetsmodul (fig. 1), 150 Pa og 1200 Pa (sammenlignes med lunge og bryst), 2400 Pa og 4800 Pa ( sammenlignes med en brysttumor), og 9600 Pa (approksimerings tverrstripet muskel). Disse elastisitetsmoduler ble valgt basert på publiserte målinger av stivheten av mykt vev og svulster [7], [10], [16], [18], og den foreløpige data som viser at de største endringene i stivheten-avhengig celleproliferasjon skjer etter 150 Pa og 4800 Pa (data ikke vist).
en typisk fem-dagers vekstanalyse ved anvendelse av en soft-plate96 gir en «vekstprofil», som reflekterer effekten av stivheten på proliferasjon av cellelinjen.
Vi bestemte vekstprofilen til fjorten cancercellelinjer ved plating av cellene på den myke plate96 og måle ganger endring i celleantall etter fem dager ved bruk av et fluorescerende DNA-bindende fargestoff (fig. 2) . I tillegg ble vekst profilene til nontumorigenic mammary epitelceller (MCF-10A) og to fibroblast linjer bestemt. Cellevekst på definerte matriser som genereres en kvalitativ «vekstprofil» for hver cellelinje (Fig. 1, 2). Vekst profiler av cellelinjene falt inn i en av to kategorier: «stivhet avhengige» celler, i det minste en to-gangers forandring i celleantall innenfor hele ekstracellulære stivhet testes (for eksempel, MDA-MB-231 brystcancerceller og A549 lungekreftceller), og «stivhet uavhengige» celler som vokste like godt innenfor hele testet matrise stivhet (for eksempel PC-3 prostata kreftceller og mPanc96 bukspyttkjertelcancerceller) (fig. 2). Det var ingen korrelasjon mellom formen på stivheten avhengige vekst profil og vev av opprinnelse, eller hvorvidt cellene ble opprinnelig dyrket fra den primære tumoren eller fra et metastatisk lesjon.
I tabellen er en kompilering av fem -Day vekstmålinger for 17 cellelinjer. Inkludert i tabellen er opprinnelig kilde av cellene (angitt med litteratur sitater), evnen til å vokse på 150 Pa og 9600 Pa substrater (fra SoftPlate96 analyser), og den myke plate96 vekstprofil for hver cellelinje. Grey profiler indikerer stivhet avhengig linjer og svarte profiler indikerer stivhet uavhengig linjer. Veksten er målt som følger: – en fold; + 1-5 ganger; ++ 5-10 ganger; +++ 10-15 ganger; ++++ 15-20 ganger; +++++ . 20 gangers økning i celle nummer over 5 dager
Vi tegnes to cellelinjer som viste stivhet avhengig vekst (MDA-MB-231 og A549) og to celle videre linjer som viste stivheten-uavhengig vekst (mPanc96 og PC-3). Hver cellelinje viste sterk cellevekst på stive kollagen-belagte plast (fig. 3A). Stivheten-avhengige celler viste en 4-5 gangers økning i antall på de mer rigide geler (4800-9600 Pa) i forhold til den myke (150-1200 Pa) gels (fig. 3B, topp paneler). I motsetning til dette, de to stivhet uavhengige cellelinjer viste nesten tilsvarende tall på de myke og stive geler (fig. 3B, nedre paneler). For å avgjøre om differensial vekst på myke eller stive underlag representerte utvalg av en populasjon av celler som utviser fortrinnsrett vekst på forskjellige underlag, A549 eller MDA-MB-231 celler ble dyrket på plast eller 150 Pa substrater for 15 dager. Disse cellene ble deretter høstet og underkastet en 5 dagers vekstanalyse på en myk-plate96. Ingen endring i den myke plate vekstprofil ble observert etter langvarig dyrking på myke underlag (fig. S1). Disse data klart etablert cellelinje spesifikke forskjeller i evnen til å vokse i myk versus stive substrater, og antyder at «stivhet profil» er en iboende egenskap av hver cellelinje.
a.) 5-dagers vekstanalyse av fire kreftcellelinjer på plast. B.) 5-dagers vekstmålinger av de fire kreftcellelinjer på en myk-plate96. Data er uttrykt som ganger endring over antall celler innledningsvis belagt. Resultater viser middelverdi ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter. * P. 0,05 vs. vekst på 9600 Pa, målt ved enveis ANOVA etterfulgt av Tukey test
Egenskaper av stivhet-avhengige og-uavhengig cellelinjer på ulike underlag
Vi vurderte om nedsatt vekst av stivhet avhengige celler på myke geler var på grunn av feil i adhesjon til underlaget, en blokk i cellesyklus, eller induksjon av apoptose. A549 og MDA-MB-231-celler ble sådd ut på den myke plate96, tillates å følge i seks timer, og antallet festede celler målt. Begge cellelinjer festet effektivt til kollagen-gelene uten hensyn til elastisitetsmoduler (fig. 4A), noe som indikerer at lavere antall celler på gelene etter fem dager er ikke på grunn av en manglende cellefesting.
a.) A549 og MDA-MB-231-celler ble sådd ut på en myk-plate96 og totalcelletall per brønn ble telt etter 6 timer med vedlegg. Data er uttrykt som prosent av adhesjon til 150 Pa-geler. B.) A549 og PC-3-celler ble dyrket på 150 Pa eller 4800 Pa gel substrater for 5 dager, etterfulgt av cellesyklusanalyse. Resultatene viser gjennomsnitt av minst tre forsøk ± SEM. * P. 0,05
Mangel på vedheft signalisering i forankringsavhengige celler resulterer i en blokk på G1 /S sjekkpunkt av cellesyklusen [19]. A549-celler dyrket på en 150 Pa gel i fem dager viste en beskjeden, men signifikant akkumulering i G1 fasen av cellesyklusen med en tilsvarende reduksjon i prosentandelen av celler i S-fasen (fig. 4B), i overensstemmelse med en blokk på baks G1 /S sjekkpunkt. I motsetning til dette, MDA-MB-231-celler utviste ingen signifikant forandring i deres cellesyklusprofil, lik stivheten uavhengige cellelinjer PC-3 og mPanc96 (Fig. 4B). Men begge de fasthets-avhengige cellelinjer (A549 og MDA-MB-231) viste betydelig apoptose når de dyrkes på myke geler i fem dager, mens den stivhet uavhengige PC-3 og mPanc96 cellelinjer ikke (fig. 5A- B). Ingen av de fire cellelinjer som fremviste betydelig apoptose når dyrket på de mer stive (4800 Pa) gels. Disse data indikerer at den «stivhet profil» av celler som ikke reflekterer forskjeller i adhesjon til matrisen, men mer sannsynlig reflekterer stivhet avhengige endringer i cellesyklusprogresjon og celle apoptose.
A.) Representative mikrografer av A549 og MDA-MB-231 celler belagt i 5 dager på 150 Pa eller 4800 Pa gel underlag. Alle cellekjerner er farvet med DAPI (blå) og TUNEL-positive celler er merket med fluorescein (grønn). Bar = 100 mikrometer. B.) Kvantifisering av TUNEL farging. Gjennomsnitt av 2 eksperimenter ± SEM med en total på minst 400 celler telles for hver tilstand.
Muligheten for kreft cellelinjer for å danne kolonier i bløtvev korrelerer med sin soft-plate96 profiler
vurdert om differensial evne til å vokse på myke underlag som oppvises av stivheten-avhengige og-uavhengig cellelinjer var prediktiv for evnen disse celler til å vokse i et miljø bløtvev
in vivo
. To stivhet avhengige linjer (MDA-MB-231 og A549) og to stivhet uavhengige linjer (PC-3 og mPanc96) ble stabilt transdusert med et GFP-kodende lentivirus, og injisert i halevenen til nakne mus. Enten 2-24 timer eller 14 dager etter injeksjon GFP-positive cellepopulasjon i lungehomogenater ble bestemt ved flowcytometri og histokjemi. Hver av cellelinjene oppviste betydelig antall celler i lungene postinjeksjons (figur 6A, panel høyre;. Data ikke vist). Imidlertid, etter to uker lungene av mus injisert med to stivhet-avhengige cellelinjer (MDA-MB-231 og A549) inneholdt færre GFP-positive celler, i forhold til lungene av mus injisert med stivhet uavhengige cellelinjer (PC- 3 og mPanc96) (fig. 6A, venstre panel). Hematoxylin og eosin (H 0,05 vs. MDA-MB-231-celler som målt ved en-veis ANOVA, etterfulgt av Tukey test. (Høyre) GFP-merket A549 og mPanc96 celler ble sådd inn i lungene, og andelen av GFP-positive celler ble bedømt i intervaller over 24 timer. B.) Histologi av musen lunge på 14 dager etter injeksjon av A549 celler (venstre panel) og mPanc96 celler (panel høyre). Pilene viser mikrometastaser. C) Sammenligning av veksten av cellelinjer på plast (tatt fra fig. 3A), og på 1200 Pa substrater (tatt fra fig. 3B).
økt proliferasjon og cellevandring av stivhet avhengig celler korrelerer med cellespredning
neste vurdert om spredning av fasthets-avhengige cellelinjer korrelerte med evnen til cellene til å spre seg på forskjellige substrater gel. Både MDA-MB-231 og A549-celler viste signifikant økning i celle spredning på 4.800 Pa-geler i forhold til 150 Pa geler (fig. 7A-B). Lignende resultater ble oppnådd når BxPC-3-celler, en pankreatisk linje som oppviser en sammenlignbar vekstprofil til MDA-MB-231 og A549-celler (fig. 2), ble dyrket på 150 Pa og 4800 Pa geler (data ikke vist). Interessant, PC-3 celler (stivhet uavhengig) var i stand til å spre på 150 Pa gels til en lignende grad som på 4800 Pa gels, mens mPanc96 celler (stivhet uavhengig) ikke spre bart på enten myke eller stive underlag (Fig . 7A-B). Evnen til å spre seg på flere stive substrater også korrelert med evne til A549 og MDA-MB-231-celler til å migrere. I motsetning til dette, både PC-3 og mPanc96 celler kunne ikke vise betydelige forskjeller i migrering når utsådd på myk versus mer stive substrater (Fig. 7C). Disse resultater viser at for stivhet avhengige cellelinjer evnen til cellene til å spre korrelerer med økt proliferasjon og migrasjon. For stivhet uavhengige celler disse atferd synes å være frakoplet.
A.) Mikrografer av A549, MDA-MB-231, PC-3, og mPanc96 celler som ble belagt på 150 eller 4800 Pa gel underlag for 20 timer. B.) Områder i celler som ble belagt i 20 timer på 150 eller 4800 Pa gel substrater. Resultater viser middelverdi gangers økning i forhold til en celle unspread ± SEM fra minst 20 celler tellet for hver tilstand. C) A549, MDA-MB-231, PC-3, og mPanc96 celler ble sådd ut i 2 timer, deretter filmet i ytterligere 18 timer. Gjennomsnittlig cellehastighet ± SEM i um /h ble bestemt ved å spore og måling av banene på 15 celler pr stivhet pr cellelinje. * P. 0,05
fokal adhesjonskinase (FAK) er en kritisk komponent i signalintegrin signalering og har vært implisert i å avføle stivheten av ECM [20], [21]. FAK-aktivitet, som målt ved dens autofosforylering på tyrosine397, ble bare beskjedent aktivert som en funksjon av matrise stivhet i A549-celler, og ble ikke signifikant endret i de andre cellelinjene som ble testet (fig. S2). Disse dataene understreker at atferd av de ulike kreftcellelinjer på myke eller stive underlag ikke kan bare tilskrives endringer i generell adhesjon signal gjennom FAK aktivering.
De mekaniske egenskapene til mikro regulere epiteliale og mesenkymale egenskaper A549 celler
konvertering av normale epitelceller til ondartede metastatisk kolleger ofte innebærer tap av uttrykket E-cadherin og oppkjøpet av en mer vandrende fenotype – en prosess kalt epitel-til-mesenchymale overgang (EMT). A549-celler dyrket på myke (150 Pa) gels i 5 dager dannet klaser uten synlige kontakt adhesjoner eller sammenspennings fibre (Fig. 8A). I motsetning til dette ble cellene på stivere (4800 Pa og 19200 Pa) gels spres og mer dispergere oppviser fremstående spennings fibre og fokal adhesjon (fig. 8A), alle som kjennetegner den mesenchymale fenotype. Immunfluorescens farging eller western blot analyse av celler dyrket på 150 Pa gels eller 4800 eller 19200 Pa gels viste signifikant oppregulering av E-cadherin uttrykk på myke underlag (Fig. 8B-C). Imidlertid ble ingen vesentlig endring i ekspresjon av mesenchymale markør vimentin observert i celler som vokser på de forskjellige substrater (Fig. 8C).
A). A549-celler ble dyrket i 3 dager på geler med stivheter 150 , 4800, eller 19 200 Pa. Cellene ble fiksert og farget for aktin (grønn) og paxillin (rød). Pilene viser fokale sammenvoksninger. B.) A549-celler ble dyrket på geler med stivheter på 150 eller 19200 Pa. Cellene ble fiksert og farget for aktin (grønn) og E-cadherin (rød). C) A549 celler dyrket på PA geler og 3 dager ble lysert og blottet for uttrykk av E-cadherin, vimentin, og aktin. D.) De relative nivåer av Slug og E-cadherin mRNA i A549 celler dyrket på PA gels i 3 dager, målt ved real-time RT-PCR. Resultatene viser gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter.
transkripsjon repressor Slug er medlem av Snail familien av DNA-bindende elementer som regulerer E-cadherin uttrykk [22] og har vist seg å være kritisk for overdragelse en metastatiske fenotype i en eksperimentell modell for melanom [23]. Kvantitativ RT-PCR-analyse av A549-celler dyrkes på substrater av forskjellige stivheter avslørte en oppregulering av Slug mRNA når cellene ble dyrket på mer rigide geler (4800 og 19200 Pa) sammenlignet med den myke gel (150 Pa) (fig. 8D). Slug mRNA-nivåer inverst korrelert med E-cadherin mRNA-nivåer, som var lavere i A549-celler dyrket på de mer rigide geler sammenlignet med celler dyrket på den myke gel, i samsvar med endringer observert i E-cadherin protein ekspresjon (Fig. 8B-C) . Disse data indikerer at matriksen stivhet kan modulere E-cadherin og Slug ekspresjon i A549-celler. Interessant, MDA-MB-231-celler, mens utviser stivhet-avhengig proliferasjon, ikke uttrykte detekterbare nivåer av E-cadherin på enten 150 Pa eller 19200 Pa (data ikke vist), noe som antyder at disse cellene, mens morfologisk likhet med A549-celler på myke og harde underlag, ikke endrer uttrykket av denne epitel markør når de utsettes for en myk mikromiljøet.
Diskusjoner
de studiene som er skissert ovenfor understreke betydningen av de mekaniske egenskapene til ECM i regulering kreftcelle proliferasjon og overlevelse. Videre beskriver vi en effektiv og fleksibel analysesystemet for å bestemme hvordan endringer i matrisen stivhet innflytelse celle egenskaper. Analyse av 14 cancercellelinjer viste at å endre stivheten av kollagen-belagte grunnmasse tydelig endrer veksten av visse kreftcellelinjer ( «stivhet avhengig» vekst) samtidig som de har liten virkning på andre kreftcellelinjer ( «stivhet-uavhengig» vekst ) som vokste robust selv på underlag av meget lav stivhet. De lavere vekstrate for myke geler i stivhet avhengige cellelinjer ble forårsaket i det minste delvis ved selektiv forandring i cellesyklusprogresjon og induksjon av apoptose når cellelinjer ble platet ut på myke matriser. I tillegg var stivhet avhengige linjer viste en markert reduksjon i cellespredning og migrering når belagt på mykt versus stive substrater, og i det minste en av cellelinjene (A549) oppviste en stivhet avhengig regulering av E-cadherin ekspresjon og reversibel modulering av epitelial og mesenchymale fenotype. Til slutt, når sådd ut muse lungene, stivhet avhengige cellelinjer ikke vokse så vel som stivhet uavhengig linjer, noe som indikerer en sammenheng mellom evnen til å vokse på myke matriser
in vitro Hotell og proliferativ kapasitet
i vivo
i lungen.
soft-plate96 flere brønner assay representerer en forholdsvis høy gjennomstrømming tilnærming for å vurdere rollen som substrat stivhet på egenskapene til kreftceller i kultur. I dette system metoden ifølge Pelham og Wang [24] har blitt tilpasset for å generere et flerbrønn plate i hvilken substratet består av polyakrylamidgeler av varierende stivhet som er blitt funksjonalisert for å tilveiebringe en bindende overflate for ekstracellulære matriksproteiner, f.eks kollagen. I de ovenfor beskrevne platene ble utformet for å omfatte fem nivåer av elastisitetsmoduler, som strekker seg 150-9600 Pa studier har imidlertid andre formater lages enkelt. Endepunktet for analysen i våre studier var celleproliferasjon, men andre endepunkter, f.eks celle overlevelse er enkelt konfigureres. Som vist, tilveiebringer analysesystemet en rask og reproduserbar metode for å vurdere rollen til matrisen stivhet på cellevekst og overlevelse.
Ved hjelp av denne analysen vi har undersøkt et panel av kreftcellelinjer med det mål å bestemme hvordan endringer i de mekaniske egenskapene til matriksen påvirker celleproliferasjon. Ni av de kreftcellelinjer viste en avhengighet matrise stivhet for vekst, økende betydelig bedre på stive /stive matriser for på mindre stive /myke matriser. Stivhet uavhengig cellelinjer viste nesten ingen endringer i vekstraten over området av matrix stivhet brukes på platene. Bemerkelsesverdig, alle kreftcellelinjer som ble undersøkt i dette studiet var i stand til prolifererende på myke underlag, mens normale fibroblaster, glatte muskler og epitelceller oppviser en streng avhengighet av matrise stivhet for vekst [25]. Dette gjenspeiler antagelig «onkogene» transformasjon av kreft cellelinjer i forhold til normale celler, hendelser som gjenspeiler flere mutasjoner som karakteriserer kreftceller. Det er uklart på dette tidspunktet om stivhet profilen til en kreftcellelinjer gjenspeiler en eller flere spesifikke mutasjoner som er ervervet av en person cellelinje.
Det er interessant at cellelinjer som viste stivhet avhengig vekst også viste stivhet avhengige spredning og migrasjon. Våre resultater parallell analyse av en serie av glioma cellelinjer som har forplantet seg på fibronektin-belagte polymere substrater med definert mekanisk stivhet [26]. På svært stive underlag ( 100 kPa) de glioma celler spredt mye, dannet fremtredende stresset fiber og modne fokale sammenvoksninger, og flyttet raskt. Men når dyrket på mindre stive matriser (verdier sammenlignes med normalt hjernevev), dukket de glioma cellene avrundet og ikke klarte å produktivt migrere, ligner på stivhet avhengige cellelinjer som er beskrevet i våre studier. Interessant nok var gliom cellemotilitet på høyt kompatible underlag reddet av farmakologisk hemming av actinomyosin baserte kontraktilitet, noe som tyder på at actinomyosin kontraktilitet kan være en kritisk komponent i mechanosensory apparat. Andre studier har implisert FAK, ERK, og den lille GTPase Rho i regulering av vekst som respons på stivhet [16], eller en økning i cyklin D-nivåer nedstrøms av Rac-aktivering [25]. Rho GTPases og deres nedstrøms mål, som er kritiske formidlere av celle spredning, migrasjon og kontraktilitet [27], kan fungere som mechanosensory maskiner som reagerer på stivhet av mikromiljøet. For eksempel er Rho og dens effektor Rho-kinase (ROCK) som er involvert i en tilbakekoblingssløyfe som regulerer tubulogenesis i normale epitelceller når de blir dyrket i mykt tre-dimensjonale kollagen-matriser [28]. Når celler dyrkes i mer rigide, matriser med høy tetthet, induserer denne tilbakekoblingssløyfe fosforylering av FAK og ERK, noe som resulterer i økning i ekspresjon av gener assosiert med proliferasjon, antagelig ved FAK-avhengige Ras-aktivering [20]. Selv om disse forsøk klart implisere Rho banen i mechanotransduction i normale epitelceller, blir videre eksperimenter kreves for å bestemme effektene av kontraktilitet og Rho GTPase aktivitet på kreftcellevekst på myke underlag, særlig i cancercellelinjer som rommer mutasjoner i Ras-reaksjonsveien.
Som vist i dette dokumentet, påvirker ekstracellulære stivhet veksten av visse kreftcellelinjer, og muligheten for en cellelinje til å vokse på et mykt underlag
in vitro
kan forutsi dets evne til å vokse i en myk miljø
in vivo
. I tillegg er en cellelinje som respons på ekstracellulære stivhet
in vitro
kan forutsi dets reaksjon på desmoplastic responsen
in vivo
, dvs. om det er en økning i stivhet av mikromiljøet
in vivo
vil favorisere veksten av tumorcellene. En cellelinje myke-plate vekstprofil kan også forutsi dens følsomhet for medisiner i bløtvev. For eksempel har DNA-kryssbinder mitomycin C blitt vist å hemme proliferasjon av stamceller mer effektivt på stive sammenlignet med myke substrater [29]. I tillegg bukspyttkjertelkreft cellelinjer som uttrykker epitelceller markører som E-cadherin og lavere nivåer av mesenchymale markør vimentin er mer lydhør overfor erlotinib behandling [30], [31]. Derfor, hvis en cellelinje (for eksempel A549) skulle bli mer epitel-lignende når de dyrkes i en myk miljø, ville det bli forutsagt til å være mer følsomme for erlotinib. Videre studere både
in vitro Hotell og
in vivo
vil være nødvendig for å utforske den prediktive kapasiteten på soft-plate analysen i å bestemme kreft celle responser til
in vivo
bløtvev miljøer og terapeutisk potens i slike miljøer.
Cellular plastisitet, eller evnen til overgangen frem og tilbake mellom en fastsittende epitelial celle og en vandrende mesenchymale celle, er en godt studert fenomen som er kritisk for en rekke fysiologiske prosesser, inkludert embryonisk utvikling, sårheling, kreft og progresjon. Et fellestrekk til EMT er en nedregulering av celle-celle adhesjon, først og fremst gjennom hemming av E-cadherin uttrykk, og oppkjøpet av en motile fenotype sammen med økt uttrykk av visse infrastrukturkomponenter som vimentin. Imidlertid kan denne overgangen ikke alltid være komplett, så det er mange eksempler på celler som gjennomgår en «delvis» EMT der cellene blir motile ved forbigående å anskaffe noen, men ikke alle av mesenchymale celleegenskaper [32]. Dette tyder på at celler gjennomgå EMT i et komplekst og trinnvis måte, og ikke alle EMT hendelser er nødvendig for å oppnå en trekkfugl fenotype.
