Abstract
Forhøyede nivåer av den immunoregulerende cytokinet TGF-β1 i kreft og HIV-infeksjon har vært knyttet til undertrykkelse av beskyttende immunresponser. Den transkripsjonelle regulering av TGF-β1 er kompleks og fortsatt ikke fullstendig forstått. Vi rapporterer her for første gang at transkripsjonsfaktoren GLI2 regulerer ekspresjon av TGF-β1 i humane CD4
+ T-celler.
I silico
screening avdekket fem nye antatte GLI bindingssteder i menneske
TGF-β1
promoter. Minst to av disse områdene i den menneskelige
TGF-β1
promoter er regulert av GLI2 aktivator som knockdown av
GLI2
i regulatoriske CD4
+ CD25
hi T-celler, høye produsenter av TGF-β1, betydelig redusert
TGF-β1
transkripsjon. I tillegg naive CD4
+ T-celler, lave produsenter av TGF-β1, økt basal nivå av
TGF-β1
mRNA følgende lentiviral infeksjon med GLI2. Transkripsjonsregulering av
TGF-β1
av GLI2 er en ny utvidelse til Sonic Hedgehog (SHH) og
TGF-β1
cross-regulering og kan gi innsikt i skadelig heving av TGF-β1 fører til patogenesen i kreft og HIV-infeksjon
Citation. Furler RL, Uittenbogaart CH (2012) GLI2 Regulerer TGF-β1 i human CD4
+ T celler: implikasjoner i kreft og HIV patogenesen. PLoS ONE syv (7): e40874. doi: 10,1371 /journal.pone.0040874
Redaktør: Derya Unutmaz, New York University, USA
mottatt: 26 juli 2011; Godkjent: 18 juni 2012; Publisert: 31.07.2012
Copyright: © Furler, Uittenbogaart. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health AI-081636 og AI-028697 (University of California Los Angeles, Senter for AIDS Research), en Jonsson Comprehensive Cancer Center Seed Grant, og Stein Oppenheimer Endowment Award. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
transformerende vekstfaktor-β1 (TGF-β1) er en pleiotropisk cytokin som regulerer immunrespons hos mange sykdommer, inkludert kreft og HIV-infeksjon, og spiller en viktig rolle ved å forhindre patogenesen [1] – [5]. Den er produsert av en rekke celletyper, inkludert CD4
+ CD25
hi regulatoriske T-celler, makrofager, så vel som av fibroblaster. TGF-β1 minsker proliferasjon av T- og B-lymfocytter, effektorfunksjoner av mange celler i immunsystemet og induserer perifere regulatoriske T-celler [6]. Selv om TGF-β1 er viktig gjennom hele pattedyr utvikling og forhindre avvikende aktivering av vertens immunsystem, forhøyet ekspresjon av TGF-β1 kan fukte beskyttende immunrespons mot tumorer og infeksjoner.
Aberrant høy produksjon av TGF-β1 etter ondartede celler ble vist å øke metastase så vel som for å forhindre en beskyttende vertsimmunrespons mot tumorer [7]. Ved kronisk HIV-infeksjon, blir TGF-β1 forhøyet i flere avdelinger, inkludert lymfoide vev, blod og spinalvæske [8] – [10]. Økte nivåer av TGF-β1 kan indusere utvikling av induserte (i) Treg observert hos kronisk HIV-infeksjon [11], [12], og kan bidra til dysfunksjon av immunsystemet i løpet av sent stadium sykdom. HIV-1 Tat-protein induserer TGF-β1 i humane leukocytter [13] – [15], kondrocytter [16], og også i murine CD2
+ T-celler av et Tat-transgen musemodell [17]. Mekanismene for tumor-indusert og Tat-mediert TGF-β1 induksjon er ukjent. Kreft og AIDS er bare to av de mange sykdommer hvor TGF-β1 spiller en rolle i patogenesen.
ekspresjon av aktiv TGF-β1 er strengt regulert på transkripsjons, translatoriske, og post-translasjonelle nivåer. Selv TGF-β1 uttrykk har vært et fokus for intens etterforskning, er vi fortsatt langt fra å forstå dette cytokin komplekse regulering.
In silico
analyse av TGF-β1 promoter region angir flere antatte bindingsseter for kjente transkripsjonsfaktorer. Noen av disse transkripsjonsfaktorer, som Sp-1 og Zf9, er tidligere funnet å mediere
TGF-β1
transkripsjon, men disse faktorene alene er ikke tilstrekkelig til å indusere mRNA-ekspresjon [18], [19]. Derfor undersøkte vi hvilke andre transkripsjonsfaktorer induserer TGF-β1 mRNA.
Vi har funnet seks antatte bindingsseter (fem tidligere urapporterte) for de menneskelige GLI transkripsjonsfaktorer av
i silico
analyse av den menneskelige
TGF-β1
promoter. Den GLI2 transkripsjonsfaktor er en av de viktigste nedstrøms effektorer av sonic hedgehog (SHH) veien, noe som ble vist å spille en rolle i funksjonen av det adaptive immunsystemet [20], [21]. Den SHH pathway modulerer aktiveringen [22], spredning [23], [24], og cytokin regulering [25] i CD4
+ T-celler. Siden flere interaksjoner mellom TGF-β1 og Shh trasé eksisterer (tabell 1), fokuserte vi på regulering av TGF-β1 av SHH pathway familiemedlemmer, dvs. GLI proteiner i immunsystemet.
tilveiebringe bevis for at i det minste to av de seks mulige GLI-bindingsseter er nødvendig for GLI2-formidlet transkripsjonsregulering av menneske
TGF-β1
promoter. I det minste ett av disse to områdene må være funksjonell for å observere TGF-β1 regulering av GLI2. Videre, ved å banke ned
GLI2
i menneskelig CD4
+ CD25
hi treg, viser vi at GLI2 er nødvendig for TGF-β1 uttrykk. Transkripsjonsregulering av
TGF-β1
av GLI2 har ennå ikke blitt beskrevet og øker vår forståelse av kompleksiteten i
TGF-β1
regulering.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
ved bruk av anonyme perifert blod mononukleære celler for å få T-celler og epithelial 293T cellelinje ble anmeldt av UCLA Institutional Review Board (IRB), som konkluderte med at denne aktiviteten ikke innebære forsøkspersoner, og derfor ikke krever IRB gjennomgang eller sertifisering.
i Silico Screening
Screening for mulige GLI bindingsseter i menneske
TGF-β1
arrangører ble gjort av
i silico
analyse ved hjelp av programmet MatInspector (https://www.genomatix.de). Et utvalg av tjue kilobaser rundt det første mennesket
TGF-β1
promoter ble brukt til å screene for antatte transkripsjonsfaktorbindingssteder. Alle seks antatte GLI bindingsseter innenfor den første kilobase av
TGF-β1
promoter # 1 (fem potensielle områder) eller promoter # 2 (en potensiell område) hadde en matrise likhet poengsum er lik eller større enn 0,8. Bindingssteder innenfor den første proksimale promoter-regionen er roman og er fokus for denne studien
Luciferase Arrangøren Studier
Den menneskelige
TGF-P1
promoter-luciferase reporter konstruksjoner, phTG5 og phTG1, ble vennlig levert av S.J. Kim [18]. Villtype phTG5 konstruksjonen ble mutert ved putatitve GLI bindingsseter (reiser A, B eller A og B) med seterettet mutagenese (SITE A: 5′-CAGCCCCCCCATGCC-3 «til 5» CAGCaaCaaaATGC-3 «, SITE B: 5»-GAGCCCGCCCACGCGA-3 «til 5» GAGCaaGaaaACGCGA-3 «, muterte baser i små bokstaver). Villtype phTG1 konstruksjonen ble mutert ved antatte GLI bindende nettstedet E hjelp seterettet mutagenese (SITE E: 5»-CCCACCACCCACGAA-3 «til 5’CCaAaaAaaaACGAA-3», mutert baser i små bokstaver). Villtype-promotoren, de muterte promotere, eller en tom pGL3-vektorkontroll ble individuelt co-transfektert med den konstitutive aktivator vektoren pGLI2ΔN (vennligst tilveiebrakt av E. Roessler [26]), eller kontroll pcDNA3 med Lipofectamine 2000 ved anvendelse av standardprosedyrer inn i 293T-celler, en human epitelial cellelinje inneholdende Adeno og SV-40 virus-DNA-sekvenser, erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC). Den pGLI2ΔN plasmidet inneholder et konstitutivt aktiv GLI2 gen på grunn av en amino-terminal trunkering. Den amino-terminale domene av det humane GLI2 genet har en undertrykkende funksjon, og det er fjernelse har vist seg å øke transkripsjonen av nedstrøms målgener for eksempel GLI1 [26]. Den 293T cellelinje ble valgt på grunn av sin transfeksjon effektivitet og lave nivåer av GLI1 uttrykk, som er vår avlesning for GLI2 aktivering. Luciferaseekspresjon ble målt til 48 timer etter transfeksjon
Cell Isolation, Kultur, Stimulering
naive CD4
+ T-celler, uttrykker CD4, CD31, CD45RA, og CD62L, ble renset og isolert fra humane perifere mononukleære blodceller (PBMC) med negativ seleksjon. CD4
+ CD25
hi regulatoriske T-celler ble beriket av humant blod ved hjelp RosetteSep og Robosep kits fra Stem Cell Technologies. Primære celler ble dyrket i serumfritt medium bestående av Iscoves modifiserte Dulbeccos medium supplert med delipidert BSA (Sigma-Aldrich) i 1100 ug /ml, human transferrin (Sigma-Aldrich) på 85,5 ug /ml, 2 mM glutamin og penicillin /streptomycin ved 25 U /25 ug /ml. Alle stimulering forhold primære T-celler var ferdig med aCD3 /αCD28 belagt M-450 perler fra Invitrogen. Celleoverflate og intracellulære immunophenotypes ble validert ved strømningscytometri, som beskrevet tidligere [27]. For påvisning av intracellulære foxp3 ble cellene først farget for celleoverflatemarkører, faste og permeabilized med eBioscience anbefales buffere følge produsentens instruksjoner, og deretter inkubert med FITC eller eFluor 450 konjugerte monoklonale antistoffer mot foxp3 (eBioscience, klone PCH101).
siRNA Knockdown
knockdown av
GLI2
i primære humane regulatoriske T-celler ble gjort ved hjelp ACCELL siRNA utviklet og validert av ThermoFisher /Dharmacon. En ikke-målsøkende siRNA ble anvendt som en negativ kontroll. En positiv kontroll siRNA for GAPDH ble brukt til å bekrefte knockdown. Knockdown av GLI2 ble gjort ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig og validert siRNA fra Dharmacon (A-006468-14 – Target sekvens – 5 «GGUUUGAAUCUGAAUGCUA 3»). En egen uavhengig negativ kontroll ved hjelp av en egge
GLI2
siRNA sekvens (5’AAGGUAUGCGCUUAAUUU-3 «) ble brukt til å ta off-target effekter.
GLI2
knockdown ble bekreftet ved å vurdere
GLI1
mRNA uttrykket etter stimulering. GLI1 har tidligere vist seg å være transciptionally regulert av GLI2 og er positiv kontroll for
GLI2
knockdown.
Purified CD4
+ CD25
hiFoxP3
+ regulatoriske T-celler ble inkubert med den siRNA og serumfritt medium ACCELL (Dharmacon) i 72 timer før stimulering med aCD3 /αCD28 belagte perler. Tjuefire timer etter stimulering ble cellene samlet for å måle
TGF-P1
mRNA nivåer ved RT-PCR. TGF-P1 nivåer ble normalisert til
18S rRNA Hotell og forhold til ustimulerte celler.
RT-PCR
TaqMan Gene Expression primer /probe sett for
TGF-β1 , GLI1
, 18S rRNA, og
GAPDH
fra Applied Biosystems Inc. ble brukt til å måle transkripsjoner nivåer i ulike forhold. Uttrykket av
TGF-β1, GLI1
, og
GAPDH
ble normalisert til 18S rRNA-nivåer og relative uttrykk mellom forholdene ble beregnet til å vurdere oppregulering /nedregulering av transkripsjon.
lentiviral Infeksjoner
GLI2ΔN
transgen ble plassert i en tredje generasjons HIV-1 vektor ved UCLA Vector Core. Størstedelen av den HIV-virus kodende sekvensen ble fjernet og erstattet med transgenet. De LTR ble modifisert for å være «selv-inaktiverende», og transkripsjonen av vektorgenomet i pakkingscellene ble drevet av en ikke-HIV-promoteren. Virus ble gjort ved hjelp av 293T-celler som er ko-transfektert med vektorplasmidet og andre tre plasmider som koder for A) de virale enzymer og strukturelle proteiner, bortsett fra Env, B) Rev, som er involvert i HIV RNA transport, og C) VSV glykoprotein, som er en pan-tropisk konvolutt som gjør at viruset er trådt i nesten hvilken som helst celletype. naive CD4
+ T-celler ble infisert med 100 ng p24 per million celler i serumfritt medium i 96 timer. RNA ble isolert for bestemmelse av forandringer i gen-ekspresjon ved hjelp av RT-PCR. et GFP-inneholdende lentivirus ble anvendt som en negativ kontroll og også for å måle infeksjon effektivitet.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip)
ChIP analyse ble gjort for å finne ut om GLI2 binder til
TGF-β1
promoter. Regulatory CD4
+ CD25
hi T-celler ble negativt isolert som beskrevet ovenfor. cellene ble stimulert med aCD3 /αCD28-belagte perler over natten. Den GLI2 ExactaChIP kit (R 3D).
CD4
+ CD25
+ foxp3
+ treg ble beriket fra PBMC og deretter inkubert i 72 timer med non-targeting (NT) eller
GLI2
siRNA. Cellene ble deretter stimulert (1 aCD3 /αCD28 perle: en celle) i ytterligere 24 timer. RT-PCR ble anvendt for å måle
TGF-ß1
mRNA-nivåer. Relativ
TGF-β1
eller
GLI1
mRNA ble normalisert til 18S rRNA. (A)
GLI2
knockdown i Treg betydelig redusert
TGF-β1
transkripsjon (n = 7, * p = 0,0189). (B)
GLI1
mRNA ble også målt som en kontroll GLI2 regulert genet; viser at knockdown av
GLI2
i Treg også redusert
GLI1
mRNA (n = 5, ** p = 0,0278). (C) Sekvensen av
GLI2
siRNA var kryptert (SCRAM) som en ekstra
GLI2
siRNA negativ kontroll og var ikke signifikant forskjellig fra den ikke-targeting kontroll.
GLI2 Regulerer
TGF-β1
transkripsjon i primære humane CD4
+ CD25
hi treg
Selv om overekspresjon av transgene GLI proteiner kan modulere
TGF-β1
transkripsjon i naive CD4
+ T-celler, ønsket vi å undersøke fysiologiske rollen til GLI2 aktivering i primærceller som uttrykker høye nivåer av TGF-β1. Tidligere studier har brukt siRNA til knockdown spesifikke gener i primær Treg [31], [32]. Knockdown av
GLI2
ble gjort ved hjelp av kommersielt tilgjengelig Dharmacon ACCELL siRNA å vurdere sin funksjon i TGF-β1 transkripsjon i primære humane treg.
GLI2
siRNA knockdown i primære humane CD4
+ CD25
hi Treg stimulert med aCD3 /αCD28 belagt perler redusert uttrykk for
TGF-β1
mRNA med ca 5 ganger ( Figur 4A, p = 0,0189). For å vurdere knockdown av GLI2 aktivitet,
GLI1
mRNA-ekspresjon ble målt ved hjelp av RT-PCR.
GLI1
gentranskripsjon er et kjent nedstrøms målet for aktivert GLI2 transkripsjonsfaktor. Den reduserte uttrykk for
GLI1
mRNA støtter siRNA-mediert knockdown av
GLI2 plakater (figur 4B, p = 0,0278). En separat uavhengig negativ kontroll ved hjelp av en egge
GLI2
siRNA-sekvens (5′-AAGGUAUGCGCUUAAUUU-3 «) ble brukt til å adressere off-target-effekter (figur 4C). Disse resultatene indikerer at GLI2 er viktig i å regulere
TGF-β1
transkripsjon i primære humane treg. Den sortert Treg var CD3
+ CD8
-CD4
+ CD25
hiFoxP3
+ T-celler. Renheten av treg var mer enn 85% (figur 4D).
Chromatin immunoutfelling (chip) ble utført for å bedømme bindingen av GLI2 til den humane
TGF-β1
promoter. Primær menneskelig regulatoriske CD4
+ CD25
hi T-celler var negativt isolert og stimulert med aCD3 /αCD28-belagte perler over natten. PCR ble gjort for å vurdere GLI2 bindende. Hele DNA ble anvendt som en positiv kontroll for PCR. GLI2 bundet til
TGF-β1
arrangøren på «Site E «i menneske
TGF-β1
promoter. GLI2 ikke binde seg til en ikke-måls regionen i den menneskelige
IL-10
promoter (Lane 8).
GLI2 bindes til humant
TGF-β1
Arrangøren
Chromatin immunoprecipitation (chip) ble gjort for å vurdere binding av GLI2 til den menneskelige
TGF-β1
promoter. Primær menneskelig regulatoriske CD4
+ CD25
hi T-celler var negativt isolert og stimulert med aCD3 /αCD28-belagte perler over natten. Den stimulerte Treg ble inkubert med agarose-kuler belagt med αGLI2 eller αIgG kontrollantistoffer. Som vist i figur 5, GLI2 bundet til
TGF-β1
promoter. GLI2 binding ble vist å være på «Site E «(figur 5) i den menneskelige
TGF-β1
promoter. Imidlertid GLI2 ikke ble bundet til en ikke-målsøkende regionen i det humane
IL-10
promoter (felt 8).
Co-immunutfelling ble anvendt for å teste bindingen av HIV-1 Tat til menneskelig GLI2. Dual transfections ble gjort i 293T celler (plasmid kombinasjoner vist til høyre) for å uttrykke Tat-FLAG og GLI2-6xMYC proteiner (pcDNA3 = tom kontroll vektor). (A) perler ble belagt med anti-FLAG antistoff og inkuberes med cellelysatene fra transfections # 1-3 vises på høyre side. Etter vasking og eluering trinn ble bundet protein kjøre på en SDS-PAGE gel etterfulgt av Western blotting å vurdere GLI2 bindende. Anti-myc antistoffet ble benyttet for å bekrefte binding av GLI2 til Tat når Tat ble bundet til vulsten. (B) perler ble belagt med anti-myc antistoff og inkubert med cellelysatene fra transfeksjoner # 1-3 er vist på høyre side. Etter vasking og eluering trinn ble bundet protein kjøre på en SDS-PAGE gel og Western blotting ble gjort for å lete etter HIV-1 Tat bindende. Bands utviklet ved ca 27 kDa. Anti-flagg antistoff ble brukt til å bekrefte binding av Tat til GLI2 når GLI2 ble bundet til perlen.
HIV-1 Tat binder seg til GLI2
Økt plasma og spinalvæske ( CSF) nivåer av immunundertrykkende cytokiner som TGF-β1 blir funnet i løpet av HIV-1-sykdomsprogresjon [8] – [10] som fører til en økning i iTreg [11], [12]. HIV-1 transaktivator og viralt protein Tat har vært implisert som den induser av TGF-β1 i både
in vitro
samt
in vivo-modeller
[13] – [17]. Selv om Tat har vist seg å øke TGF-β1, underliggende transkripsjonelle mekanismen ennå ikke er klart definert.
Siden vi funnet at GLI2 regulerer TGF-β1 på transkripsjonsnivået, testet vi om HIV-1 Tat binder menneskelig GLI2 og kan dermed øke eller stabil TGF-β1 transkripsjon ved hjelp av co-immunopreciptation (co-IP) for å vurdere binding av menneskelig GLI2 til HIV-1 Tat. Dual transfections ble gjort i 293T celler med tre ulike sett av plasmider: (GLI2-6xMYC + HIV-1 Tat-flagget), (GLI2-6xMYC + pcDNA3 kontroll), (HIV-1 Tat-FLAG + pcDNA3 kontroll). Førti-åtte timer etter transfeksjon, ble cellene lysert og de frigjorte proteiner ble samlet for co-IP (Pierce Co-IP Kit fra Thermo Scientific). Agarose Harpiksen ble belagt med en av de tre antistoffer: Sigma F1804 anti-FLAG M2 antistoff (for å binde Tat å perle), CST 71D10 anti-myc antistoff (for å binde GLI2 å perle), eller et isotype kontroll-antistoff. Etter samtidig IP ble elueringer kjøre på en SDS-PAGE gel etterfulgt av Western blotting. Som vist i figur 6, HIV-1 Tat bundet spesifikt til GLI2 som var bundet til en perle. Den reverse reaksjonen viste også spesifisitet, noe som indikerer at disse to proteinene kan faktisk interagere. Binding av HIV-1 Tat til GLI2 antyder en potensiell mekanisme for TGF-β1 induksjon i HIV-1-infeksjon. Videre forsøk må gjøres for å teste den funksjonelle synergi av HIV-1 Tat og GLI2 å påvirke transkripsjon ved TGF-β1 promoter.
Diskusjoner
Våre resultater viser at transkripsjonsfaktoren GLI2 spiller en tidligere ukjent, men viktig rolle i den komplekse transkripsjonsregulering av
TGF-β1.
Gjennom
in silico
screening-analyse avslørte vi seks mulige GLI-bindingsseter i den humane TGF-β1 promoter , fem av disse var tidligere ukjent. Bruke mutasjonsanalyse av den menneskelige
TGF-β1
promoter, fant vi at GLI2 forbedrer
TGF-β1
transkripsjon i minst tre av de fem antatte GLI-bindingsseter (nettsteder A, B, E). I tillegg viser våre resultater at infeksjon av primære naive CD4
+ T-celler (lav TGF-β1 uttrykke celler) med en konstitutivt aktiv GLI2 lentivirus forbedrer
TGF-β1
transkripsjon. Videre siRNA knockdown av
GLI2
i primære humane CD4
+ CD25
hiFoxP3
+ Treg (høy TGF-β1 uttrykke celler) betydelig redusert
TGF-β1
transkripsjon . Vi viser også med chip som GLI2 binder direkte til «Site E» i
TGF-β1
promoter. Dette nylig identifiserte mekanisme GLI2-mediert TGF-β1 regulering kan ha implikasjoner i sykdommer som kreft og AIDS, der høye nivåer av TGF-β1 bidra til patogenesen.
Selv om rollen som GLI-mediert regulering av
TGF-β1
transkripsjon har tidligere ikke blitt vist, er det indirekte bevis for denne mekanisme. Eichenmuller
et al.
Oppdaget at
Ptch1
knockout-mus, som har konstitutiv aktivering av SHH veien, har mer enn 400 ganger økte nivåer av
TGF-β1
mRNA transkripsjoner [28]. Selv om etterforskerne fant at den antatte GLI bindingssetet i den andre arrangøren var ikke lydhør overfor GLI1, gjorde de ikke undersøke hvilken rolle GLI2 i å regulere de fem antatte GLI bindingsseter som vi oppdaget i første TGF-β1 promoter.
i tillegg flere rapporter understreke det nære forholdet mellom TGF-β1 og SHH /GLI familier [33], [34]. Liu
mfl.
Rapportert samspillet mellom SHH sti molekylet GLI3 og Smad proteiner (TGF-β1 veien transkripsjonsfaktorer) [35]. I tillegg Dennler
et al.
Rapporterte at GLI2 og GLI1 kan induseres gjennom en SMAD-mediert mekanisme [36]. TGF-β superfamilien gener
BMP-2, 4
,
7
alle har GLI-responsive elementer i sine arrangører [37] – [39]. Lin
et al.
Funnet en SHH-responsive element i 5′-oppstrøms promoter-regionen i
TGF-β2 product: [40].
