Abstract
Aberrant epidermal vekstfaktor (EGF) signalering er assosiert med tumorvekst i plateepitelkarsinom i hode og hals hos mennesker (HNSCC), og er et stort fokus på målrettet terapi. Cetuximab, et monoklonalt antistoff mot EGFR, har vært vellykket på å forlenge overlevelse, men har bare en 10% reduksjon av svulster Svarprosenten i en klinisk setting. Målet med denne studien var å sammenligne dacomitinib (PF-00299804), en neste generasjons lite molekyl tyrosinkinasehemmer som irreversibelt blokkerer flere hennes familie reseptorer (HER-1 (EGFR), HER-2 og HER-4 tyrosin kinaser), til cetuximab, godkjent gjeldende FDA anti-EGFR medisiner for HNSCC og erlotinib, en EGFR bestemt lite molekyl tyrosinkinasehemmer. Dacomitinib, erlotinib og cetuximab ble testet i et panel av 27 HNSCC-cellelinjer. Behandling med 100 pg /ml cetuximab eller 1 uM av erlotinib hemmet vekst med minst 50% i 7/27 cellelinjer, mens behandling med 1 uM av dacomitinib hadde lignende veksthemming i 17/27 linjer. Cellelinjer som representerer tre nivåer av følsomhet for dacomitinib ble videre undersøkt ved hjelp av Western blot, cellesyklus og apoptose analyseverktøy. Behandling med 100 nM av dacomitinib redusert EGFR aktivitet og nedstrøms AKT og ERK veier mer effektiv enn behandling med 100 ug /ml av cetuximab i alle de ti testede linjer. Selv om begge forbindelser indusert apoptose på tilsvarende nivå, dacomitinib forårsaket større G0 /G1 arrest. Følsomhet for EGFR blokade ble assosiert med nivåer av EGFR og ERK og var ikke forbundet med vanlige onkogene mutasjoner og kopinummervariasjoner. Fosforylert og total EGFR og ERK nivåer korrelerer med følsomhet for både cetuximab og dacomitinib. Tre av de fire linjene i utsøkt sensitive gruppen hadde de høyeste nivåene av fosforylert og total EGFR og ERK blant de ti linjer som ble valgt, mens de tre resistente linjene kollektivt hadde de laveste nivåene. Verken Pakt eller Takt var assosiert med følsomhet
Citation. Ather F, Hamidi H, Fejzo MS, Letrent S, Finn RS, Kabbinavar F et al. (2013) Dacomitinib, en Irreversible Pan-ErbB Inhibitor Betydelig opphever Vekst i hode- og halskreft modeller som viser lav Response til Cetuximab. PLoS ONE 8 (2): e56112. doi: 10,1371 /journal.pone.0056112
Redaktør: Nils Cordes, Dresden teknologiske universitet, Tyskland
mottatt: 23 april 2012; Godkjent: 08.01.2013; Publisert: 06.02.2013
Copyright: © 2013 Ather et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser. SL er ansatt i Pfizer. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Plateepitelkarsinom i hode og hals (HNSCC), som består av kreft med opprinnelse i den muntlige og nesehulene, strupehode og svelg, leppe og bihuler, er den sjette vanligste kreftformen i verden med en insidens overgå 500.000 tilfeller årlig [1], [2]. Til tross for utvikling modell av multimodalitet ledelse integrere kirurgisk inngrep, kjemoterapi og strålebehandling, forblir samlet overlevelse dårlig med en 5-års relativ overlevelse under 50% (SEER HNSCC statistikk). Hode- og halskreft ledelse holder et betydelig potensial for utnyttelse av målrettede biologisk terapi, en strategi som har gjort betydelige fremskritt i behandlingen av andre histologier inkludert kreft i bryst [3], tykktarm [4], og lungekreft [5] . Den primære utløsende faktor for lunge og hode- og halskreft er røyking, og begge har lignende molekylære egenskaper som har blitt implisert i patogenesen av sykdommen, for eksempel en nøkkelrolle for human epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) på tumorvekst.
EGFR, som er sterkt uttrykt i en signifikant flertall (opptil 80-100%) av HNSCC, er av prototypen reseptoren av HER-tyrosin-kinase-reseptor-familien, som inkluderer HER1 /ErbB-1 /EGFR, HER2 /neu /ErbB-2, HER3 /ErbB-3 og HER4 /ErbB-4- [6]. Binding av en av dens syv ligander (som omfatter EGF og TGF-alfa) induserer homodimerization og heterodimerisering med andre familiemedlemmer og fosforylering på flere tyrosinrester i det C-terminale domene [7]. Binding av spesifikk ligand, så som epidermal vekstfaktor (EGF) og transformerende vekstfaktor (TGF-alfa) til EGFR, resulterer i reseptor-dimerisering og initiering av intracellulære signalveier. Major nedstrøms signal er via Ras-Raf-MAPK veien. Aktivering av Ras initierer en flertrinns fosforylering kaskade som fører til aktivering av MAPK, ERK1 og ERK2, som til slutt regulerer transkripsjonen av molekyler som er involvert i celleformering [8]. Et annet viktig mål i EGFR-signalering er fosfatidylinositol 3-kinase (P13K) og den nedstrøms protein-serin /treonin kinase Akt. Denne sistnevnte proteinkinase transduces molekylære signaler som utløser avgjørende skritt for cellevekst og overlevelse [8], [9].
Aberrant aktivering av EGFR og nedstrøms veier har vært implisert i flere ondartede sykdommer [10]. Overekspresjon av EGFR i HNSCC har vært forbundet med lavere responsrater til standard kjemoterapi, og øket motstand mot tilbakefall og strålebehandling [11], [12], [13]. Flere forbindelser rettet mot EGFR har oppgitt klinisk praksis i kreftmedisin inkludert små molekyler som binder tyrosin kinase domene av EGFR som gefitinib [14] (Astrazeneca, lungekreft) og erlotinib [15] (OSI /Genentech, lunge og kreft i bukspyttkjertelen) og de monoklonale antistoffer cetuximab [16] (BMS /Imclone, kolorektal, lunge og hode og halskreft) og panitumumab [17] (Amgen, tykktarmskreft) som binder sitt ekstracellulære domene.
potensialet i EGFR rettet terapi for å behandle pasienter med HNSCC er validert i nyere studier hvor pasienter som får cetuximab og strålebehandling vist bedre overlevelse og lokoregionalt kontroll, i motsetning til behandling med stråling alene [16]. Lignende forbedringer ble observert ved tilsetning av cetuximab til platina basert terapi i det ekstreme prøve [18]. Imidlertid øker i overlevelse og tumorkontroll som følge av tilsetningen av cetuximab i disse studiene er fortsatt beskjeden, ofte målt i måneder eller uker. Av denne grunn identifisering av prediktive markører for bedre pasient utvalg samt utvikling av mer effektive midler rettet mot denne viktige veien er nødvendig for å oppnå bedre resultater i HNSCC pasienter.
En grunn respons på EGFR-rettet terapi kan være lav er det samarbeid og signale redundans mellom ulike medlemmer av ErbB reseptor familien [19]. Til tross for hemming av selv de mest sterkt uttrykt familiemedlem (som tilfellet er når cetuximab hemmer EGFR), kan spredning forbli upåvirket fordi alternative signalering fra andre reseptorer er å opprettholde aktiverings felles nedstrøms trasé som deles av ErbB-reseptor familiemedlemmer. Dermed rettet mot flere medlemmer av ErbB-reseptoren gruppen er en rasjonell tilnærming, spesielt i fag der sykdommen har i utgangspunktet utviklet eller har utviklet resistens mot cetuximab terapi. Denne forestillingen er støtte ved brystkreft pasienter som opplevde tumorprogresjon etter behandling med trastuzumab (Herceptin, Genentech), et monoklonalt antistoff rettet mot HER2, har vist respons på den doble EGFR og HER2 tyrosinkinasehemmer lapatinib (Tykerb, GSK) [20] .
Dacomitinib (Pfizer) er en andre generasjon Pan-ErbB inhibitor som irreversibelt bindes flere medlemmer av hennes familie, inkludert ErbB-en, ErbB-2 og ErbB-4 [21]. Vesentlige in-vitro respons ble observert med lave konsentrasjoner av dacomitinib i lungekreftcellelinjer som er resistente mot gefitinib [22] og i brystkreftcellelinjer som er resistente mot trastuzumab og lapatinib [23]. I klinikken, en fase I doseeskaleringsstudie hos pasienter med fremskredne ondartede solide tumorer demonstrert godt tolererte dose med signifikant antitumoraktivitet [24]. Siste fase I og II-studier i avansert NSCLC har vist lovende klinisk aktivitet målt ved sykdom stabilisering og forbedret progresjonsfri overlevelse hos pasienter som progrediert på platina terapi og ble tidligere behandlet med erlotinib [25]. Med sin forbedrede farmakokinetiske egenskaper, blant annet økt biotilgjengelighet, halveringstid, og lavere klaring i forhold til første generasjon irreversible Pan-ErbB-inhibitorer som for eksempel CI-1033, er dacomitinib et attraktivt middel for potensiell klinisk bruk i HNSCC [21]. Målet med denne studien var å fastslå in vitro anti-spredningseffekter av Dacomitinib i HNSCC cellelinjer. Dette inkluderer klarlegging av mekanismer som forklarer aktiviteten ErbB rettet terapi i HNSCC cellelinje modeller samt benchmarking sin effektivitet mot den eneste FDA godkjente målrettet terapi for HNSCC behandling.
Resultater
Cellelinjer resistent mot cetuximab er mottakelige for dacomitinib ved lav konsentrasjon
Et panel av 27 HNSCC-cellelinjer som reflekterer den anatomiske heterogenitet av sykdommen ble anvendt for å teste de antiproliferative virkningene av dacomitinib (PF-00299804) og cetuximab, den eneste FDA godkjent målrettet terapi i HNSCC. (tabell 1).
Dacomitinib hemmet veksten av alle hode og nakke kreft cellelinjer i en konsentrasjonsavhengig måte. Det var imidlertid betydelig heterogenitet i IC50-g-verdier på tvers av panelet, med en 4-log-ganger forskjell mellom de mest følsomme og minst følsomme cellelinjer (Figur 1a). Et cutoff av 1 uM ble anvendt for å stratifisere reagerende cellelinjer basert på en tidligere studie i brystkreftcellelinjen panel [23]. 17/27 cellelinjer ble definert som dacomitinib responsive og hadde en IC50 g mindre enn en UM. Behandling med 100 pg /ml cetuximab resulterte i mer enn 50% inhibering i 7/27 cellelinjer (figur 1b). Responsen fra cellelinjer med hver enkelt forbindelse korrelerte ikke med den primære svulsten anatomiske området.
Celler ble talt etter fem dagers behandling. SE stolpene ble avledet fra forsøkene gjentas minst to ganger. A. Dacomitinib IC50 g-verdier er ordnet fra laveste til høyeste IC50 g på en logg skala. Celler ble behandlet ved konsentrasjoner fra 0,001 til 10 uM. B. Prosentvis vekst hemming med cetuximab behandling. Celler ble behandlet ved en fast dose på 100 ug /ml. C. Erlotinib IC50 g-verdier er ordnet fra laveste til høyeste IC50 g på en logg skala. Celler ble behandlet ved konsentrasjoner fra 0,015 til 10 uM. Rødt indikerer følsomheten cutoff. For dacomitinib og erlotinib, er følsomheten cutoff satt til 1 um, og for cetuximab det er satt til 50%.
I tillegg, det samme panelet brukes til å vurdere følsomheten av cetuximab og dacomitinib i HNSCC celler ble brukt for å vurdere følsomheten av erlotinib, en EGFR spesifikk lite molekyl tyrosinkinaseinhibitor. Selv om erlotinib er ikke en FDA godkjent behandling i HNSCC, er det i en lignende klasse av målrettet terapi som dacomitinib. For således å vurdere om forskjellen mellom dacomitinib og cetuximab observert ovenfor er relatert til de farmakologiske forskjeller mellom legemiddelklasser, dvs. antistoff versus lite molekyl-inhibitor, snarere enn deres biologiske mål vi også vurdert følsomheten av erlotinib. Kun 25,6% (7 av 27) HNSCC cellelinjer var erlotinib responsive og hadde en IC50 mindre enn 1 um (figur 1C). Denne prisen av svært sensitive cellelinjer (definert som de med IC50 mindre enn 1 UM) var (begrepet «svarprosenten» skal være reservert for en faktisk klinisk studie hvor vanlig fullstendig /delvis totale å generere denne verdien. Det er spesifikk for dette, og vi bør ikke forvirre leserne i en preklinisk studie med mindre det er av svulst xenograft studie etc).
i likhet med at av cetuximab slik at kun 7 av 27 HNSCC cellelinjer hadde også større enn 50% inhibering med 100 ug /ml cetuximab behandling. Dette står i sterk kontrast til dacomitinib som oppnådde en svært følsom sats på 62,9% med samme 1 um følsomhet cutoff. Av de syv HNSCC linjer som er følsomme overfor erlotinib (IC50 1 UM), fem hadde mer enn 50% inhibering etter behandling med 100 ug /ml cetuximab. De andre to cellelinjer (UMSCC-25 og UMSCC-38) som hadde en IC50 g 0,367 og 0,508 uM henholdsvis hadde 25,9% og 41,2% hemning med 100 ug /ml av cetuximab behandling. Det var to cellelinjer som hadde mer enn 50% inhibering etter behandling med cetuximab, men ikke har mindre 1 uM IC50 g med erlotinib. Cellelinjene UMSCC-4 og Fadu som hadde et 75,6% og 56,4% hemning med cetuximab behandling, hadde IC50 g 1,19 og 1,192 uM henholdsvis etter behandling med erlotinib. Alle syv av erlotinib responsive cellelinjer ble også dacomitinib responsive. Av de resterende 20 cellelinjer, 16 hadde IC50 g mellom 1 uM og 10 uM og 4 cellelinjer ikke oppnå IC50 g ved maksimal testet konsentrasjon på 10 UM.
HNSCC følsomhet for erlotinib var lik cetuximab følsomhet slik at bare 25,6% (7/27) av panelet var lydhør overfor erlontinib og cetuximab, mens 62,9% (17/27 HNSCC hadde IC50 g 1 uM) var lydhør overfor dacomitinib. Siden cetuximab har vist klinisk verdi, og er dermed en standard vare for hode og nakke kreft, ble resten av sammenligningen gjøres mellom dacomitinib og cetuximab.
Felles Oncogene Mutasjoner og presiseringer er sjeldne i HNSCC og ikke Correlate med Følsomhet for Cetuximab heller Dacomitinib
Mutasjoner i EGFR, K-Ras og PI3K har vist seg å påvirke responsen på målrettet terapi [4], [26]. Men disse mutasjonene ikke er rikelig i hode og nakke tumorprøver [27], [28]. Vi ønsket å vurdere om en) våre cellelinje panel var representativ for den samme trenden og 2) hvis mutasjoner i disse genene var forbundet med følsomhet for cetuximab og dacomitinib. Vi utførte mutasjon analyse på panelet av hode og nakke kreft cellelinjer som benyttes i analysen spredning og funnet ut at mutasjoner var sjeldne, og kan ikke brukes til å forklare følsomhet for cetuximab og dacomitinib (tabell 1). Ingen av de cellelinjer næret EGFR mutasjoner i exon 19 eller 21. Bare den CAL-33-cellelinjen viste en mutasjon i exon 9 eller 20 av PI3K (en heterozygot H1047R mutant) og bare UMSCC-74A oppviste en KRAS mutasjon (et heterozygot G12D mutant). Begge disse cellelinjene hadde en lavere følsomhet for dacomitinib selv om CAL33 var noe som reagerer på cetuximab.
Amplifisering av reseptor-tyrosin-kinaser har vært forbundet med følsomhet for terapier rettet mot disse reseptorer [29]. Tidligere studier har funnet opp til 20% av HNSCC er EGFR forsterkes, men prognostisk og prediktiv verdi av denne aberrasjon er blandet [30]. Vi utførte FISH-analyse for å vurdere kopiantallet av EGFR i 19 av de 27 cellelinjer. Ingen av de cellelinjer ble amplifisert for EGFR og bare 4/19 cellelinjer (UMSCC-5, UMSCC-11A, CAL-27 og CAL-33) viste økt kopiantall av EGFR (tabell 1). Interessant, økt kopiantall av EGFR var ikke assosiert med sensitivitet overfor dacomitinib; en av de mest følsomhet linjene (CAL-27) og en av de mest motstandsdyktige linjene (CAL-33) var blant de fire linjer med gevinster på EGFR.
Baseline fosforylert og Total EGFR Levels med og uten EGF Atimulation korrelert med Følsomhet for EGFR-rettet terapi
for å vurdere i hvilken grad dacomitinib og cetuximab blokk EGFR-signalering i hode- og halskreft cellelinjer og finne ut om dens effektivitet i å blokkere EGFR er assosiert med deres evne til å hemme vekst, Vi utførte Western blot-analyse for å vurdere protein nivå og fosforylering status av nøkkelmolekyler i EGFR-signaleringsreaksjonsveien.
Vi utførte Western blot-analyse på en undergruppe av cellelinjer som er representative for den differensielle respons på dacomitinib behandling. Fire linjer ble valgt ut fra den mest sensitive gruppen (IC50 10 nM), tre linjer fra moderat gruppe (1 uM IC50 10 nM) og tre linjer fra resistente gruppe (IC50 1 UM). vises den gjennomsnittlige dacomitinib IC50 g av de utvalgte cellelinjer i hver gruppe i Figur 2. Cellene ble behandlet med enten 100 nM dacomitinib eller 100 ug /ml cetuximab i begge EGF-stimulert og ustimulerte stater. Både totalt og fosforylert EGFR (tEGFR og pEGFR) proteinnivåene ble vurdert (figur 3a). Total EGFR nivå var assosiert med følsomhet for dacomitinib; tre av de fire linjene i den svært følsomme gruppen hadde de høyeste nivåene av fosforylert og total EGFR blant de ti linjer som ble valgt, mens de tre resistente linjene kollektivt hadde de laveste nivåene (figur 3a). Cellelinjer i den moderate gruppen hadde middels nivå av fosforylert og total EGFR. Å sammenligne pEGFR nivåer mellom de følsomme, moderate og resistente grupper, ble Western blot bilder kvantifiseres og det gjennomsnittlige nivået på pEGR for hver følsomhet gruppe ble beregnet og normaliseres. Behandling med enten forbindelse vesentlig blokkert nivåer av EGF-stimulert pEGFR i de svært følsomme og moderate grupper, men ikke i den resistente gruppe (figur 3b).
Fire cellelinjer ble valgt fra utsøkt følsomme gruppen (IC50 g 10 nM), tre fra moderat gruppen (IC50 nM G10 – 1 uM) og tre fra resistente gruppe (IC50 g 1 uM). Disse ti linjer blir brukt i Western blot og flowcytometri eksperimenter. Gjennomsnittlig IC50 g av de valgte sensitive linjer er 5 nM; moderat 75 nM; motstandsdyktig 2186 nM.
Cellene ble dyrket til log-fase og ble behandlet med 100 nM dacomitinib eller 100 ug /ml cetuximab i 1 time, med eller uten behandling med 10 ng /mL rekombinant EGF-ligand. Cellene lysater ble deretter høstet, og protein ble oppløst under anvendelse av Western blot-analyse. B. Western blot bildene ble kvantifisert ved hjelp ImageJ programvare. Proteinnivåer ble kvantifisert for hver cellelinje og ble beregnet ved gruppe. Fosforylert EGFR ble normalisert til total EGFR. *. p. 0,05, t-test
Behandling med enten stoffet ikke redusere de totale EGFR nivåer (figur 3a). Imidlertid var det en merkbar reduksjon i total EGFR i kontrollcellene med EGF-stimulering. Det er kjent at EGFR er internalisert og ofte nedbrutt etter stimulering med EGF eller andre ligander, noe som kan forklare vår observasjon [31]. Tilsetting av enten stoffet, men eliminert denne effekten, som legger bevis på at forbindelser som binder EGFR kan hemme intern og degradering.
Dacomitinib men ikke cetuximab hemmer EGF stimulert EGFR Nedstrøms Pathways
PI3K- AKT-mTOR og Ras-Raf-MAPK signalveier er nedstrøms effektorer av EGFR-signalering [8]. Vi ønsket å evaluere effekten av dacomitinib og cetuximab på disse banene. Først vurderte vi protein nivåene av total AKT (Takt) og fosforylert AKT (Pakt) ved behandling med enten dacomitinib eller cetuximab. I kontrollforhold, ble verken Pakt eller Takt nivåer forbundet med følsomhet (figur 4A) i enten baseline eller EGF stimulert tilstand. EGF-stimulering økt betydelig pakt i alle cellelinjer.
Cellene ble dyrket til log-fase og ble behandlet med 100 nM dacomitinib eller 100 ug /ml cetuximab i 1 time, med eller uten behandling med 10 ng /mL rekombinant EGF ligand. Cellene lysater ble deretter høstet og protein ble oppløst under anvendelse av Western blot-analyse. B. Western blot bildene ble kvantifisert ved hjelp ImageJ programvare. Proteinnivåer ble kvantifisert for hver cellelinje og ble beregnet ved gruppe. Fosforylert AKT ble normalisert til total AKT. *. p. 0,05, t-test
Dacomitinib redusert Pakt nivåer i alle syv cellelinjer i de følsomme og moderate grupper og en cellelinje i motstandsdyktig gruppe (UMSCC-1) i både baseline og EGF stimulert forhold (Figur 4A). Dacomitinib var i stand til å redusere Pakt nivåer i resistente cellelinje UMSCC-17B i EGF stimulerte forhold. I resistente cellelinje (UMSCC-74A) Pakt nivåer ble noe redusert i EGF stimulert tilstand. Cetuximab behandling var mindre potent på å redusere Pakt. Behandling med cetuximab forårsaket reduksjon i pakt i bare fem av ti cellelinjer (2/4 følsomme linjer, 3/3 moderat linjer og 0/3 resistente linjer), og graden av reduksjonen var betydelig mindre enn de som er forårsaket av behandling med dacomitinib uavhengig av EGF stimulering (figur 4a).
Som med EGFR, ble vestlige blotter kvantifisert og gruppespesifikke nivåer av Pakt normal til takt ble bestemt og sammenlignet (figur 4b). Uten EGF stimulering, begge forbindelser betydelig redusert pakt nivåer i den meget følsomme gruppe, og ikke er de moderate eller motstandsdyktige grupper. I EGF stimulert forhold dacomitinib var i stand til å redusere pakt nivåer i alle de tre gruppene. I alle testede scenarier, dacomitinib forårsaket større reduksjon i pakt nivåer enn cetuximab.
Aktivering av Ras ved EGFR-signale initierer en flertrinns fosforylering kaskade som fører til aktivering av MAPK, ERK1 og ERK2, og til slutt regulerer transkripsjon av gener som er involvert i celle-proliferasjon. Total og fosforylert ERK (ERK1 og 2) protein (Terk og perk) nivåene ble analysert ved behandling med enten dacomitinib eller cetuximab. I kontrollbetingelser, terk og ekstra fordel protein nivåene var lavere i den meget følsomme gruppe og høyere i motstandsdyktig gruppen (figur 5a og 5b), uavhengig av EGF-stimulering. Behandling med enten forbindelsen signifikant reduserte nivåer av ekstra fordel i de syv cellelinjene i de svært følsomme og moderate grupper, og bare en (UMSCC-1) av tre cellelinjer i den motstandsdyktige gruppe i den opprinnelige tilstand (figur 5a). Ved stimulering med EGF, Perk nivåer betydelig økt tvers av alle cellelinjer. Under denne tilstanden, Dacomitinib fortsatt blokkert fosforylering av ERK nivåer i alle syv cellelinjer i den følsomme og moderat gruppe. I tillegg til å redusere Perk nivåer i resistent linje UMSCC-en under EGF stimulert tilstand, dacomitinib også redusert perk nivåer i motstandsdyktig linjen UMSCC-74A. Cetuximab var bare i stand til å redusere Perk nivåer i en følsom (SCC-9), en moderat (Fadu) og en motstandsdyktig (UMSCC-74A) linje. I alle scenarier, dacomitinib forårsaket større reduksjon i Perk nivåer enn cetuximab.
Celler ble dyrket til log-fase og behandlet med 100 nM dacomitinib eller 100 ug /ml cetuximab i 1 time, med eller uten behandling med 10 ng /ml rekombinant EGF ligand. Cellene lysater ble deretter høstet og protein ble oppløst under anvendelse av Western blot-analyse. B. Western blot bildene ble kvantifisert ved hjelp ImageJ programvare. Proteinnivåer ble kvantifisert for hver cellelinje og ble beregnet ved gruppe. Fosforylert ERK ble normalisert til total ERK. *. p 0,05, **. p. 0,01, t-test
Vest-blotter ble kvantifisert og gruppen bestemte nivåer av Perk normal å Terk ble bestemt og sammenlignet (figur 5b). Uten EGF stimulering, begge forbindelser betydelig redusert perk nivåer i den svært følsomme gruppen og moderate grupper, men ikke bestandig gruppe. I EGF stimulert forhold, bare dacomitinib var i stand til å redusere Perk nivåer. I alle testede scenarioer, dacomitinib forårsaket større reduksjon i Perk nivåer enn cetuximab.
Dacomitinib Årsaker Greater G0 /G1 arrest enn Cetuximab
Dacomitinib og cetuximab kan ha antiproliferativ aktivitet ved å indusere cellesyklus og apoptose . De samme ti cellelinjer valgt for Western blot analyser, som representerer de varierende spredning svarene på de to forbindelsene, ble brukt til å analysere effekter på cellesyklus og apoptose.
Dacomitinib forårsaket større cellesyklus arrest enn cetuximab. Etter behandling med 100 nM av dacomitinib eller 100 ug /ml cetuximab i fem dager, var det en betydelig økning i prosentandelen av celler i G0 /G1 fase i de følsomme og moderate grupper med dacomitinib men ikke med cetuximab sammenlignet med kontroll (figur 6a ). Selv om cetuximab forårsake noen G0 /G1 arrest, var denne effekten ikke signifikant sammenlignet med kontroll og betydelig lavere enn effekten av dacomitinib i både sensitive og moderate grupper. Det var mindre enn fem prosent reduksjon i S-fasen i alle betingelser med unntak av dacomitinib behandlede moderat gruppe som hadde en signifikant reduksjon (figur 6b). Den generelle trenden av virkningene på S-fasen etterlignet effektene på G0 /G1 fase. Konsekvent, dacomitinib behandling av de sensitive og moderate grupper forårsaket en større nedgang i G2 enn cetuximab behandling (figur 6c).
Celler ble behandlet med 100 nM dacomitinib eller 100 ug /ml cetuximab i fem dager før analyse ved hjelp av flyt cytometri. Dataene som vises, er gjennomsnittlig prosentandelen av celler i gruppeoppgaver fra figur 2. A. endring i prosentandelen av celler i G0 /G1 fase. B. endring i prosentandelen av celler i S-fasen. C. endring i prosentandelen av celler i G2-fasen. *. p. 0,05, t-test
Dacomitinib var like effektivt som cetuximab ved å indusere apoptose. I de følsomme og moderate grupper, begge forbindelser forårsaket en reduksjon i prosentandelen av celler som var levende (figur 7A). Det var en samtidig økning i prosentandelen av celler som var i en tidlig eller sen apoptotisk tilstand (figur 7B, figur 7C). Mindre enn 6% av cellene var døde i noen av forsøkene (figur 7D). Verken stoffet forårsaket betydelig apoptose i motstandsdyktig gruppen. Det var ikke en signifikant forskjell mellom forbindelsene i indusering av apoptose.
A. Endringer i% levende celler. B. Endringer i celle tidlig i apoptose. C. Endringer i celler i slutten av apoptose. D. Endringer i% døde celler.
Dacomitinib er mer effektiv til å blokkere EGFR Signa enn lite molekyl tyrosinkinaseinhibitoren Erlotinib
Som nevnt tidligere, som svar på svært spesifikke EGFR-rettede terapi kan være lav fordi det kanskje samarbeid og signale redundans mellom ulike medlemmer av ErbB-reseptoren familien. Således vurderes vi dacomitinib, en panHER inhibitor med bred spesifisitet, i et panel av 27 HNSCC og viste HNSCC-cellelinjer er mer følsomme for det enn den lille molekylet anti-EGFR-tyrosinkinase-inhibitor erlotinib og den anti-EGFR-antistoff cetuximab i proliferasjonsanalyser (se figur 1) og ved hjelp av en undergruppe av ti cellelinjer viste vi at dacomitinib var mer effektiv ved blokkering av EGFR-signalisering enn cetuximab. Karakteriseringen av dacomitinib ble utført i sammenligning med cetuximab, godkjente FDA eneste anti-EGFR middel i behandlingen av HNSCC. Men erlotinib og dacomitinib er både små molekyl hemmere i motsetning cetuximab som er et antistoff og dermed erlotinib evne til å blokkere EGFR signale ble vurdert ved hjelp av Western blotting.
Tre cellelinjer som representerer de tre klassene av sensitivitet beskrevet tidligere ble undersøkt . I den sensitive linjen HN5 dacomitinib var mer effektiv til å blokkere EGFR signale enn både cetuximab eller erlotinib (figur 8A). Bare HN5 celler behandlet med 100 nM av dacomitinib hadde signifikant lavere nivåer eller pEGFR sammenlignet med kontrollen. EGFR signalering i moderat følsomme linje, UMSCC-38 og UMSCC-17B var lav.
Celler ble dyrket til log-fase og behandlet med 100 nM dacomitinib, 100 nM erlotinib eller 100 ug /ml cetuximab i én time . Cellene lysater ble deretter høstet og protein ble oppløst under anvendelse av Western blot-analyse. B. Western blot bildene ble kvantifisert ved hjelp ImageJ programvare. Proteinnivåer ble kvantifisert for hver cellelinje. Fosforylert ERK og AKT ble normalisert til alfa tubulin og presentert som en% av kontrollen.
Mer signifikante endringer ble lagt merke til i de downstreams PI3K-AKT-mTOR og Ras-Raf-MAPK vei, som dacomitinib var signifikant mer effektiv til å blokkere både fosforylering av AKT og ERK (figur 8A). Western blot ble kvantifisert og Pakt og perk nivåer ble presentert som prosent av kontroll etter normalisering til alfa tubulin å kontrollere for total protein (figur 8B). HN5 celle behandlet med 100 nM av erlotinib hadde dobbelt så mye Pakt som de som ble behandlet med 100 nM dacomitinib. UMSCC-38 celle ble behandlet med 100 nM av erlotinib hadde 17 ganger mer pakt enn de som ble behandlet med den samme konsentrasjon av dacomitinib. På samme måte selv om alle tre stoffene var effektive en blokkering fosfor ERK i den sensitive linjen HN5, UMSCC-38 behandlet med 100 nM av erlotinib hadde 4 ganger mer Perk signal enn UMSCC-38 celler behandlet med samme konsentrasjon av dacomitinib. Erlotinib var mindre effektiv til å blokkere både fosfor ERK og AKT i UMSCC-38 sammenlignet med cetuximab og dacomitinib. I resistente linjen UMSCC-17B, verken erlotinib eller dacomitinib hatt vesentlig effekt på Pakt men dacomitinib var mer effektiv til å blokkere Perk nivå enn erlotinib (figur 8B).
For å vurdere om en dose avhengighet kan sees ved hjelp av en høyere konsentrasjon av dacomitinib (1 uM) ble testet ved å blokkere ERK og AKT mediert signalering i resistent linje, UMSCC-17B. Sammenlignet med 100 nM behandling, UMSCC-17B celler behandlet med 1 um dacomitinib hadde en 25% reduksjon i Pakt og 21% reduksjon i Perk (figur 8A og 8B).
Diskusjoner
irreversible pan-ErbB inhibitor dacomitinib er for tiden i fase III kliniske studier for behandling av pasienter med lungekreft og har vist lovende aktivitet i behandling av denne malignitet (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01000025). Vi ønsket å sammenligne effektene av dacomitinib med cetuximab, en EGFR-hemmer som er i dag den eneste FDA-godkjente målrettet terapi for HNSCC behandling og som erlotinib et lite molekyl EGFR-hemmer ennå ikke godkjent av FDA i HNSCC. Vi gir bevis for at behandling med en pan-HER inhibitor dacomitinib er mer effektivt enn å bruke EGFR spesifikke hemmere cetuximab og erlotinib.
Våre data viser effektiviteten av dacomitinib i abrogere vekst av HNSCC cellelinjer in vitro. Våre data viser at cellelinjer som stiller dramatisk vekst hemming med cetuximab også utstilt betydelig veksthemming med dacomitinib, som demonstrerer, i det minste, mangel på dårligere dacomitinib sammenlignet med cetuximab. Klinisk interesse er at 3/27 cellelinjer, 11% av panelet, opplevde mer enn 90% veksthemming med cetuximab, som minner om den kliniske observasjon av en svarprosent 10% observert hos pasienter som fikk cetuximab terapi. Disse tre cellelinjene var utsøkt sensitive til dacomitinib samt med IC50-g-verdier som er mindre enn 10 nM. Hvis dette preklinisk observasjon holder klinisk, ville vi forutsi de pasienter som responderer på cetuximab vil også svare på dacomitinib.
