Abstract
I tillegg til genetiske endringer, er forekomsten av epigenetiske forandringer forbundet med opphopning av både genetiske og epigenetiske hendelser som fremmer utvikling og progresjon av kreft hos mennesker. Tidligere rapporterte vi et sett av kandidat gener som utgjør en del av den nye «kreft methylome». I denne studien, må vi først testet 23 kandidatgener for arrangøren metylering i et lite antall primær kolon tumorvev og kontroller. Basert på disse resultatene, vi deretter undersøkt metylering hyppigheten av
Oncostatin M reseptor-β product: (
OSMR
) i et større antall av vev og avføring DNA-prøver fra tykktarm kreft pasienter og kontroller. Vi fant at
OSMR
ofte ble metylert i primær kolonkreft vev (80%, 80/100), men ikke i normalt vev (4%, 4/100). Metylering av
OSMR
ble også påvist i avføring DNA fra pasienter med kolorektal kreft (38%, 26/69) (cut-off i TaqMan-MSP, 4). Påvisning av andre denaturert markører i avføringen DNA forbedret følsomhet med liten effekt på spesifisitet. Arrangøren metylering mediert stanse av
OSMR
i cellelinjer, og CRC celler med lav
OSMR
uttrykk var resistente mot veksthemming av Oncostatin M. Våre data gir en biologisk begrunnelse for å stanse all
OSMR
i tykktarm kreft progresjon og markere en ny terapeutisk mål i denne sykdommen. Videre påvisning og kvantifisering av
OSMR
promoter metylering i avføring DNA er en svært spesifikk diagnostisk biomarkør for CRC
Citation. Kim MS, Louwagie J, Carvalho B, Terhaar sive Droste JS, Park HL, Chae YK, et al. (2009) Arrangøren DNA metylering av
Oncostatin M reseptor-ß
som Novel diagnostiske og terapeutiske Marker i Colon Cancer. PLoS ONE 4 (8): e6555. doi: 10,1371 /journal.pone.0006555
Redaktør: Jonathan Weitzman, Université Paris-Diderot, Paris 7, Frankrike
mottatt: 6 februar 2009; Godkjent: 30 juni 2009; Publisert: 07.08.2009
Copyright: © 2009 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Cancer Institute (U01-CA84986) og Oncomethylome Sciences, SA, og nederlandsk Cancer Society (prosjektnummer RUG 2004-3161). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Under en lisensavtale mellom OncoMethylome Sciences, SA og Johns Hopkins University, Dr. Sidransky har rett til en andel av royalty mottatt av universitetet på salg av produkter som er beskrevet i denne artikkelen. Dr. Sidransky eier OncoMethylome Sciences, SA lager, som er underlagt visse restriksjoner under Universitetet politikk. Dr. Sidransky er en betalt konsulent for OncoMethylome Sciences, SA og er en betalt medlem av selskapets Scientific Advisory Board. Varigheten av denne ordningen blir administrert av Johns Hopkins University i samsvar med sin konflikt av interesse politikk.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er en av de vanligste kreftformene blant menn og kvinner og står for 10% av alle nye krefttilfeller og kreftdødsfall hvert år [1]. Den samlede fem års overlevelse fra tykktarmskreft har økt i løpet av de siste 20 årene på grunn av tidlig oppdagelse av økt screening. Til tross for mye fremgang, er mer avansert kunnskap om molekylære patogenesen av CRC eller sentrale miljø /kostholdsfaktorer i CRC utvikling fortsatt nødvendig. Videre vil finne potensielle diagnostiske markører og terapeutiske mål for CRC hjelpe til tidlig oppdagelse og behandling av tykktarmskreft. De fleste CRC oppstår fra adenomatøse forløpere, og akkumulering av forsterkning-av-funksjon mutasjoner i proto-onkogener og tap-av-funksjon mutasjoner i tumorsuppressorgener (TSGs) fører til progresjon av adenomatøse lesjoner til karsinom [2], [3], [4].
i tillegg til genetiske endringer som involverer mutasjoner av onkogener og TSGs, kreftfremkallende progresjon fra godartet svulst til adenokarsinom kan skje gjennom epigenetiske forandringer i genet arrangører [5]. Avvikende genuttrykk er karakteristisk for kreft hos mennesker, og endringer i DNA metylering status kan ha dyptgripende virkninger på uttrykket av gener. TSGs skjerm både genetisk og epigenetisk inaktivering i humane svulster, og transkripsjons stanse av TSGs har etablert hypermethylation som en felles mekanisme for tap av TSG funksjon i humane kreftformer [6] inkludert tykktarmskreft [7], [8]. Dermed kan kunnskap om metylering mønstre over hele genomet bidra til å identifisere viktige TSGs inaktivert under svulstdannelse [9], [10], [11].
Tidligere rapporterte vi et sett av kandidat gener som utgjør en del av den nye «kreft methylome» ved hjelp av en ny promoter struktur algoritme og microarray data generert fra 22 kreftcellelinjer avledet skjema 5 store krefttyper [12]. I denne tidligere studie undersøkte vi nylig identifiserte kreftspesifikke metylerte gener i et panel av 300 primære tumorer som representerer 13 typer kreft. Basert på data, ble antallet kjente kreftspesifikke denaturert gener økt med ca 40%.
I denne studien, vi re-undersøkt metylering status av kreftspesifikke denaturert gener i et større antall vev og avføring DNA fra tykktarmskreftpasienter samt pasienter uten kreft. Vi fant ut at
Oncostatin M reseptor-β product: (
OSMR
) og
β-1,4-galactosyltransferase-en product: (
B4GALT
) var svært metylert i primær CRC vev, men sjelden i tilsvarende normal tilstøtende slimhinne eller i ikke-maligne normale kolon vev. Metylering av disse genene ble også påvist i avføring DNA fra tykktarmskreftpasienter, men vanligvis fraværende fra ikke-kreftpasienter. Videre
OSMR Hotell og
B4GALT
mRNA uttrykk i tykktarm kreft vev var signifikant nedregulert i forhold til normalt vev. Funksjonelle studier viste en undertrykkende rolle for
OSMR
i tykktarm kreft progresjon. Derfor
OSMR
metylering er biologisk relevant og kan ofte påvises i primær CRC svulster og matchet krakk DNA.
Resultater
Microarray analyse i tre menneskelige tykktarmskreft cellelinjer ( HCT116, HT-29 og DLD1) identifisert 52 potensielle gener som er basert på reaktivering etter behandling med 5-aza-dC [12]. Av disse 52 genene,
Sirtuin to plakater (
SIRT2
) ble regnet to ganger i vår kandidat genet liste fordi den har to forskjellige gen identifikasjonsnumre (NM_012237 og NM_030593) i NCBI databasen. I tillegg
O6-metylguanin-DNA metyltransferase product: (
MGMT
) ble tidligere rapportert til havn kreft-promoter metylering i flere typer kreft, inkludert tykktarmskreft [9], så vi ekskludert
MGMT
fra vår videre analyse (52 -2 = 50).
Utskilt frizzled relatert protein 4 product: (
SFRP4
) ble tidligere rapportert å være metylert i tykktarmskreft [16], [17] og ble inkludert som en positiv kontroll for genet metylering i vår studie.
Neurotrophin tyrosin kinase reseptor type 2 plakater (
NTRK2
) og
urokinase plasminogen aktivator product: (
Plau
) ble også tatt med fordi ingen rapporter om metylering av de to genene i tykktarmskreft har blitt publisert ennå. Vi dermed undersøkte metylering status av totalt 50 gener ved sulfitt-sekvensering eller C-MSP i tykktarmskreft cellelinjer (HCT116, DLD1, RKO, og SW480) (figur S1). Som et resultat, har vi funnet 23 gener som skal metyleres i mer enn en cellelinje (tabell 1). Metylering i de andre 27 gener ble ikke påvist i noen av cellelinjene som ble testet.
For å identifisere gener som bærer kreftspesifikk promoter metylering, vi undersøkte metylering status for de 23 genene i fem til ti par av matchet primære CRC (PT) og tilsvar normal kolon (PN) vev. Normale tykktarmsslimhinnen vev fra ikke-kreftpasienter (NN) ble også inkludert for å sammenligne metylering spesifisitet mellom kreft og ikke-kreftpasienter. Vi ekskluderte gener som næret metylering i NN med frekvenser høyere enn 30%. Som et resultat, har vi funnet at
3′-phosphoadenosine 5′-phosphosulfate syntase to plakater (
PAPSS2
),
γ-tubulin genet to plakater (
TUBG2
),
NTRK2
,
B4GALT1
, og
OSMR
samt
SFRP4
næret kreftspesifikke metylering med høye frekvenser ( 30 %) (tabell 2). Alle seks av disse genene ikke havna metylering i alt NN testet, og forskjeller i NN
vs.
PT og metylering
vs.
Unmethylation tilfellene var statistisk signifikant. Representative resultater fra C-MSP, bisulfitt-sekvensering, og Cobra i cellelinjer og vev er vist i figur 1A og fig S2.
A, Metylering status for hvert gen ble undersøkt i CRC-cellelinjer og vev ved C- -MSP etter PCR med metylering spesifikke primere. PCR-produkter ble kjørt på 4% agarosegeler pre-farget med etidiumbromid.
In vitro
metylert, bisulfitt behandlet humant normalt lymfocytt-DNA (NL) ble anvendt som en positiv kontroll for PCR, og destillert vann (DW) ble anvendt som en negativ kontroll PCR.
β-actin
ble benyttet for å bekrefte integriteten av DNA.
SLC39A4 Hotell og
SLC9A3R1
ble metylert både i cellelinjer og vev, men
GANAB
,
Plau Hotell og
UBE3A
ikke var . De andre 5 gener ble metylert i en av tre cellelinjer ble testet, og bare metylert i CRC-vev (PT). PN, sammen normale kolon vev fra kolon kreftpasienter; PT, sammen CRC; NN, normal tykktarm epitel fra ikke-kreftpasienter. C-MSP resultatene av
OSMR
i CRC cellelinjer og vev ble vist i en tidligere rapport [12]. B, Scatter plott av metylering verdier av seks kandidat gener i vev og cellelinjer (CL). Den samlede metylering verdier (TaqMan metylering verdier, TaqMeth V) og den optimale spesifisitet /sensitivitet på optimalt cut-offs beregnet fra ROC analyse er vist i Tabell 3. Pilene viser de optimale cut-off verdier for hvert gen. Ingen tilfeller av NN vises TaqMeth V i løpet av de optimale cut-offs for
B4GALT1 Hotell og
OSMR
. HEK293, et ikke-tumorigen cellelinje, næret et høyt nivå av
B4GALT1
metylering (TaqMeth V, 101,12), men
OSMR
metylering ble ikke påvist i cellelinjen (TaqMeth V, 0,00 ). *, Prøver med en ratio lik null kan ikke bli plottet riktig på en log skala, så blir presentert her som 0,1. Alle analyser ble utført i duplikat format, og forsøkene ble gjentatt to ganger. Dataene viste reproduserbare og samstemmige resulterer i tre eksemplarer. TaqMeth V er beskrevet i Materialer og Metoder. C, Kvantitative metylering nivåer av
B4GALT1 Hotell og
OSMR
i grunnskolen kolon vev. Spredningsplott av
B4GALT1 Hotell og
OSMR
promoter metylering. Pilene angir optimale cut-off verdier for hvert gen (3,877 til
B4GALT1 Hotell og 22,01 for
OSMR
).
For å studere arrangøren metylering av disse 6 gener ved TaqMan-MSP sanntidsanalyse, har vi designet primere og prober spesielt rettet mot CPG øyene hvert gen (figur S3). Vi økte prøvenumrene til over 25 par av primær CRC (PT) og tilsvar normal kolon (PN) vev, og til 13 normale tykktarmsslimhinnen vev fra ikke-kreftpasienter (NN). Fordelingen av metylering verdier for hvert gen er vist i figur 1B. På grunn av heterogene klonale plaster som er kjent for å ekspandere utover tumor grenser, ble et lavt nivå av metylering i PN også ofte observert. Den samlede metylering verdier (TaqMan metylering verdier, TaqMeth V) er vist i tabell 3.
B4GALT1 Hotell og
OSMR
næret høyere nivåer av generelle metylering i PT enn de i PN og NN, og forskjellene var signifikante for begge gener mellom PT og PN (
P 0,001
) og mellom PT og NN (
P 0,001
). Når metylering verdier ble sammenlignet innenfor enkelte par PN og PT prøver, betydelig høyere metylering nivåer av
PAPSS2 TUBG2
,
NTRK2
, og
SFRP4
ble funnet i 60% ( 18/30) 50% (15/30) 30% (9/30) og 36% (11/30), henholdsvis i PN enn i tilsvarende tumorprøver (PT). Høyere metylering nivåer av
B4GALT1
i PN prøvene ble funnet bare i 4 tilfeller (13,3%, 4/30), og metylering av
OSMR
ble ikke funnet i noen av de sammenkoblede normale (0 %, 0/25).
metylering av de 6 gener i vev viste svært diskriminerende mottaker-operatør karakteristiske (ROC) kurve profiler, klart skille CRC (PT) fra normal tykktarmsslimhinnen (NN) (
P 0,001
) (figur S4A). AUROC (Areal under ROC) var over 0,76 i alle gener testet. For å maksimere sensitivitet og spesifisitet, ble de optimale cut-offs for de 6 gener beregnet fra ROC-analyse (PT
vs
. NN) og er vist i tabell 3. I cut-offs satt for optimal spesifisitet på 90% eller mer, følsomheten av hvert gen i PT var over 70%. Ingen tilfeller av NN vises TaqMeth V i løpet av de optimale cut-offs for
B4GALT1 Hotell og
OSMR plakater (100% spesifisitet). Følsomheten til
B4GALT1 Hotell og
OSMR
var 83% (25/30) og henholdsvis 80% (20/25),. Disse resultatene indikerer at
B4GALT1 Hotell og
OSMR
havn kreftspesifikke metylering i CRC med høy frekvens. Derfor fokuserte vi på
B4GALT1 Hotell og
OSMR
for videre studier.
Vi undersøkte metylering status for
B4GALT1 Hotell og
OSMR
i 100 nye par av CRC (PT) og tilhørende normale (PN) vev ved TaqMan-MSP-analyse (fig. 1C). Den TaqMeth V i PT varierte 0 til 370,70 (medianverdien 3,70) for
B4GALT1 Hotell og 0 til 749,27 (median verdi 59,24) for
OSMR
. Verdien i PN gikk fra 0 til 9,70 (median verdi 0,26) for
B4GALT1
og til 190,68 (medianverdien 1,54) for
OSMR
. De samlede metylering nivåer av
B4GALT1 Hotell og
OSMR
oppdaget i PT (22,33 ± 48,69 for
B4GALT1 Hotell og 116,83 ± 151,52 for
OSMR
, gjennomsnitt ± SD, n = 100) var også betydelig høyere enn i PN (0,90 ± 1,37 for
B4GALT1 Hotell og 6,49 ± 21,52 for
OSMR
, gjennomsnitt ± SD, n = 100) (
P 0,001
). Ved optimale cut-offs (verdier, 3,87 for
B4GALT1 Hotell og 22,01 for
OSMR
) regnet fra ROC analyse (PT
vs
. PN) (figur S4B) , spesifisiteten av de to genene var over 96%. Følsomheten til
B4GALT1 Hotell og
OSMR
var 49% (49/100) og henholdsvis 80% (80/100),. Til sammen
B4GALT1 Hotell og
OSMR
ofte ble metylert i primær CRC vev men vises fraværende eller lave nivåer av metylering i tilsvarende normale vev.
Deretter utførte vi en blindet analyse av genet metylering analyse i avføring DNA oppsamlet fra pasienter med eller uten tykktarmskreft. Den kliniske status av pasientene var ikke åpenbart inntil analysen ble utført. Vi har også undersøkt hypermethylation av
SFRP1
som en positiv kontroll for påvisning av genet metylering i avføring DNA [18]. Resultatene av ROC-analyse i avføringen DNA er vist i Figur 2. Tabell 4 viser sensitiviteten /spesifisiteten av hvert gen for tykktarmskreft påvist i avføring DNA-prøver.
SFRP1
metylering ble ikke påvist hos pasienter med endoskopisk normal kolon (0%, 0/15), og ble funnet hos 55% (11/20) av CRC pasienter på optimal cut-off verdi beregnet ut fra ROC-analyse. Metylering av
B4GALT1 Hotell og
OSMR
ble påvist i 64% (9/14) og 80% (16/20) av avførings DNA-prøver fra CRC pasienter. Når metylering av
SFRP1 Hotell og
OSMR
ble kombinert, var sensitiviteten 60% (12/20), og spesifisiteten var 100% (0/15). Diskriminering mellom pasienter uten kreft og CRC pasienter ved
SFRP1
eller
OSMR
metylering var statistisk signifikant (
P 0,01
).
En blindet testen var utført for genet metylering analyse i avføring DNA oppsamlet fra pasienter med eller uten tykktarmskreft.
SFRP1
ble tatt med for å sammenligne metylering frekvens av en kjent kreftspesifikk denaturert genet. Sensitivitet /spesifisitet basert på optimale cut-offs beregnet fra ROC analyse er vist i Tabell 4.
OSMR
metylering ble testet blindt i en mer uavhengig sett av avføringsprøver (ingen overlapping med prøvene i tabell 4). Krakk DNA fra friske kontrollpersoner som ikke hadde noen visuelle abnormalties i koloskopi ble inkludert i denne studien. Sensitiviteten av
OSMR
metylering i CRC-pasienter var 38% (26/69) og spesifisiteten var 95% (77/81) (tabell 5). Forskjellen mellom CRC pasienter og friske kontrollpersoner var statistisk meget signifikant (
P 0,001
). I tillegg
OSMR
metylering ble påvist i 56% (15/27) og 44% prøver (8/18) krakk DNA fra CRC stadium II og III pasienter, henholdsvis. Videre 34 av 41 tilfeller (83%) av avføring DNA fra konfunderende kontrollpasienter uten CRC var helt negative for
OSMR
metylering. Andre kliniske parametre i konfunderende kontroller som diverticulosis, hemorrhoid, og polypper ble ikke signifikant assosiert med
OSMR
metylering status i avføring (data ikke vist).
For å undersøke transkripsjonsnivå av
B4GALT1 Hotell og
OSMR
, vi utførte RT-PCR eller real-time RT-PCR-analyse (fig. 3) med cDNA fremstilt fra CRC cellelinjer (HCT116, HT29, DLD-1 , RKO, og SW480) og en ikke-tumorigen cellelinje, HEK293.
OSMR
uttrykk ble kun observert i cellene hvor metylering av
OSMR
ble ikke funnet (HCT116 og HEK293). Økning av
OSMR
uttrykk med 5-aza-dC behandling ble tidligere rapportert [12], noe som indikerer at uttrykk for
OSMR
korrelerer tett med arrangøren metylering. Basal ekspresjon av
B4GALT1
ble påvist i alle cellelinjene som ble testet, og alle disse cellelinjer også næret metylering av
B4GALT1
. Men
B4GALT1
ble ytterligere økt med 5-Aza-DC (figur s5a), noe som indikerer at dens uttrykk var minst delvis undertrykt av arrangøren metylering.
A, Uttrykk for
B4GALT1 Hotell og
OSMR
i cellelinjer ble undersøkt ved RT-PCR-analyse. Metylering av
B4GALT1
i cellelinjene ble undersøkt av C-MSP eller TaqMan-MSP. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. M, metylering; U, unmethylation. B og C, ble Real-time RT-PCR utføres i fem par (a – e) normal (PN) og tumor cDNA fremstilt fra CRC pasienter (PT) (
forlot
). Uttrykk for
B4GALT1 product: (B) og
OSMR product: (C) ble også sammenlignet mellom pasienter med tykktarmskreft (T) eller uten kreft (NN) (
midt
). Relativ uttrykk (Fold) ble beregnet ved å sammenligne forholdene av mRNA uttrykk for
B4GALT1 Hotell og
OSMR
til en intern kontroll genet, GAPDH. Forsøkene ble gjort i to eksemplarer, og verdier indikerer gjennomsnitt ± SD. *,
P 0,05
. Forsøkene ble gjort i to eksemplarer, og verdier indikerer gjennomsnitt ± SD. *,
P . 0,05
Vi deretter utført Real-time RT-PCR i cDNA forberedt fra tumor (PT) og tilsvar normalt vev (PN) av fem individuelle tykktarmskreft pasienter (matchet cDNA). I tre av fem kreft tilfeller,
OSMR
var signifikant nedregulert (Fig. 3C,
forlot
). Uttrykket av
B4GALT1 Hotell og
OSMR
i svulsten var tre og fire ganger lavere enn i normalt vev (NN), henholdsvis (Fig. 3B og C,
høyre
) . Ved immunhistokjemisk farging av et kolon normal og kreftvev mikromatrise med et anti-OSMR antistoff, vi har oppdaget sterk ekspresjon av
OSMR
i alle ikke-maligne normale vev (NN) og tilstøtende normal tykktarmsslimhinne (PN) fra tykktarm kreftpasienter (fig. 4 og tabell 6). Men
OSMR
ble knapt påvist i nesten alle primære tumorer (PT) (svakt uttrykk i 4 av 10 tilfeller). Disse resultatene tyder på en bestemt nedgang på
OSMR
mRNA og protein i tykktarm kreft utvikling.
Sterk uttrykk for
OSMR
ble påvist i alle ikke-maligne normalt vev (NN) og tilstøtende normalt tykktarmsslimhinnen (PN). I kontrast,
OSMR
sjelden ble påvist i de neoplastiske celler fra kolon kreftpasienter. Tumor karakterene er angitt.
For å undersøke hvilken rolle DNA metylering i reguleringen av
OSMR
uttrykk, vi tilført en pGL3-
OSMR
-Pro2 -Luciferase bygge i tre cellelinjer; en
OSMR
-negativ cellelinje, SW480, og to
OSMR
-positive cellelinjer, HCT116 og HEK293. Konstruksjonen ble behandlet med eller uten
Sss
jeg metylase før transfeksjon. Aktiviteten av
OSMR
promoteren ble ikke påvist i SW480, men et høyt nivå av promoter-aktivitet ble påvist i HCT116 og HEK293-celler (fig. 5A). Induksjon av CpG metylering med
Sss
jeg metylase redusert aktiviteten til minimalt nivå.
En analyse av
OSMR
promoter aktivitet ved luciferase reporter analysen i OSMR-positive (HCT116 og HEK293) og – negative (SW480) celler. Promotoren konstruksjonen ble forbehandlet med eller uten
Sss
I metylase for 8 timer før transfeksjon. Den høyeste aktivitet ble påvist i HEK293-celler. Data er uttrykt som gangers økning i forhold til pGL3-basis aktivitet. Forsøkene ble gjort i tre eksemplarer, og verdier indikerer gjennomsnitt ± SD. Middelverdier er presentert. B, An siRNA basseng målretting
OSMR
og ikke-måls kontroll ble transient transfektert i HCT116, og cellene ble behandlet med rhOSM (50 ng /ml) (
forlot
). HCT116 cellene ble behandlet med eller uten Stat3 inhibitor peptid (Stat3 Inh, 100 mm) opptrer som en svært selektiv, potent blokkering av Stat3 aktivering (
midt
). Cellevekst ble bestemt ved MTT-analyse. Data er uttrykt som absorbans ved 570 nm. Forsøkene ble gjort i tre eksemplarer, og verdier indikerer gjennomsnitt ± SD.
*, P 0,05
. C, 5-Aza-dC (5 pM) ble forbehandlet i 48 timer i SW480 og DLD-1-celler, og deretter ko-behandlet med rhOSM i 48 timer. Cellevekst ble bestemt ved MTT-analyse. *, 5-Aza-DC-behandlede celler sammenlignet med ubehandlet kontroll (
P 0,05
); # 5-Aza-dC /rhOSM- behandlede celler sammenlignet med 5-Aza-dC behandling alene (
P 0,05
). D, Fosforyleringen av
Stat3
og
Erk
i respons til rhOSM (50 ng /ml) ble analysert ved Western blotting i HCT116 og SW480 cellelinjer. rhOSM økt fosforylert
Stat3 Hotell og
Erk
i HCT116-celler, men ikke i SW480 celler (som mangler LIFR-se E nedenfor). Lik protein lasting ble overvåket av totalt
Stat3
,
Erk Hotell og
β-aktin evaluering
i prøvene. Re-aktivering av
OSMR
av 5-Aza-dC behandling ble bestemt på SW480 og DLD-1 celler ved flowcytometri (figur S6). E. Uttrykk for
LIFR Hotell og
gp130
ble undersøkt i CRC cellelinjer ved RT-PCR.
LIFR
ble uttrykt i HCT116 cellene, men stilnet i de fleste andre CRC cellelinjer som ble testet.
gp130
,
OSMR
heterodimer ble allestedsnærværende uttrykt i alle cellelinjene som ble testet. Promotoren metylering statusen til disse to sistnevnte genene ble ikke undersøkt.
Oncostatin M (OSM) er en interleukin-6 (IL-6) -type cytokin, men mer aktiv enn IL-6 ved inhibering av spredning av en rekke faste tumorcellelinjer [19], [20]. Nylig har en korrelasjon på motstand mot veksthemming av OSM med spesifikke tap av
OSMR Hotell og Stat3 signale ble rapportert [15]. For å undersøke celle CRC resistens overfor vekstinhibering av OSM, vi transient transfektert et siRNA basseng målretting OSMR og en ikke-målsøkende kontroll siRNA inn i
OSMR
-expressing HCT116-celler, og utførte en standard cellevekstanalyse etter behandlingen av celler med et rekombinant humant OSM (rhOSM). Vi observerte en betydelig vekst hemming rhOSM i HCT116 cellene, og hemming ble reversert av knock-down av
OSMR plakater (Fig. 5B, til venstre). En Stat3 inhibitor peptid (Stat3 Inh) som avskaffet Stat3 aktivering (fig. 5D) blokkerte rhOSM-indusert veksthemming i HCT116-celler (fig. 5B, høyre). Konsekvent, undertrykkelse av cellevekst ved rhOSM ble ikke observert i SW480 og DLD-1 celler med
OSMR
promoter metylering (Fig. 5C). Interessant, inhibering av cellevekst ved 5-Aza-dC behandling i SW480 og DLD-1-celler (*,
P 0,05
) ble betydelig forbedret ved behandling av rhOSM (#
P 0,05
). Til slutt så vi at rhOSM aktivert Stat3 fosforylering i HCT116 cellene, uavhengig OSMR uttrykk nivåer (Fig. 5D, venstre). Ekspresjon av
gp130
og
LIFR
mRNA ble observert i HCT116-celler (fig. 5E), noe som indikerer at aktiveringen av Stat3 i HCT116-celler med meget lav OSMR ekspresjon forårsaket av siRNA transfeksjon kan være via gp130 /LIFR (type I OSM reseptor) -mediert signale. Erk fosforylering økt i HCT116-celler transfektert med siRNA målretting
OSMR
, og basalnivået fosfo-ERK i SW480 celler med
OSMR
metylering var høyere enn i HCT116-celler (fig. 5D). 5-Aza-dC partielt redusert aktivert Erk i SW480-celler, og rhOSM utvinnes basal Erk phopshorylation i nærvær av 5-Aza-dC. Dermed metylert
OSMR
markant redusert svulsthemmende signaler fra rhOSM og viktige nedstrøms signal hendelser.
Diskusjoner
Arrangøren metylering av viktige regulatoriske gener styrer kreftprosessen og i riktig sammenheng kan tjene som en diagnostisk markør og et terapeutisk mål. Kreft-spesifikke metylering fungerer som en viktig biomarkør for tidlig deteksjon av kreft. Slike markører kan supplere cytopathological vurdering av vev biopsi eller potensielt stå på sine egne som markører for sykdom i ulike kroppsvæsker som avføring. For dette formål, metylering frekvensen av gener identifisert i primær vev har viktige kliniske implikasjoner.
En rekke gener er ofte hypermethylated i tykk- og endetarmskreft (CRC) inkludert
hMLH1
,
p16INK4a
,
p14ARF
,
RAR-β
,
APC
,
MGMT
,
cyclin A1
,
CDX1
,
MYOD1
,
COX-2 Hotell og
WT-1 product: [21], [22], [23]. Men gener metylert bare i neoplastiske vev med høy frekvens (over 40%) er sjeldne. I denne studien identifiserte vi
PAPSS2
,
TUBG2
,
NTRK2
,
B4GALT1 Hotell og
OSMR product: [12], [ ,,,0],24] som gener som bærer kreftspesifikk promoter metylering i menneskelig tykktarmskreft. Den teoretiske følsomheten for hver metylert gen var over 70%, og det som særpreger var over 90% av TaqMan-MSP. Metyleringen Frekvensen av hvert gen rekker med bare noen få andre gener metylert ved høy frekvens i CRC (
syklin A1, CDX1, RAR-β, MYOD1, p15INK4b og COX-2
) i en cancer-spesifikk måte [ ,,,0],10].
studier på
B4GALT1 Hotell og
OSMR
har blitt rapportert i human kreft.
B4GALT1
er lokalisert både i Golgi-komplekset og på celleoverflaten [25], og er konstitutivt uttrykt i alle vev, inkludert human kolorektal mukosa [26] med unntak av hjernen [27]. Rollen til celleoverflaten
B4GALT1
i human kreft har blitt rapportert; Det er en østrogen-regulert gen i MCF-7-celler [28], og dens nivå er blitt endret i høyt metastatiske lungekreftceller sammenlignet med sine mindre metastatiske parentale celler [29].
B4GALT1
fremmer apoptose ved å hemme den epidermale vekstfaktor-reseptor pathway [30] og øker cykloheksimid-indusert apoptose i humane hepatokarsinom celler [31]. Protein kinase B /Akt hemmer apoptose etter nedregulering av
B4GALT1 product: [25]. I tillegg ble forbedret epitelcelleproliferasjon av huden og tynntarmen og unormal differensiering i tarmtottene funnet i
B4GALT1
-deficient mus [32], noe som tyder på at
B4GALT1
spiller en viktig og undertrykkende rolle i spredning av epitelceller. Således kan dens inaktivering av promoter metylering føre til rømning av normale cellulære kontroller og progresjon av kreft.
OSMR er en reseptor av Oncostatin M (OSM), en interleukin-6 (IL-6) -type cytokin identifisert en potent suppressor av tumorceller. Menneskelig OSM ble opprinnelig beskrevet av sin evne til å hemme melanom spredning in vitro [33], [34], og dets mål for veksthemming inkluderer lungekarsinom [35], ovariekarsinomer [36], og brystsvulster [37]. Resistens overfor vekstinhibering av OSM på metastatiske melanomcellelinjer korrelerte med et bestemt tap av OSMR, i forbindelse med et lavere nivå av histon acetylering i OSMR promoter-regionen, noe som tyder på at metastatiske melanomceller kunne unnslippe vekstkontroll av OSM ved epigenetisk stanse av OSMR [15]. Vi har oppdaget at promoteren metylering sterkt korrelerer med OSMR ekspresjon og også funnet en korrelasjon av resistens overfor vekstinhibering av OSM med tap av OSMR i CRC-cellelinjer. Således er promoter metylering en nøkkel regulator av OSMR ekspresjon og alle disse resultatene understøtter en undertrykkende funksjon for OSMR i human cancer
Humant OSM danner to typer av heterodimere signaliseringskomplekser.; gp130 /leukemi-inhiberende faktor (LIFR) (type I OSM-reseptor-komplekset) [39] og gp130 /OSMR (type II-reseptor-komplekset OSM) [40]. gp130 /LIFR kan aktiveres av LIF eller OSM, men gp130 /OSMR aktiveres av OSM bare. Den type II reseptor-komplekset aktiverer OSM-spesifikke signalveier via JNK /SAPK og STAT1 /Stat5 trasé, mens både type I og type II komplekser aktivere Stat3 og Erk som felles signalveier i brystkreftceller [41]. I tillegg kan type I og type II-reseptorsignalisering utviser antagonistiske funksjoner [42]. Vi fant at OSM-formidlet hemming av cellevekst ikke ble observert i HCT116-celler med lav OSMR nivå til tross for Stat-3-fosforylering. Siden HCT116-celler uttrykte gp130 og LIFR, rhOSM fosforylerer sannsynlig Stat3 gjennom type I OSM-reseptor-mediert signalisering, men i fravær av gp130 /OSMR denne virkning er ikke tilstrekkelig for å mediere vedvarende veksthemming [41]. Til støtte for denne oppfatningen, gjorde rhOSM ikke øke Stat3 fosforylering i SW480 celler som mangler LIFR uttrykk
Fra et klinisk synspunkt, våre resultater har potensial umiddelbare diagnostiske og terapeutiske implikasjoner og fortjener ytterligere oppmerksomhet. I en blindet test utført i avføring DNA fra CRC pasienter,
B4GALT1 Hotell og
OSMR
metylering ble vellykket registrert med høy frekvens, og dermed ha potensial for å identifisere personer med tykktarmskreft. Når vi testet en ytterligere kjent denaturert gen,
SFRP1 product: [18], i kombinasjon med
OSMR
sensitiviteten til analysen økes; 60% (12/20) av tykktarm kreft ble oppdaget i avføring DNA med perfekt spesifisitet (
P 0,001
). Disse data tyder på at arrangøren metylering av
OSMR
kan tjene som en sann indikator for tilstedeværelse av tykktarmskreft.
Terapeutisk, både gener gi fristledetråder for nye tilnærminger i behandling av CRC. Primersekvensene er vist i tabell S1.
