Abstract
Eksponering av celler til ioniserende stråling (IR) induserer, ikke bare, aktivering av flere signalveier som spiller avgjørende roller i celle skjebne bestemmelse, men også endring av molekylære reaksjonsveier som er involvert i celledød eller overlevelse. Nylig har DNA-metylering blitt etablert som en kritisk epigenetisk prosess som er involvert i reguleringen av genekspresjon i kreftceller, tyder på at DNA-metylering inhibering kan være en effektiv kreftbehandlingsstrategi. Ettersom endringer av gen-ekspresjon ved hjelp av DNA-metylering har vært ansett for å påvirke radioresponsiveness, undersøkte vi effekten av en DNA-metyltransferase-inhibitor, 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-dC), på radiosensitiviteten. I tillegg undersøkte vi de underliggende cellulære mekanismene for kombinasjonsbehandlinger ioniserende stråling (IR) og 5-aza-dC i humane tykktarmskreftceller. Kolon kreftcellelinjer ble først testet for stråling følsomhet ved IR
in vitro
og ble behandlet med to forskjellige doser av 5-aza-dC. Overlevelse av disse cellelinjene ble målt ved anvendelse av MTT (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) og klonogene analyser. Effekten av 5-aza-dC sammen med bestråling på cellevekst, cellesyklusfordeling, apoptose, og apoptose-relatert gen-ekspresjon ble undersøkt. Kombinasjons bestråling behandling med 5-aza-dC avtatt betydelig vekst aktivitet sammenlignet med bestråling behandling alene eller med 5-aza-dC behandling alene. Prosentandelen av HCT116-celler i sub-G1 fase og deres apoptotisk hastigheten ble øket når cellene ble behandlet med bestråling i kombinasjon med 5-aza-dC, sammenlignet med behandling enten alene. Disse observasjonene ble sterkt støttet av økt caspase aktivitet, økt komethaler hjelp komet analyser, og økt protein nivåer av apoptose-forbundet molekyler (caspase 3/9, kløyvde PARP). Våre data viser at 5-aza-dC forbedret radiosensitiviteten i tykktarmskreftceller, og de kombinerte effekten av 5-aza-dC med stråling viste større cellulære effekter enn for enkelt behandling, noe som tyder på at kombinasjonen av 5-aza-dC og stråling har potensial til å bli en klinisk strategi for behandling av kreft
Citation. Kim JG, Bae JH, Kim JA, Heo K, Yang K, Yi JM (2014) kombinasjon Effekt av epigenetiske Regulering og ioniserende stråling i kolorektal kreft celler. PLoS ONE 9 (8): e105405. doi: 10,1371 /journal.pone.0105405
Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan
mottatt: May 25, 2014; Godkjent: 21 juli 2014; Publisert: 19 august 2014
Copyright: © 2014 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en National R D Program (50596-2014) gjennom Dongnam Institute of Radiological Medical Sciences finansiert av den koreanske departementet for utdanning, vitenskap og teknologi. Dette arbeidet ble også støttet av National Research Foundation (NRF) og departementet for vitenskap, IKT og Future Planning (MSIP), koreanske regjeringen, gjennom sitt National Nuclear Technology Program (2013M2A2A7043665). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epigenetikk er læren om arve endringer i genuttrykk eller cellulær fenotype forårsaket av andre enn endringer i de underliggende DNA-sekvenser mekanismer [1]. Den epigenetisk regulering av genekspresjon mediert av mekanismer som DNA-metylering, modifikasjoner av histoner, og posisjonering av den nucleosome langs DNA. Vanligvis spiller DNA hypermethylation en avgjørende rolle i inaktivering av gener som er involvert i cellesyklusregulering, DNA-reparasjon, apoptose, cellesignalering, transkripsjon, og andre cellulære prosesser [2].
Avvik i DNA metylering er ofte observert i mange forskjellige krefttyper [3], [4]. Spesielt stanse av tumorsuppressorgener eller andre kreftrelaterte gener ved avvikende DNA hypermethylation i promoter eller regulatoriske områder bidrar til tumorgenese [5], [6]. I motsetning til genetiske endringer, epigenetiske hendelser, inkludert DNA metylering, er reversible, slik at epigenetisk regulering ekstremt interessant fra synspunkt av å utvikle nye tilnærminger til terapi. DNA hypermethylation kan reverseres ved DNA-demethylating agenter. I tillegg kan DNA-metyltransferase (DNMT) inhibitorer gjenopprette ekspresjonen av gener slås av ved DNA-metylering. I de siste årene har DNMT inhibitor, 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-dC), har vist seg å ha anticancer aktivitet hos pasienter med leukemi, myelodysplastisk syndrom, og flere solide tumorer [7], [8] . Selv om en enkelt epigenetisk behandling ikke har vist signifikante reaksjoner mot de fleste faste tumorer [9], prekliniske studier tyder på at en kombinasjon av epigenetiske modifiserende midler, slik som DNMT hemmere eller histondeacetylase inhibitorer kan være effektive. I tillegg kan kombinasjoner av disse epigenetiske modifiserende midler med konvensjonelle kjemoterapeutika også være effektive. Derfor er disse typer av kombinasjonsbehandlinger som blir undersøkt i kliniske forsøk [10], [11]. Imidlertid har noen rapporter undersøkt Radiosensitivity forbundet med eksponering for 5-aza-dC [12] – [15]. Nylig har det vært økende interesse for strategier bruker stoffer som regulerer cellulær Radiosensitivity å øke svulst Radiosensitivity. Derfor, i denne studien rapporterer vi det terapeutiske potensialet i å kombinere 5-aza-DC med ioniserende stråling (IR) for å øke radiosensitiviteten i kolorektal carcinoma celler og undersøke de cellulære mekanismene bak disse effektene.
Materialer og metoder
Cell kultur og 5-aza-dC behandling
den menneskelige kolorektal kreft cellelinjer: HCT116, SW480, Colo320, og RKO, som ble hentet fra American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA), så vel som en dobbel-knockout-celler (DKO) for DNA-metyltransferase-1 og DNA-metyltransferase-3b i HCT116-cellelinjen [16], som beholder mindre enn 5% genomisk DNA-metylering, ble dyrket ved 37 ° C med 20 % O
2 og 5% CO
2. De HCT116, DKO og SW480 celler ble opprettholdt i McCoys 5A medium (WelGENE, Daegu, Sør-Korea). Colo320-celler ble holdt i RPMI-medium (WelGENE). RKO celler ble holdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) (WelGENE) inneholdende 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT, USA) og 1% antibiotisk-antimykotisk (Gibco, Grand Island, NY, USA). Cellene ble behandlet med 5-aza-DC (0,5 eller 1 mikrometer, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Én gang daglig i 3 dager (Figur S1)
ioniserende stråling (IR) eksponering
celler ble behandlet med 5-aza-dC i 3 dager eller ikke-behandlede kontrollceller ble utsatt for gammastråler fra en
137Cs strålekilde (Eckert Ziegler, Berlin, Tyskland) ved en dose hastighet på 2,6 Gy /min. Etter bestråling i doser på 2, 5 og 10 Gy, ble cellene inkubert i 3 dager ved 37 ° C, 20% O
2, og 5% CO
2.
klonogene assay
HCT116, SW480, RKO, Colo320, og DKO celler ble sådd i 6-brønners plater (5000 celler /brønn) og behandlet med 5-aza-dC og IR. Celler ble dyrket i 2 uker. Dyrkningsmediet ble erstattet med friskt medium hver 2. dag. Koloniene ble fiksert og farget med 1,25% krystallfiolett, grundig vasket for å fjerne overflødig fargestoff, og avbildes med en MultiXpress C9250ND scanner (SAMSUMG, Seoul, Korea). Kolonier med 50 celler /koloni ble talt ved hjelp av Image-Pro Plus 7.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA)
celleproliferasjon og celle levedyktighet analyser
Celleproliferering var. bestemt ved anvendelse av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay. Celler (2 x 10
5-celler /brønn) ble sådd ut i 6-brønns plater og inkubert ved 37 ° C. Etter 48 timer ble cellene vasket to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS), og 5 mg /ml MTT i PBS ble tilsatt til hver brønn i 4 timer. Etter fjerning av MTT-oppløsning, en oppløsning oppløsning (dimetylsulfoksyd /etanol, 01:01) ble tilsatt til hver brønn for å oppløse de formazankrystaller. Absorbansen ved 570 nm ble målt ved anvendelse av en Paradigm mikroplateleser (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). HCT116-celler som ble behandlet med 5-aza-dC og /eller bestråling ble sådd ut ved en konsentrasjon på 5 x 10
4 celler /brønn på 6-brønners plater. Etter 24, 48, 72 og 96 timer, ble cellene høstet, fortynnet med en Trypan blå arbeidsoppløsning, og tellet for å generere en vekstkurve.
Tumorvekst analyse
in vivo
evaluering av tumorvekst, vi brukte en subkutan tumor-bærende SCID-mus xenograft modell generert ved å infisere celler. Kvinne C.B-17 SCID-mus ble kjøpt fra sentral Lab. Dyr (Seoul, Korea). Seks uker gamle hunnmus ble delt inn i forsøksgruppene (n = 3 i hver gruppe). Mus ble injisert subkutant i høyre side av ryggområdet med 5 × 10
6 celler fortynnet i 100 mL PBS. Tumorvolumene ble målt en gang per uke. Tumor volum ble beregnet ved hjelp av følgende ligning: (kort akse)
2 × (lang akse) × 0,5
flowcytometrisk analyse
Cellesyklus analyse ble utført med propidiumjodid (PI. ). Cellene ble trypsinert, vasket med PBS og fiksert i 75% etanol ved 4 ° C i 1 time. Før analyse ble cellene vasket en gang med PBS, suspendert i en kald PI løsning med 1 mg /ml RNase og inkubert i mørke i 30 minutter ved romtemperatur. Flowcytometri analyse ble utført ved hjelp av en FACScan instrument (BD FACSAria, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Apoptose av behandlede celler ble vurdert ved hjelp av en Annexin V /FITC apoptose Detection Kit (BD Biosciences). Kort sagt ble alle cellene sådd ut og behandlet i 100 mm skåler. Deretter ble cellene vasket to ganger med kald PBS. Cellene ble farvet med fykoerytrin (PE) annexin V og 7-amino-actinomycin og inkubert i 15 min i mørket. Etter farging, ble bindingsbuffer tilsatt til cellene, som ble analysert ved hjelp av FACScan-instrument. FACSDiva programvare (BD Biosciences) ble anvendt for dataanalyser.
Caspase 3/7 aktivitetsanalyse
For caspase 3/7 aktivitetsanalysen, celler (5 x 10
3-celler ) ble podet med 100 ul av McCoys 5A medium inn i en 96-brønns plate. Etter 24 timers inkubering, 100 ul av Caspase-Glu 3/7 assay kit (Promega, Madison, WI, USA), substrat og buffer blanding ble tilsatt til hver brønn. Cellene og løsningene ble blandet forsiktig i 30 minutter og inkubert ved romtemperatur i 1 time i mørke. Fluorescens-aktivitet ble målt ved anvendelse av et luminometer (Atto, Tokyo, Japan). Alle analysene ble gjentatt tre ganger og inneholdt negative kontroller.
DNA-skader analysen
DNA-skade ble bestemt ved hjelp av OxiSelect Comet Assay Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA). 5-aza-DC- og /eller IR-behandlede HCT116-celler (1 x 10
5) ble blandet med lavt smeltepunkt agarose (01:10 forhold), og deretter komet lysbildet ble fylt med 75 ul blandingen. Platene ble inkubert ved 4 ° C i 30 minutter og deretter neddykket i lyseringsbuffer ved 4 ° C i mørket i 1 time. Den lyseringsbuffer ble deretter aspirert fra objektglass og objektglass ble neddykket i alkalisk oppløsning ved 4 ° C i mørke i 30 min. Deretter for å fjerne den alkaliske oppløsning, ble objektglass som er lagret i Tris-acetat-EDTA (TAE) -buffer i 5 min. Glassene ble anbragt i en horisontal elektroforese kammer og underkastet elektroforese med TAE-buffer ved 25 V i 20 minutter. Skinnene ble tørket og farget med DNA fargestoff (CELL Biolabs). Komethaler ble oppdaget under et fluorescerende mikroskop (Nikon, Tokyo, Japan).
Western blot analyse
Celler ble lysert i lyseringsbuffer, og totale cellelysater som inneholder like mengder proteiner ble lastet inn 4-12% geler og natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese og deretter overført til polyvinylidendifluorid membraner (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ USA). Membranene ble blokkert med 5% melk oppløst i PBS inneholdende 0,02% Tween-20 og inkubert over natten ved 4 ° C med spesifikke primære antistoffer. Membranene ble deretter inkubert med spesifikk pepperrot peroksidase konjugerte sekundære antistoffer. Proteinbånd ble visualisert ved anvendelse av en Fusion FX5 system (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Tyskland). Følgende primærinnsidere antistoffer ble brukt: anti-spaltet caspase 3 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-spaltet caspase 9 (Cell Signaling Technology), anti-spaltet PARP1 (Cell Signaling Technology), anti-Survivin (Abcam , Cambridge, MA, USA), anti-p53 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), og anti-α-aktin (Sigma-Aldrich).
Statistisk analyse
resultatene var presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av Student
t
-test. En
P
-verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Etikk erklæringen
Alle dyr protokollene som brukes i denne studien ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk Utvalget ved Dongnam Institute of Radiological Medical Sciences (dirams-IACUC-11-005).
Resultater
Effekter av 5-aza-st på Radiosensitivity av kolorektal kreft cellelinjer
For å finne ut om fem -aza-dC forbedrer cellular følsomhet for IR, tykktarmskreft cellelinjer HCT116, SW480, RKO, Colo320, og DKO ble utsatt for 5-aza-dC på to forskjellige doser (0,5 mikrometer og en mikrometer) i 72 timer før de blir utsatt for tre forskjellige doser (IR-2 Gy, 5 Gy og 10 Gy) (figur S1). Deretter ble en klonogene-målingen ble utført som viser at 5-aza-dC kunne radiosensibilisere alle de tykktarmskreft cellelinjene som ble testet, og kombinasjonen av 5-aza-dC og IR var bedre enn behandling enn 5-aza-dC alene. DKO celler, genetisk hemme DNMT1 og 3b, viste også vekst undertrykkelse av IR med doseavhengig måte (figur 1A).
(A) klonogene analyse av HCT116, SW480, Colo320, og RKO celler behandlet med 5-aza -DC (0,5 og 1 mm) og /eller IR (2 Gy, 5 Gy og 10 Gy). Klonogene analyse av bestrålt (2 Gy, 5 Gy, og 10 Gy) DKO celler. Celler ble sådd ut i 6-brønns plater (5000 celler /brønn) og behandlet med 5-aza-dC /IR. Etter 2 uker, ble kulturene fiksert med etanol og farget med 1,25% krystallfiolett. Fotografier av enkeltkolonier er også vist. (B-E) Overlevelse fraksjon (SF) av HCT116 /DKO (B), SW480 (C), Colo320 (D) og RKO (E) celler behandlet med 5-aza-dC (0,5 og 1 mm) og /eller ioniserende stråling (IR, 2 Gy, 5 Gy og 10 Gy). SF ble beregnet som gjennomsnitt kolonier /seeded celler. Dosen forbedring forholdet ble beregnet som forholdet mellom den SF kurve oppnådd ved behandling med en kombinasjon av 5-aza-dC og IR den som oppnås ved behandling med IR alene. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik for tre uavhengige eksperimenter.
P
-verdier ble beregnet ved hjelp av Student
t
-test. *
P
0,05; **
P
0,01; ***
P
. 0,001
Stråling overlevelseskurver ble generert for hver cellelinje behandlet med 5-aza-DC og IR å forstå om bestråling kan sensibilisert av 5 -aza-st i tykktarmskreft cellelinjer (figur 1B-E). Ved hjelp av den dose som er nødvendig for å generere en overlevelsesfraksjon (SF) på 0,5 som en referanse, ble dose forsterkning priser (grensene) beregnet. Celler ble behandlet med 5-Aza-dC i 72 timer før bestråling viste en økning i radiosensitiviteten, med en DER av: 1,19 (0,5 uM 5-aza-dC) og 1,41 (1 uM 5-aza-dC) i HCT116-celler, 1,23 (0,5 uM 5-aza-dC) og 1,42 (1 uM 5-aza-dC) i SW480-celler, 1,23 (0,5 uM 5-aza-dC) og 1,28 (1 uM 5-aza-dC) i Colo320-celler, og 1,14 (0,5 uM 5-aza-dC) og 1,31 (1 uM 5-aza-dC) i RKO-celler (figur 1 B-E). Våre data antydet at en lavere dose av 5-aza-dC kunne radiosensibilisere kolorektal kreftceller. Fordi 1 uM 5-aza-dC eller 10 Gy av IR er cytotoksisk, forholdsvis lave doser av 5-aza-dC (0,5 uM) og IR (2 Gy og 5 Gy) ble valgt for videre studier for å undersøke effekten av å kombinere en DNMT inhibitor, 5-aza-dC og IR.
kombinasjonen av fem-aza-dC og IR indusert veksthemming i tykktarm kreft celler
Vi analyserte celleproliferasjon i HCT116-celler behandlet med 5 -aza-dC eller IR alene eller med kombinasjonen av 5-aza-dC og IR. Vekstkurvene viste at behandling med en kombinasjon av 5-aza-dC og IR (2 Gy og 5 Gy) resulterte i statistisk signifikant veksthemming i HCT116 og SW480-celler ved hvert tidspunkt undersøkes (24, 48, 72, og 96 h ) sammenlignet med den i kontrollceller, i celler kun behandlet med 5-aza-dC, eller i celler behandlet med kun IR (2 Gy og 5 Gy) (figur 2A;
P
0,05). I tillegg ble det gjennomført MTT-assayet i begge HCT116 og SW480-celler som var blitt behandlet med eller uten 5-aza-dC (0,5 uM), og deretter bestrålt dem med 2, 5 og 10 Gy, respektivt. Absorbansen fra analysen utført på celler behandlet med en kombinasjon av 5-aza-dC og IR var signifikant lavere (
P
0,05) enn det fra celler behandlet med 5-aza-dC eller IR alene ( figur 2B). Vi utførte også vekstkurve analyse og MTT-assayet i DKO-celler, som også viste en reduksjon av veksthemming, samt spredning, avhengig av strålingsdosen (figur 2A og B). Således indikerer disse resultater at effekten av 5-aza-dC og IR for veksthemming er additiv. Basert på vår
in vitro
data med betydelig veksthemming i celler behandlet med kombinasjonen av 5-aza-DC og IR, vi var interessert i å bestemme om disse effektene kan observeres
in vivo
. For dette formål ble HCT116-celler eksponert for 5-aza-dC (0,5 pM) i 72 timer før eksponering til IR (2 Gy og 5 Gy), og deretter ble subkutant injisert i SCID-mus. Figur 2C viste signifikant forsinket tumorvekst med kombinasjonen behandling av 5-aza-dC og IR (2 Gy og 5 Gy) sammenlignet med enkelt behandling med enten 5-aza-dC eller IR. I tillegg er volumet av xenotransplantater fra celler behandlet med både 5-aza-dC og IR var redusert sammenlignet med dem fra celler behandlet med enten 5-aza-dC eller IR alene.
(A) Cellevekst kurver oppnådd ved anvendelse av 0,5 uM 5-aza-dC og to forskjellige strålingsdoser (2 Gy og 5 Gy) i tykktarmskreftceller (HCT116, DKO og SW480) og (B) MTT-analyser i tykktarmskreftceller behandlet med 5-aza-dC (0,5 mm) og /eller bestråling (2 Gy og 5 Gy). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av triplikat eksperimenter. (C) Tumorvekst følgende 5-aza-dC (0,5 uM) behandling og /eller bestråling (2 Gy og 5 Gy) i SCID-mus. HCT116-celler (5 x 10
6-celler) som var blitt behandlet med 5-aza-dC (0,5 uM) og bestrålt (2 Gy og 5 Gy) ble injisert subkutant inn i SCID-mus (n = 4), og den gjennomsnittlige tumorstørrelse ble målt en gang i uken i 7 uker.
P
-verdier ble beregnet ved hjelp av Student
t
-test. *
P
0,05; **
P
. 0,01
For å belyse mekanismene for veksthemming av 5-aza-dC, IR, og kombinasjonsbehandling, brukte vi flowcytometri analyse for å fastslå hvorvidt veksthemming assosiert med cellesyklus endringer. Cellesyklusfordeling analyse viste at andelen av behandlede celler i G1, S og G2-M-fasene var ikke forskjellig fra kontrollcellene, bortsett fra at det var en økning i andelen av celler i sub-G1 fase, noe som tyder på en økning i apoptose (figur 3). Andelen av HCT116-celler behandlet med 5-aza-dC eller IR (2 Gy) alene i sub-G1 fase av celler var åtte ganger (5-aza-dC), to ganger (IR, 2 Gy), og fire gangers (5 Gy) som er større enn den for kontrollceller og over åtte ganger større i celler behandlet med 5-aza-dC og IR enn i kontrollceller. Interessant, i motsetning HCT116 cellene, SW480 celler viste G2 /M arrest etter IR alene (2 Gy og 5 Gy) sammenlignet med kontroller [2-Gy G2 /M fraksjon: 46,77% (vs. 28,03% i kontrollceller); 5 Gy G2 /M fraksjon: 58,88% (vs. 22,03% i kontrollceller)]. Imidlertid sub-G1 fase av celler behandlet med 5-aza-dC eller IR (2 Gy) alene var seks ganger (5-aza-dC), to ganger (2 Gy), og syv ganger (5 Gy) som er større enn kontrollceller og et over 19-ganger økning i celler behandlet med 5-aza-dC og IR enn i kontrollcellene. Vi bekreftet også at sub-G1 fasen av celler bestrålt med 2 Gy eller 5 Gy sammenlignet med kontrollceller ble økt i DKO celler. Derfor konkluderer vi at veksthemmende effekten av 5-aza-dC eller IR er på grunn av en økning i apoptose.
Colon kreft celler (HCT116, DKO og SW480) behandlet med 5-aza-DC (0,5 uM) og /eller bestråling (2 Gy og 5 Gy) ble farget med propidiumjodid og analysert ved hjelp av en FACS strømningscytometer. Søylene viser andelen av celler i hver celle syklus fase. Svart kolonne, sub-G1 fase; lyse grå kolonnen, G1 fase; mørk grå kolonnen, S fase; hvit kolonne, G2-M fasen.
Kombinasjonen av fem-aza-DC og IR bidrar til induksjon av apoptose i tykktarm kreft celler
For å klargjøre induksjon av apoptose ved 5-aza-dC kombinert med IR i HCT116 og SW480 celler, celler ble dobbel farget med fluoresceinisotiocyanat-merket annexin V og PI. Nivået av apoptose indusert ved 5-aza-dC kombinert med IR var større enn den ved IR (1,7 ganger for to Gy eller 1,8 ganger for 5 Gy) eller 5-aza-dC alene (mer enn 2,4 ganger) i HCT116 celler. Interessant, observerte vi tilsvarende resultater i forhøyede apoptose nivåer fremkalt av kombinasjonsbehandling med 5-aza-dC og IR sammenlignet med IR (3,4 ganger for to Gy eller 2,4 ganger for 5 Gy) eller 5-aza-dC ( 1,5 ganger) alene SW480-celler (figur 4A). Videre undersøkte vi de cellulære mekanismene bak de apoptotiske effekten av kombinasjonen av 5-aza-DC og IR. En av de mest vanlige signalkaskader som er involvert i apoptose er aktiveringen av den svært apoptose spesifikk familie av kaspaser, som, når aktivert, initiere celledød ved spalting og aktivering av effektorceller caspaser kjøre apoptose [17]. For å avgjøre om caspases medierte effekten av 5-aza-DC og IR, målte vi aktiviteter caspases 3 og 7, som er viktige effektorer for apoptose i pattedyrceller [18]. I begge celleekstrakter som ble behandlet med 5-aza-dC og IR, enten alene eller i kombinasjon, ble aktivitetene til kaspasene 3 og 7 sterkt øket i celler behandlet med 5-aza-dC og IR (2 Gy og 5 Gy) sammenlignet med de i celler behandlet med IR- eller 5-aza-dC alene (figur 4B). Disse resultatene stemmer overens med økt apoptose forårsaket av kombinasjonsbehandling av 5-aza-dC og IR og er vist i figur 4A. I begge analysene ble DKO-celler også vist å øke nivået av apoptose ved IR. Disse resultatene er sterkt understøttet av lengre komet haler observert i komet analysen, noe som indikerer større mengde av cellulær DNA-skade i celler behandlet med en kombinasjon av 5-aza-dC og IR sammenlignet med kontrollceller eller celler som ble behandlet med 5-aza-dC eller IR alene (figur 4C og D).
(A) nivåene av apoptose ble målt ved anvendelse av annexin V og 7-amino-actinomycin og analysert ved bruk av en FACS strømningscytometer. Nivåene av apoptose i HCT116, DKO og SW480-celler ble behandlet med 5-aza-dC (0,5 uM) og /eller bestråling (2 Gy og 5 Gy) ble uttrykt som prosentandeler av den totale cellepopulasjon på både de tidlige og sene stadier av apoptose. (B) Aktiviteten av caspaser 3 og 7 ble bestemt ved bruk av Caspase-Glo-analyse og var representert som prosentandeler av HCT116, DKO og SW480-celler ble behandlet med 5-aza-dC (0,5 uM) og /eller bestråling (2 Gy og 5 gy) sammenlignet med ubehandlede celler. Diagrammet representerer data (gjennomsnitt ± standardavvik) fra tre uavhengige eksperimenter. (C) Representative mikrografer av fluorescerende DNA flekken ved hjelp kometen analysen. DNA fragmentering av kometen analysen i HCT116, SW480 og DKO celler behandlet med 0,5 mikrometer 5-aza-DC og /eller bestråling (2 Gy og 5 Gy). (D) Kvantifisering av DNA-skadede celler som representerer gjennomsnittet av tre tilfeldige mikroskopiske felt per prøve, og de Feilstolpene representerer ± standardavvik. NS indikerer ikke signifikant.
P
-verdier ble beregnet ved hjelp av Student
t
-test. *
P
0,05; **
P
. 0,01
Kaspaser 3 og 9 er også kjent for å være involvert i stråling-indusert apoptose [19]. Derfor brukte vi western blotting for å bekrefte aktiveringsnivå caspases 3 og 9 i celler behandlet med 5-aza-DC og /eller IR. Figur 5 viser et høyere nivå av aktiverte caspaser 3 og 9 i HCT116, DKO og SW480-celler ble behandlet med 5-aza-dC eller IR alene sammenlignet med dem i kontrollceller. Interessant, western blotting, i tre, testet kolon kreftcellelinjer, viste at protein nivåer av caspaser 3 og 9 ble også øket i celler behandlet med en kombinasjon av 5-aza-dC og IR sammenlignet med celler behandlet med enten middel alene eller kontroller celler. Nivået av spaltet PARP1, som er en annen viktig effektor av apoptose-induksjon [20], [21], ble også øket i celler behandlet med 5-aza-dC eller IR alene, sammenlignet med kontrollceller, og enda mer øket i celler behandlet med en kombinasjon av 5-aza-dC og IR. I motsetning til dette ble protein ekspresjonsnivåene av Survivin redusert i celler behandlet med 5-aza-dC og IR alene og i kombinasjon sammenlignet med dem i kontrollceller. I tillegg, testet vi nivået av p53 i tillegg. Interessant, økt p53-ekspresjon nivået i celler behandlet med en kombinasjon av 5-aza-dC og IR enn i celler behandlet med 5-aza-dC alene. Denne informasjonen er avtalen med forrige rapport som er celler som uttrykker vill type p53 er bedre sensitive IR enn mutant type p53 [14]. Disse protein uttrykk mønstre ble bekreftet i bestrålte DKO celler. Til sammen tyder våre data på at kombinasjonen av 5-aza-dC og IR synergistisk induserer et høyere nivå av apoptose sammenlignet med enkel behandling ved bruk av 5-aza-dC eller IR i flere tykktarmskreftceller.
Western blot analyse for ekspresjon av apoptose-assosierte proteiner (spaltes kaspase-3, spaltes kaspase 9, spaltes PARP1, survivin, og p53) i HCT116 og SW480-celler ble behandlet med 5-aza-dC (0,5 uM) og /eller bestråling (2 Gy og 5 Gy), samt i bestrålte DKO celler, ved hjelp av kløyvde caspase 3, kløyvde caspase 9, kløyvde PARP1, survivin, og p53 antistoffer.
diskusjon
IR-stråling resultater i den samtidige aktivering eller nedregulering av flere signalveier som spiller viktige roller i celletype-spesifikke kontroll av overlevelse eller død. IR er et velkjent gentoksisk agent og karsinogen for mennesker som induserer celleskade gjennom direkte og indirekte mekanismer [22]. Nylig, har mange studier fokusert på molekyler og fremgangsmåter som påvirker responsen av celler til IR. Mange forskjellige typer av molekyler er kjent for å øke radiosensitiviteten ved å påvirke cellesykluskontrollpunkter, DNA-reparasjon, gentranskripsjon, og apoptose. De mest nylige studier har antydet at epigenetiske mekanismer som histon modifikasjon og DNA-metylering er assosiert med genet Slå og kan være involvert i regulering av radiosensitiviteten i kreftceller. En rekke tidligere studier har rapportert at mange histondeacetylase inhibitorer er cytotoksiske og kan sensibilisere tumorceller for strålebehandling. Imidlertid er snaut informasjon tilgjengelig om effektene av DNMT hemmere på bestrålingssensibilisering [13], [23]. Videre har 5-aza-dC vist seg å ha liten aktivitet i faste tumorer som et enkelt middel [24], [25], og lite er kjent vedrørende de molekylære og cellulære mekanismene bak Radiosensitivity indusert av epigenetiske inhibitorer. Ved å kombinere epigenetiske medikamenter med radioterapi er spesielt interessant i denne sammenheng, og har demonstrert forbedret effektivitet både
in vitro
og
in vivo
i flere faste tumorer [13] – [15], [26 ]. I den foreliggende studien undersøkte vi de cellulære effekter av DNMT inhibitor, 5-aza-dC, og IR, både alene og i kombinasjon, på tykktarmskreftceller. Har vi funnet at 5-aza-dC demonstrert additive effekter på veksthemming i kombinasjon med IR, noe som tyder på at 5-aza-dC kan være en nyttig bestrålingssensibilisator i colon cancer behandling. En ting som vi må vurdere ytterligere basert på våre resultater, DKO celler, genetisk modellsystem for hemming av DNA metyltransferase, ikke synes å ha mer sterk vekst undertrykkende effekt med IR enn å bruke farmakologiske modellsystem som vi behandlet 5-aza-dC med IR.
Siden våre resultater tyder på at denne effekten er mediert ved induksjon av apoptose, apoptose har tidligere blitt betraktet som en potensiell mekanisme for bestrålingssensibilisering. Flere forskjellige resultater er blitt rapportert angående radiosensitizing virkningene av DNMT inhibitorer. Dote et al. tidligere rapportert at kombinasjonen av IR- og zebularine ikke i betydelig grad øke apoptose [13]. I motsetning til dette, Qiu et al. viste at 5-aza-dC indusert bestrålingssensibilisering i visse magekreft cellelinjer og forårsaket en økning i apoptose, som ble ledsaget av økt uttrykk for
p53
,
RASSF1
, og
DAPK
genfamilier [14]. I vår studie, økte med 5-aza-DC nivået av apoptose i HCT116 og SW480 celler, et funn som var i overensstemmelse med resultater fra Qiu et al. Veldig interessant, Qiu et al. også foreslått at gastrisk kreft-cellelinjer som uttrykker villtype p53 er mer følsomme for kombinasjonsterapi med IR og 5-aza-dC sammenlignet med dem som uttrykker mutante p53. Den HCT116-cellelinjen anvendt i denne studien uttrykker villtype p53, og vi har observert at p53 nivået stiger som respons på 5-aza-dC behandling både med og uten IR. I tillegg økte p53-ekspresjon nivå i celler behandlet med en kombinasjon av 5-aza-dC og IR enn i celler behandlet med 5-aza-dC alene. Imidlertid, i motsetning til i HCT116-celler, ble ingen effekt vist på p53-nivå i SW480-celler, som uttrykker mutanten type p53 (figur 5). p53 er klassisk beskrevet som en formidler av IR cytotoksisitet og fungerer ved å fremme enten cellesyklus arrest eller apoptose [27], [28]. Tidligere studier har rapportert at 5-aza-dC induserer p53-ekspresjon, som er forbundet med inhibering av celleproliferasjon i villtype p53-celler, men ikke i mutante p53-celler i prostata kreft [29], [30]. Men fordi bare noen få cellelinjer og p53-assosierte molekyler ble undersøkt i disse studiene, er nødvendig videre forskning på en mulig sammenheng mellom 5-aza-DC med p53. Videre undersøkelser er også nødvendig for å identifisere ytterligere epigenetiske forandringer assosiert med Radiosensitivity. Det er begrenset studier på rollen til DNA-metylering i motstand til IR. En tidligere studie viste at behandling med 5-aza-dC forårsaker global hypometylering, som har en radiosensitizing effekt [23]. Derfor bør definitive studier bli utført for å bestemme hvorvidt IR har en effekt på område eller gen-spesifikke DNA-metylering i kreft (manuskript under forberedelse).
I denne studien, cellesyklusanalyse ble ikke signifikant endret ved enkelt
