Abstract
Formål
Hensikten med denne studien var å finne ut om mikroRNA profilering av urin og plasma ved radikal prostatektomi kan skille potensielt dødelig fra lat prostatakreft.
materialer og metoder
Et panel av microRNAs ble profilerte i plasma fra 70 pasienter og urinen hos 33 pasienter som samles før radikal prostatektomi. Uttrykk for microRNAs var korrelert til de kliniske endepunktene på en oppfølgingstid på 3,9 år for å identifisere microRNAs som kan forutsi klinisk respons etter radikal prostatektomi. En maskin læring tilnærmingen ble anvendt for å teste den prediktive evnen til alle microRNAs profilerte i urin, plasma, og en kombinasjon av begge, og globale resultater vurderes ved hjelp av arealet under mottageroperatøren karakteristiske kurven (AUC). Validering av urin uttrykk for miRNAs ble utført på en ytterligere uavhengig kohort av 36 pasienter.
Resultater
Det beste prediktor i plasma ved hjelp av åtte Mirs gitt bare moderat prediktiv ytelse (AUC = 0,62). Den beste prediktor for høy risiko sykdom ble oppnådd ved hjelp MIR-16, MIR-21 og MIR-222 målt i urin (AUC = 0,75). Denne kombinasjonen av tre microRNAs i urinen var en bedre prediktor for høy risiko sykdom enn noen enkelte mikroRNA. Ved hjelp av en annen metode vi fant ut at dette settet med mirnas var ikke i stand til å forutsi høyt volum, høy grad av sykdom.
Konklusjoner
Vårt første funnene antydet at plasma og urin profilering av microRNAs på radikal prostatektomi kan tillate prognostication av prostatakreft atferd. Men vi fant ut at mikroRNA uttrykk signatur mislyktes i å validere i en uavhengig kohort av pasienter som bruker en annen plattform for PCR. Dette understreker behovet for uavhengige validering pasient kohorter og antyder at urin mikroRNA signaturer på radikal prostatektomi kan ikke være en robust måte å forutsi løpet av klinisk sykdom etter endelig behandling for prostatakreft
Citation. Sapre N, Hong MKH, Macintyre G, Lewis H, Kowalczyk A, Costello AJ et al. (2014) kuratert microRNAs i urin og blod Fail å validere som Predictive Biomarkører for High-Risk prostatakreft. PLoS ONE 9 (4): e91729. doi: 10,1371 /journal.pone.0091729
Redaktør: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugal
mottatt: 24 september 2013; Godkjent: 14 februar 2014; Publisert: 04.04.2014
Copyright: © 2014 Sapre et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. NS er støttet av videreutdanning stipend fra Kreft Council Victoria, Cybec Foundation og det kongelige Australasian College of Surgeons. Denne studien ble støttet av midler fra den australske regjeringen til den australske Prostate Cancer Research Epworth. AK og GM er støttet av NICTA. NICTA er finansiert av den australske regjeringen representert ved Institutt for bredbånd, kommunikasjon og digitale økonomien og den australske Forskningsrådet gjennom IKT Centre of Excellence program. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er preget av sin utpreget variable og uforutsigbare resultater. Innføringen av prostataspesifikt antigen (PSA) testing har ført til en dramatisk økning i tidlig deteksjon av prostatakreft (CAP) og en scene migrasjon slik at flere menn med tidlig stadium hetten blir nå diagnostisert med sykdommen [1], [2 ]. Imidlertid er heller ikke spesifikk for hetten testen [3] og heller ikke gjør det mulig for nøyaktig risiko stratifisering og seleksjon av de pasienter som sannsynligvis vil gi etter for sin sykdom etter tidlig radikal terapi [4], [5]. Sykelighet forbundet med typiske behandlinger har gitt opphav til en mengde biomarkør utviklingsstudier i et forsøk på å identifisere pasienter som mest sannsynlig å dra nytte av rettidig intervensjon for å redusere risikoen for tilbakefall og metastase [6].
Selv om mye forskning er rettet mot å finne biomarkører som kan forbedre prostatakreft deteksjon priser enn PSA, det viktige spørsmålet klinisk, er deteksjon av høyrisiko cap på et tidlig, helbredelig stadium. Mens de fleste tilfeller følge en lat kurs og krever ikke kurativ behandling, noen kreftformer har potensial til å spre og krever aggressiv, tidlig, klinisk intervensjon. Men dagens clinicopathological modeller ikke tillate klinikere å nøyaktig skille på et tidlig stadium mellom høy risiko og lat Cap [7]. Det er et presserende klinisk behov for nye markører som diskriminerer lat fra aggressive prostatakreft på et tidlig stadium.
microRNAs (mirnas) er ca 22 nukleotid lange, single-strandet, ikke-kodende RNA som binder seg til komplementære «frø» områdene som ble funnet i tre utranslaterte område (UTR) av spesiell budbringer RNA (mRNA) arter. Mirnas modulerer ekspresjon av deres mRNA-mål, enten merke dem for ødeleggelse eller inhibering av deres binding til translasjonell maskineri [8]. Mirnas har vist seg å være involvert i en lang rekke viktige fysiologiske og patologiske prosesser, inkludert cellesyklusprosesser, utvikling, overlevelse, differensiering, vekst, apoptose og immunrespons [8].
Flere studier har vist dereguleringen av miRNA er en viktig mekanisme i prostata karsinogenese [9], og at slike forandringer kan påvises i sera fra pasienter Cap [10], [11], [12], [13]. Det er flere fordeler med mirnas som biomarkører i biofluids. Biofluids som plasma og urin er mindre invasiv å få sammenlignet med vev og mirnas ofte deregulert i kreft og utstillings vev bestemt uttrykk. I tillegg er deres ekspresjon i blod og urin stabil og kan kvantifiseres følsomt ved kvantitativ sanntid polymerase-kjedereaksjon (RT-PCR) [14]. Det har derfor vært mye spenning om potensialet i mirnas som biomarkører av Cap. Men få av disse studiene har utført systematisk validering av disse biomarkører, som har hindret deres kliniske oversettelse i ledelse av Cap. I tillegg har de fleste av disse studiene som har sammenlignet tidlig cap til avansert /metastatisk Cap brukt prøver samlet når pasientene har utviklet metastatisk sykdom. Målet med denne studien var å undersøke om profilering av et panel av miRNAs i plasma og urin av primære prostatakreftpasienter før radikal prostatektomi kan skille lat hetten fra høyrisiko fenotype og å validere eventuelle funn i en uavhengig kohort av pasienter.
Materialer og metoder
etikk erklæringen
Dette prosjektet hadde full etikk godkjenning fra institusjonelle gjennomgang boards. De etiske godkjenninger knyttet til dette manuskriptet er Royal Melbourne Hospital Menneskelig forskningsetiske komité (HREC) Ingen 2006,073 og Epworth Health HREC nr 34506. Alle pasienter ga fulle skriftlig samtykke for sine prøver å bli lagret og brukt til forskning ved hjelp av pasientinformasjon og samtykkeerklæringer som ble godkjent av etiske komiteer.
mikroRNA panel utvalg
En systematisk litteraturgjennomgang ble gjennomført i PubMed for å finne microRNAs innblandet i prostata og epitelial kreft initiering, progresjon og metastase bruke begrepene «prostata kreft «og» mikroRNA «i juli 2011. refererte fra studier ble sjekket for ytterligere artikler av interesse. Alle artikler inkludert originale artikler, anmeldelser og abstrakter ble vurdert. Basert på vår gjennomgang valgte vi et panel av 12 Mirs for profilering i plasma og 13 Mirs for profilering i urinen, som alle hadde minst 2 uavhengige studier publisert som viser engasjement i prostatakreft karsinogenese, med preferanse gitt til de med samtidig støtte mekanistisk data . I tillegg har vi inkludert RNU48 i vårt panel som en antatt endogen kontroll [15].
Pasientvalg
Alle pasienter med diagnosen Cap, som gjennomgikk radikal prostatektomi på Epworth Hospital 2003-2010 med detaljert PSA oppfølging og komplette kliniske og patologiske data ble identifisert fra et prospektivt registrert og vedlikeholdes dedikerte prostatakreft database. Det første kullet besto av pasienter med høy risiko fenotype prostatakreft (n = 33 plasmaprøver, 16 urinprøver) og pasienter med lav risiko eller lat fenotype kreft (n = 37 plasmaprøver, 17 urinprøver). Den andre (validering) kohort besto av pasienter med høy risiko fenotype prostatakreft (n = 22 urinprøver) og pasienter med indolent fenotype prostatakreft (n = 14 urinprøver). Høy risiko kreft ble definert som Gleason grad større enn eller lik 7 og tumorvolum 1cc eller utvikling av metastatisk sykdom eller tidlig biokjemisk tilbakefall tyder på systemiske mikrometastaser (kort PSA dobling tid, mislyktes berging strålebehandling, PSA utholdenhet). Indolent kreft ble definert som Gleason 6, T2a, PSA 10 og PSA overlevelse i minst 3 år (Epstein kriterier) [16]. Plasma og urin ble samlet fra pasienter før prostatektomi umiddelbart etter en digital rektal undersøkelse, snap-frosset og lagret i flytende nitrogen.
Klinisk datainnsamling
Relevante kliniske og patologiske data ble registrert prospektivt og analysert retrospektivt. Detaljer om PSA oppfølging ble registrert prospektivt og oppdateres årlig. Tumorvolumene ble målt nøyaktig ved planimetri beregnet ved tidspunktet for histologiske undersøkelser, som tidligere beskrevet [17]. TNM (2002) klassifiseringssystemet ble brukt til å iscenesette prøvene. Den Gleason sum score, og patologisk tumorstadium ble alle vurdert separat. For pasienter som ikke opplever en biokjemisk tilbakefall i løpet av studieperioden, oppfølging ble sensurert på tidspunktet for sin siste registrerte PSA-test. For pasienter med mer enn en enkelt postoperativ PSA registrert, ble PSA dobling tid (PSAdt) beregnes ved hjelp av loggen skråningen metoden [18]. For denne studien, ble biokjemisk tilbakefall definert som en postoperativ PSA verdi som er større enn eller lik 0,2 ng /ml og stigende, eller et stigende PSA-nivå under denne terskelen som ble følt av behandlende lege for å representere en gjentakelse og førte til institusjon berge terapi. Signifikant biokjemiske tilbakefall ble definert som PSA tilbakefall med en fordoblingstid 6 måneder, da dette har vist seg å være en mer nøyaktig indikator på utviklingen av metastaser og kreftspesifikke dødelighet enn PSA gjentakelse alene [19], [20]. For pasienter med primær PSA utholdenhet som umiddelbart ble behandlet med berging terapi PSAdt ble vilkårlig antatt å være 6 måneder. Innsamling og bruk av denne informasjonen hadde Melbourne Helse etiske komité godkjenning.
RNA ekstraksjon
500 mL av plasma eller urin ble tint på is for total RNA ekstraksjon ved hjelp av Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, TX, USA) i henhold til produsentens protokoll med de følgende modifikasjoner /betingelser: 1,5 volumer av lysis /bindingsbuffer ble anvendt for cellelysering, før tilsetningen av homogenatet, og RNA ble eluert i 40 ul vann. RNA elueringer ble frosset på tørris og lagret i -80 ° C.
RT-PCR
RNA ble konsentrert fra 40 pl til 15 pl ved anvendelse av en Savant speedvac (Thermo Fisher Scientific, NC, USA) ved 45 ° C /høyt trykk. Revers transkripsjon ble utført på en termosykler (Applied Biosystems, CA, USA) ved bruk av Taqman mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, CA, USA) i henhold til produsentens små RNA-analyse protokoll med følgende modifikasjoner: 7 mL RNA ble brukt som mal og sammenslåtte primere ble brukt til forhåndsvalgte 14 miRNA arter.
Opprinnelig kohort.
kvantitativ real-time PCR ble utført med den resulterende cDNA på egendefinerte TaqMan Low Density Array kort (Applied Biosystems , CA, USA) som inneholder primere for vår miRNA panel i henhold til produsentens protokoll. Alle reaksjoner ble utført i triplikat og median inkludert i den endelige analysen. TLDA kortene ble kjørt på en 7900HT Fast Real-Time PCR System.
Validering Cohort.
Preamplification av det syntetiserte cDNA ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble 2,5 mL cDNA lagt til 12,5 mL preamplification MasterMix, 3,75 ul primer basseng og 6,25 mL nukleasefritt vann. Denne reaksjonen ble oppvarmet til 95 ° C i 10 min, 55 ° C i 2 minutter, 72 ° C i 2 minutter etterfulgt av 12 sykluser med amplifikasjon før oppvarming til 99 ° C i 10 minutter. De amplifiserte Reaksjonsproduktene ble fortynnet til 200 ul ved å bruke 0,1 x Tris-EDTA-buffer (pH = 8). RT-PCR ble perfomed på VIIa 7 (Applied Biosystems, CA, USA) under anvendelse av 0,5 ul 20 x miRNA assay, 0,1 ul forforsterkeren produkt, 5,0 ul TaqMan PCR Fast Universal Master Mix (2⊥), 4,4 ul nuklease-fri vann var kombinert for en 10 pl PCR-reaksjon. Alle reaksjoner ble utført i tre eksemplarer og median inkludert i den endelige analysen.
Analyse
Data
Pre-prosessering.
Terskler for PCR-kjøringer ble satt ved hjelp av RQ Manager ( Applied Biosystems) og manuelt kontrolleres for å sikre at cT samsvarer med midtpunktet av den logaritmiske forsterkning. Alle observerte Ct verdier større enn 34 ble betraktet som ikke uttrykt og satt til 34. Eventuelle ubestemte Ct-verdier ble også satt til 34. Etter hvert Mir ble profilert i tre eksemplarer, ble noen replikatverdi mer enn 20% forskjellig fra de to gjenværende verdiene anses som en utligger og fjernet fra analysen. Gjennomsnittlig Ct-verdien ble deretter bestemt for hver prøve og Mir over replikater.
Normalisering.
RNU48 ble profilert i hver prøver som en endogen kontroll, men ble ansett som upassende for plasma som i de fleste prøvene det ikke er registrert (Figur 1a), anses upassende for urin som det var Mir med tredje høyest standardavvik (Figur 1b), og viste variabel uttrykk mellom høy risiko og lav-risikogrupper. Derfor geometriske gjennomsnittet normalisering ble brukt, til en normalisering vist være effektive i Mir PCR profilering [21]
a) Ct verdier for endogen kontroll på tvers av alle prøvene i plasma kohort. En CT av 34 anses usett. b) standardavviket Ct-verdier på tvers av prøvene for hver MIR i den opprinnelige urin kohort.
Differensial uttrykk analyse.
Det gjennomsnittlige Ct av prøver som tilhører høy risiko og lav -risk grupper ble brukt til å beregne ΔΔCt. Fold-endring ble beregnet som 2
-ΔΔCt. En student t-test ble brukt til å beregne betydningen av forskjellen mellom høy og lav risikogrupper og p-verdien ble justert for multippel testing korrigering bruker Benjamini-Hochberg metoden [22]
Feature utvalg og classifiaction .
Vi antar at dataene er gitt som en matrise, N funksjoner (Mirs) for
M
prøver ie og med etiketten vektoren anordnet på en slik måte at det for og for de øvrige prøvene. Vi har brukt to ulike metoder for valg /bestilling av funksjoner /Mirs fra mest til minst «diskriminerende». Den første metoden som ble brukt var den klassiske t-test, som avsettes til
i
-te funksjonen scorewheredenote midlene anddenote avvikene i
i
-te variabel for prøver av både grupper av interesse, henholdsvis. Deretter funksjonene er rangert i synkende rekkefølge av absolutte verdier av statistikken, for. Den andre teknikken, heter
tyngdepunktfunksjonen utvalg
, rangerer funksjonen i synkende rekkefølge av omfanget av forskjellen mellom hjelp av
i
-te variabel for prøver av begge grupper av interesse.
av ulike undergrupper av
t
topp egenskaper, genererte vi lineær classifiersfor en prøve, ved hjelp av en støtte vektor maskin algoritme, som valgte vekter
w
k
og skjærings
b
ved å minimere følgende funksjonelle: Her
C
er justerbar regularisering konstant, med en relativt svak innvirkning på det endelige resultatet i vårt tilfelle. Resultatene rapporteres har brukt
C
= 1.
Resultater
demografi og clinicopathological karakteristikk av lav risiko og høy-risiko pasienter i kohort 1 (oppdagelse kohort) i plasma og urin profilering armene er skissert i tabell 1.
mikroRNA profilering av plasma
de fleste miRNAs var på påvisbare konsentrasjoner i plasma hos pasienter med høy risiko prostata kreft og lav risiko prostatakreft (figur 2). Tre prøver viste generelt lave deteksjon priser og ble fjernet fra påfølgende analyse. Unsupervised clustering ble brukt på prøvene over de 12 Mirs profilerte i plasma for å finne ut om det var avstanden mellom høy risiko og lav-risikogrupper. Det syntes å være noen åpenbar skille mellom høy og lav-risikogrupper. Vi søkte en funksjon utvelgelsesprosedyre og testet ytelsen av de 12 Mirs for sin evne til å avgrense høyrisiko prostatakreft fra lav-risiko prostatakreft. Tabell 2 viser resultatene fra vår funksjon utvelgelsesprosedyre. Ved hjelp av både t-test og Tyngdepunktet funksjonen utvelgelsesprosedyre, ble miR16 valgt som mest forutsigbare funksjonen, viste imidlertid rangeringen ustabile resultater på tvers av alle Mirs. Figur 3 viser et ROC-kurve for miR16, som viser at MIR har generelt ganske dårlig ytelse med et areal under kurven på 0,62. Mens prediktiv, bestemte vi oss for denne forestillingen var ikke nok til å rettferdiggjøre ytterligere validering.
Prøvene har blitt utsatt for unsupervised hierarkisk clustering og resultatene er avbildet av dendrogram på toppen av bildet.
MIR-16 ikke nøyaktig forutsi sannsynligheten for å utvikle høy-risiko sykdom ved radikal prostatektomi (AUC = 0,62).
mikroRNA profilering av urin
Discovery kohort.
i screening urin, alle prøvene viste et påvisbart nivå av ekspresjon for de valgte Mirs (figur 4). Unsupervised clustering av prøvene på tvers av alle Mirs viste en moderat separasjon av lav-risiko og høy risiko prøvene (figur 4). Mirs 16, 20a, 21, 34a, 145, 106b, 182, 205, 221, 222, 331 og 375 ble oppdaget på et høyere nivå i høyrisikogruppen, mens MIR 218 ble oppdaget på lavere nivåer i urinen til høy risiko prostatakreftpasienter. Av disse Mirs alle, men Mir 218 var signifikant forskjellig mellom de høye og lave risikogruppene (q-verdi 0,1) som vist i tabell 3. ganger endring for mirnas, som ble betydelig oppregulert varierte fra 2,17 (MIR 145) til 8,09 (MIR 222) som vist i Tabell 3. for å bestemme minimalt sett med Mirs som viste best separasjon av høy og lav risikogruppene, vi brukte en funksjon utvelgelsesprosedyre som resultatene kan sees i tabell 4. Både t- test funksjonen utvelgelsesprosedyren og tyngdepunktet prosedyre valgt miR16 og Mir222 som de mest prediktive funksjoner. Utover dette, rangeringen av MIR ytelsen var ustabil. Vi valgte derfor Mir222 og miR16 for validering. I tillegg valgte vi også miR21. Selv om det ikke rangerer høyt på funksjonen utvelgelsesprosessen, valgte vi det som en funksjon som var egnet til å være uavhengig av Mir222 og miR16, som den minst korrelert Mir i klyngen inneholder Mir222 og miR16 (figur 4). Vi testet ytelsen av alle kombinasjoner av de 3 Mirs og alle tre kombinert viste den beste ytelsen av AUC = 0,75 (figur 5). Vi anses denne forestillingen tilstrekkelig for videre oppfølging og søkt en validering kohort.
Prøvene har blitt utsatt for unsupervised hierarkisk clustering og resultatene er avbildet av dendrogram øverst i bildet.
MIR 16, MIR 222 og Mir 21 forutsi høyrisiko prostatakreft med en AUC på 0,75.
Validering kohort.
demografi og clinicopathological karakteristikker av lav risiko og høy-risiko pasienter i kohort 2 (validering kohort) er skissert i tabell 5. valideringen ble kun foretatt for urin uttrykk som klassifikator for plasma uttrykk for miRNA gitt bare moderat ytelse.
Vi valgte MIR 16, 21 og 222 for validering i en uavhengig kohort av lav risiko og høy risiko prostatakreft. Vi har valgt en annen fremgangsmåte for profilering av mirnas i validerings kullet for å teste for robusthet, som beskrevet i fremgangsmåtene. For å teste for ensartethet av gjenkjenning på tvers av de to plattformene, profilert vi prøvene fra den opprinnelige kohorten på den nye plattformen og observerte korrelasjonen av Ct-verdiene mellom plattformene for de tre Mirs. Alle tre Mirs viste høy korrelasjon mellom plattformene (figur 6), og antyder at påvisning av disse Mirs var robust. Deres opptreden som predikator for høy risiko sykdom var også sammenlignbare på tvers av plattformer (figur 7, AUC = 0,72). Men som vist i tabell 6, i valideringen kohorten, fant vi at de tre mirnas ble overraskende oppdaget på lavere nivåer i høyrisikogruppen, sammenlignet med lav-risikogruppe: MIR 16 (FC = 0,07, q = 0,08 ), MIR 21 (FC = 0,14, q = 0,10) og Mir 222 (FC = 0,14, p = 0,10). Når klassifikator bygget på den opprinnelige kohorten ved hjelp av de tre Mirs ble brukt på validering årsklasse, oppnådde vi en forestilling av AUC = 0,35 (figur 7).
R
2 verdier representerer Pearson korrelasjon.
prostatakreftpasienter fra den opprinnelige kohorten (blå). Prostatakreftpasienter fra valideringen kohorten (rød).
Evaluering av metodikk for miRNA profilering.
For å vurdere om denne endringen i uttrykket mønster av miRNAs skyldtes metodisk forskjell, vi profilert for de tre mirnas med begge metoder på den opprinnelige funn kohort. Vi fant at bruk av begge metoder, ble alle tre mirnas oppdaget på høyere nivåer i høyrisikogruppen i den opprinnelige funn kohort. Sammenligning av uttrykk for disse tre mirnas med begge metoder på den opprinnelige kohorten viste god korrelasjon (Korrelasjonskoeffisient R
2 = 0,96 (MIR 16), R
2 = 0,91 (MIR 222) og R
2 = 0,86 (MIR 21)) som bekrefter at forskjellen observert skyldes en biologisk variasjon snarere enn metodisk variasjon.
Diskusjoner
å forutsi høyrisiko Cap fortsatt en utfordring, og dette underbygger vår nåværende overbehandling av biologisk ubetydelige kreft. For noen biomarkør for å være vellykket oversettes til den kliniske arena, må den tåle tilstrekkelig validering i uavhengige kohorter av pasienter og demonstrere metodologisk robusthet. I denne studien har vi understreket betydningen av å validere resultatene i en uavhengig kohort bruke alternative metodiske plattformer. I den opprinnelige kohorten, fant vi at MIR 16, 222 og 21 ble oppregulert i høy risiko prostatakreft sammenlignet med lav-risiko kreft og urin profilering av MIR 16, MIR 222 og MIR 21, var i stand til å skille mellom disse kreftformer som vil kunne ha en lat kurs fra de biologisk viktige kreft etter radikal prostatektomi. Men disse samme mirnas ble funnet å bli oppdaget på lavere nivåer i en uavhengig kohort av høyrisiko prostatakreft sammenlignet med lav risiko kreft. Dette er i motsetning til resultatene fra den opprinnelige kohort. Dermed profilering for disse mirnas i plasma eller urin, i vår studie, ikke robust skille mellom lav risiko og høy risiko cap.
Gitt at miRNA profilering bruke begge disse forskjellige metoder på den opprinnelige funn kohort ga lignende resultatene, er dette mest sannsynlig til å representere ekte biologisk variasjon i stedet for en forskjell på grunn av metodevariasjon. De TLDA kortene er en forholdsvis ny plattform for utførelse av PCR som ikke har vært utsatt for intens validering men har blitt brukt av mange grupper tidligere for kvantifisering av genekspresjon [23], [24], [25]. Profilering av MIR 16, 21 og 222 på prøvene i den opprinnelige kohort ved hjelp av de to forskjellige metoder viste at resultatene korrelerer godt. Dette bekreftet at eksperimentell metodikk var robust og resultatene er en indikasjon på en sann biologisk variasjon i uttrykket av disse miRNAs i de to uavhengige grupper.
Analysen av urin som et diagnostisk eller prognostisk verktøy er ikke enestående. Nivåer av protein, mRNA, miRNA og selv genet metylering i urinen har vært korrelert med kreft tilstedeværelse og aggresjon i tidligere studier [26], [27], [28], [29], [30]. I tillegg, andre har funnet urin for å være en bedre kilde til prostata materiale enn plasma [28]. Metoden for disse cellulære stoffene som når urinen er sannsynlig via transport av kreftceller gjennom prostata ductal systemet [30] eller exosomal vei [27].
Mange tidligere studier har studert reguleringen av miRNA arter i prostata kreftvev i forhold til benign prostata, høyverdig primære forhold til lavgradig eller metastatisk forhold til primær kreft [31], [32], [33]. I tillegg er mange av de som er involvert i sykdoms initiering, progresjon og metastase mirnas er funksjonelt karakterisert v [34], [35]. Nyere arbeider også profilerte miRNA arter funnet å være oppregulert eller nedregulert i plasma eller serum fra prostatakreftpasienter [10], [11], [12], [13], [36], [37]. Disse studiene har vist at spesifikke mirnas kan være nyttig for en ikke-invasiv prognostisk test, men bare ved hjelp av plasma eller serum. Få studier har profilert for mirnas i urin fra pasienter med prostatakreft. De har funnet at flere sirkulerende mirnas er differensielt uttrykt i prostata kreft [10], [11], [12], [13], [36], [37], [38]. Noen har funnet at MIR 26a, 30c og la 7 er differensielt uttrykt i plasma eller serum fra pasienter med prostatakreft i forhold til de som har benign prostatahyperplasi (BPH) [12], [36]. Andre har sammenlignet pasienter med lav risiko for høy risiko prostatakreft og på tvers av ulike studier MIR-141, MIR-375, MIR-221, MIR-21 og MIR-145 har vist seg å være forhøyet hos pasienter med høy risiko eller metastatisk prostatakreft [10], [11], [37], [38]. Mens MIR 222 ikke har vist seg å være betydelig prediktiv for høy-risiko sykdom i tidligere studier [39], er MIR 21 er vist å være forhøyet i mer aggressiv prostatakreft i noen studier [11], [37]. Shen et al fant at Mir 21 nivåer korrelert med prostatakreft Risk Assessment (CAPRA) scorer [11] og Agaoglu og kolleger fant at Mir 21 nivåer ble forhøyet hos pasienter med metastaserende svulster i forhold til de med lokalisert sykdom [37]. Tilsvar MIR 221 har vist seg å være forhøyet i begge disse studiene, men Mir 221 var ikke konsistent høyt i høyrisikosvulster i vår kohort.
Men disse studiene har gjentatte ganger gitt ulike miRNA signaturer til å risikere stratify prostata kreft på grunn i varierende eksperimentell metodikk, manglende robusthet av statistisk analyse og ikke-standardiserte definisjoner av høy risiko eller lav risiko prostatakreft. Vi har forsøkt å ta opp noen av disse problemene ved å bruke robuste statistiske metoder for analyse av resultater så vel som å bruke standardiserte definisjoner av lat (Epstein kriterier) og høy risiko sykdom. De fleste av de tidligere studiene har ikke tatt med validering av betydelige mirnas og dermed de mangler evne til å vise reproduserbarheten av data [11], [12], [13], [36], [37].
Et annet punkt som skal fremhevet er at prøvene i andre studier gjort så langt ble tatt fra pasienter når de hadde utviklet metastatisk sykdom. Mens dette gir innsikt i biologien for tumorprogresjon, betyr det ikke at risiko stratifisering av pasienter når de fortsatt har lokalisert sykdom og som sådan ikke har en umiddelbar klinisk implikasjon. Vår studie er romanen ved at alle plasma og urinprøver ble samlet inn før radikal prostatektomi og dermed på den tiden da risikovurderingen, utvalg for behandling og forutsigelse av pasienter er akutt.
Andre tester kommersielt tilgjengelige for risikovurderingen av prostatakreft er PCA3 og PHI test. Den PCA3 test, som er en urinbasert mRNA test, er mer spesifikk for prostatakreft enn PSA-test [30], [40]. Det har vist seg å være nyttig i å veilede beslutninger for prostatabiopsi basert på et kumulativt poengtall beregnes ved å måle ekspresjonen av prostatakreft genet mRNA. Mer nylig har det vist seg å være prediktive for «betydelig» prostatakreft som det var en signifikant forskjell i PCA3 score til pasienter som tilfredsstilte Epstein kriteriene for lat kreft [41] og «betydelig» kreft som ble ansett som passende for radikal prostatektomi. Den PHI test som måler en annen isoform av PSA, blir [-2] pro-PSA, har blitt funnet å være nyttig for å forutsi prostatakreft med Gleason score≥7 hos pasienter med PSA på 2-10 ng /ml, men er ikke forbundet med prostatavolum [42]. Men ingen av disse testene bidra til å finne de menneskene som sannsynligvis vil utvikle metastatisk sykdom etter radikal prostatektomi.
Det er noen begrensninger i denne studien som må være nummerert. Med ingen akseptert biologisk kontroll for mirnas i biofluids, har vi ikke normalisert våre resultater til en «vaktmester» genet. Flere endogene kontrollene brukes i vev profilering studier. Men når vi brukte RNU48 som en endogen kontroll, fant vi at dens uttrykk var ikke konsekvent i lavrisiko og høyrisikogrupper. Med en slik systematisk forstyrrelse i sin ekspresjon, det var uegnet som et endogent kontroll. Med tiden som mirnas studeres videre i biofluids, kan visse biologiske kontroller dukke opp. Dernest urin er en dynamisk kroppsvæske og konsentrasjoner kan forandre seg med væskebalansen og renal patologi. I vår studie Alle urinprøver ble oppsamlet umiddelbart før radikal prostatektomi dermed er det sannsynlig å være en høy grad av ensartethet i urinen sammensetninger. Måling 24-timers urinvolum vil være gullstandarden for å vurdere væskebalansen, men dette er arbeidskrevende, dyrt og nervøs med lav compliance priser i klinisk setting. Måling kreatinin forholdstall eller egenvekt fortsatt andre muligheter og potensielt mer gjennomførbare alternativer. Endelig vår utvalgsstørrelsen er liten.
For å konkludere, her har vi vist plasma og urin profilering av miRNAs kan ikke være en robust markør for forutsigelse av prostatakreft aggresjon og høy-risiko sykdom. Denne studien understreker viktigheten av å innlemme validerings kohorter og metodisk robusthet for å sikre reproduserbarhet av data i alle fremtidige biomarkør studier.
