Abstract
Trabectedin (Yondelis, ET-743) er et marin-avledet tetrahydroisoquinoline alkaloid. Det er opprinnelig stammer fra den karibiske marine kappe
Ecteinascidia turbinata Hotell og dag produseres syntetisk. Trabectedin er aktiv mot en rekke tumorcellelinjer som vokser i kultur. Foreliggende studie fokuserte på effekten av trabectedin i celleproliferasjon, cellesyklusprogresjon, apoptose og sfæroide dannelse i prostata cancer stamceller (cscs). Klynge av differensiering (CD) 133
+ høy /CD44
+ høye prostata cscs ble isolert fra DU145 og PC-3 human prostatakreft cellelinje gjennom flowcytometri. Vi studerte veksthemmende effekter av trabectedin og dets molekylære mekanismer på menneskelige prostata cscs og ikke-cscs. DU-145 og PC-3 cscs ble behandlet med 0,1, 1, 10 og 100 nM trabectedin for 24, 48 og 72 h og vekst inhiberingsgraden ble undersøkt ved hjelp av kuledannende analyse. Annexin-V-assay og immunofluorescens-analyser ble utført for påvisning av celledød. Konsentrasjonsavhengige virkninger av trabectedin på cellesyklusen ble også evaluert. Cellene ble utsatt for forskjellige doser av trabectedin for 24, 48 og 72 timer for å evaluere effekten av trabectedin på antallet og diameteren av sfæroider. Ifølge resultatene, trabectedin indusert cytotoksisitet og apoptose på IC
50 dose, noe som resulterer i en betydelig økning ekspresjon av caspase-3, caspase-8, caspase-9, p53 og redusere ekspresjon av bcl-2 i doseavhengig måte. Cellesyklus analyser avslørte at trabectedin induserer doseavhengig G2 /M-fase cellesyklus arrest, spesielt ved høye doser behandlinger. Tredimensjonal kulturstudier viste at trabectedin redusert antall og diameter kuler av DU145 og PC3 cscs. Videre har vi funnet at trabectedin forstyrret celle-celle interaksjoner via E-cadherin i prostasphere av DU-145 og PC-3 cscs. Våre resultater viste at trabectedin hemmer celledeling og akselererer apoptotiske hendelser i prostata cscs; og kan være en potensiell effektiv terapeutisk middel mot prostatakreft
Citation. Acikgoz E, Guven U, Duzagac F, Uslu R, Kara M, Soner BC, et al. (2015) Forbedret G2 /M arrest, caspase Relaterte apoptose og redusert E-cadherin Dependent intercellulær adhesjon av trabectedin Prostate Cancer Stem Cells. PLoS ONE 10 (10): e0141090. doi: 10,1371 /journal.pone.0141090
Redaktør: Shian-Ying Sung, Taipei Medical University, TAIWAN
mottatt: 23 juli 2015; Godkjent: 03.10.2015; Publisert: 20 oktober 2015
Copyright: © 2015 Acikgoz et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft stamceller (cscs) hypotese sier at svulster inneholder bare en liten undergruppe av celler med et potensial på selvfornyelse og differensiering. Cscs er antatt å være ansvarlig for tumor initiering og opprettholdelse av tumorvekst og celleoverlevelse etter kjemoterapi på grunn av deres resistens mot konvensjonelle anticancer terapi [1]. I løpet av begynnelsen av tumorutvikling, kan cscs gjennomgå en symmetrisk selv-fornyende celledeling i to identiske datter cscs men også generere bulk populasjoner av ikke-cscs ved asymmetrisk celledeling [2]. Flertallet av celler i bulk svulster har begrenset tumorigent og metastatisk potensial i forhold til cscs. For en mer effektiv behandling av kreft, kan det være nødvendig å målrette både cscs og ikke-CSC populasjoner.
cscs tidligere er blitt isolert ved hjelp av CSC-spesifikke celleoverflatemarkører slik som CD44, CD133, CD24, α2β1 integrin og aldehyd dehydrogenase1. CD133 og CD44 er den mest brukte celle
–
overflatemarkører for identifisering av cscs. CD133 er medlem av pentaspan transmembrane glykoproteiner. Den ble først beskrevet av hematopoetiske stamceller og neurale /forløperceller, og er også en markør for cscs i mange faste tumorer [3, 4]. CD44 er et allestedsnærværende flere strukturelle og multi-funksjonelle celleoverflate glykoprotein. Det er involvert i celle-adhesjon, migrasjon og metastasering av en rekke tumorceller og stemness regulering av cscs [5]. Det er tidligere vist at en CD44
+ /α2β1
høy /CD133
+ fenotype representere kandidat prostatakreft tumorigene celler [6]. Derfor CD133
+ /CD44
+ celler kan være potensielle mål for antitumorterapi i fremtiden.
Konvensjonell enkeltlag to-dimensjonale (2D) cellekulturstudier har vært vellykket i å forklare oppførselen til cscs. På den annen side, in vitro tredimensjonal (3D) kreft modellen etterligner funksjonene i in vivo miljøet, og derfor gir en bedre mulighet til å forstå viktige kreftstamcelle mekanismer og for å utvikle nye kliniske terapeutiske anvendelser [7]. In vitro, cscs har en tendens til spontant å danne tredimensjonale cellulære aggregater, kalt sfæroider som representerer de differensierings egenskaper cscs og brukes for å bidra til tumorutvikling, progresjon og kjemoterapi motstand i flere studier. Det er blitt vist at E-cadherin er den viktigste adhesjonsmolekylet mediere tett celle-celle-interaksjon, og er blitt korrelert med en kompakt sfæroid formasjon i prostatacancercellelinjer [8, 9].
Trabectedins er en marin tetrahydroisokinolin alkaloid. Trabectedin har blitt isolert fra den karibiske marine kappe
Ecteinascidia turbinata Hotell og produseres i dag syntetisk [10]. Trabectedin har et potent cytotoksisk aktivitet mot en rekke krefttyper i flere solide tumorer
in vitro Hotell og
in vivo
. Det er under fase I og II kliniske studier i Europa og USA med lovende en kreft narkotika for behandling av en rekke svulster [11]. Ikke desto mindre anticancer aktivitet og virkningsmekanisme er fortsatt uklar. Det har vist seg at trabectedin binder seg til N2 stilling guanines i mindre spor av DNA, DNA bøying mot hovedsporet og griper med flere transkripsjonsfaktorer og DNA-reparasjonsbaner [11]. Det er også kjent at trabectedin induserer DNA-skade. Dette endrer den normale funksjon av DNA reparasjon og transkripsjon prosesser, noe som resulterer med en arrestasjon av spredning, differensiering og celledød. [11, 12, 13]. Den anti-proliferative aktivitet av trabectedin er doseavhengig: ved lave konsentrasjoner (1-10 ng /ml), produserer trabectedin cellesyklus perturbasjoner med en redusert hastighet av S-fase progresjon og akkumulering av celler i G2-fasen. Ved høyere konsentrasjoner (10-100 ng /ml), fører transkripsjonen-uavhengig prosess for å apoptose via aktivering av forskjellige signaloverføringsveier som involverer mitokondriell cytokrom c frigivelse, JNK og caspase- 3 aktivisering [14]. Den cytostatiske og pro-apoptotiske aktivitet av trabectedin et resultat av aktivering av den indre og /eller ytre apoptotiske ruter. Den indre vei er kjennetegnet ved mitokondrie ytre membran permeabilization og frigjøring av cytokrom-c inn i cytoplasma; en prosess regulert av Bcl-2-familien av proteiner. Tidligere arbeid antyder at trabectedin utløser cytokrom c utgivelse fra mitokondrier som normalt hemmet av BCL-2 overekspresjon [14].
Nylig, nye bevis har vist at cscs spiller avgjørende roller i utviklingen av resistens, metastaser og tilbakefall. Derfor er det viktig å undersøke og finne nye medikamenter som selektivt og effektivt målrette og drepe cscs. Den aktuelle studien var å undersøke effekten av trabectedin i CD133
+ høy /CD44
+ høye prostata cscs i 2D og 3D kultur systemet.
Materialer og metoder
Cell kultur betingelser og reagenser
Menneske hormon og multiresistent prostatakreft cellelinjer, PC-3 og DU145 ble purchsed fra American Type Culture Collection (Manasas, VA, USA) og ble dyrket i RPMI 1640 (
Lonza
,
Basel
,
Sveits
) dyrkingsmedium som inneholder 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (Gibco, Invitrogen Life Technologies, Paisley, UK), 1% penicillin og streptomycin ( Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Cellene ble dyrket i 25 cm
2 polystyren kolber (Corning Life Sciences, UK) og vedlikeholdes i en inkubator ved 37 ° C i en fuktig atmosfære i nærvær av 5% CO
2. Vekst og morfologi ble sjekket mikroskopisk daglig for å sikre celle helse. Cellene ble splittet passaged når de hadde nådd ca 80% sammenflytning. Celler i semiconfluent kolber ble høstet ved bruk av 0,05% trypsin (Sigma-Aldrich) og sentrifugert (Nuve NF200; Laboratory og sterilisering Technology, Ankara) etter tilsetning av RPMI 1640 for trypsin inaktivering. Etter sentrifugering ble de resuspendert i kulturmedium. Trabectedin ble levert av PharmaMar (Madrid, Spania) og ble fremstilt som en 2 mM stamløsning i dimetylsulfoksid (DMSO). DMSO-konsentrasjonen i analysen ikke overstige 0,1% og var ikke cytotoksisk til tumorcellene. Antistoffer som ble brukt var anti-caspase-3 (1: 100 fortynnet, 3510-100, BioVision, Inc., Milpitas, CA, USA), anti-caspase-8 (1: 100 fortynnet, 250576, Abbiotec, USA), anti- caspase-9 (1: 100 fortynnet, Santacruz bioteknologi, USA, sc-17784), anti-p53 (1: 100 fortynnet, 3036R-100, BioVision, Inc.), anti-BCL2 (1: 100 fortynnet, Santacruz bioteknologi, USA, sc-135757), anti-E-cadherin (1: 100 fortynnet, Bios, USA, bs-1519R), geit anti-kanin immunglobulin G-fluorescein (FITC) (1: 100 fortynnet, sc-2012, Santa Cruz Bioteknologi, Inc., Santa Cruz, CA, USA) og kylling anti-kanin immunglobulin Alexa Fluor
® 594 (1: 100 fortynnet, Invitrogen, USA, A21442)
fluorescens-aktivert celle sortering. (FACS)
før høsting, ble cellelinjer dyrket til 80% sammenflytning. For FACS (FACSAria; BD Biosciences, San Jose, CA, USA), ble cellene løsnet ved hjelp av ikke-enzymatisk celledissosiasjon oppløsning (Sigma-Aldrich) og resuspendert i Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning (DPBS, Invitrogen, USA). Omtrent 5×10
4-celler ble inkubert med et antistoff (fortynnet 1: 100 i FACS vask med 0,5% bovint serumalbumin, 2 mM NaN3 og 5 mM EDTA) i 15 minutter ved 4 ° C. En isotype og konsentrasjon-matchet fykoerytrin (PE) -merket kontrollantistoff (Miltenyi Biotec Ltd, Woking, Surrey, UK) ble anvendt og prøvene ble merket med PE-merket CD133 /1 (klon AC133 /1; Miltenyi Biotec Ltd ) og FITC-merket CD44 (klon G44-26, BD Biosciences). Etter 3-5 minutter, ble cellene vasket og deretter re-suspendert. Cellene ble sortert til å være CD 133
høy /CD44
høy befolknings (sortering celler) og ikke-sortering kolleger ved hjelp av en FACSAria flowcytometer, med etter slags analyse utført for å bekrefte befolkningen renhet. Sortert celle populasjoner ble dyrket i to forskjellige innstillinger, mono 2D kultur eller 3D flercellet svulst sfæroide.
Celleviabilitet analyserer
Livskraftig av cellene etter behandling ble bestemt ved bruk av Muse ™ Count og levedyktighet kit (Muse ™ Cell Analyzer, Millipore, Billerica, MA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene sådd ut i triplikat i 6-brønns plater ved en tetthet på 1 x 10
4cells /brønn. Etter 24 timers inkubering ble cellene eksponert for økende konsentrasjoner av trabectedin (0,1, 1, 10, 100 nM). Deretter, Platene ble inkubert ved 37
° C i en 5% CO
2 inkubator i 24, 48 og 72 timer. Etter inkubering ble alle celler samlet opp og fortynnet med fosfat-bufret saltvann (PBS). 50 ul av cellesuspensjonen ble deretter tilsatt til 450 ul MUSE antall og levedyktighet reagens (10x fortynning), inkubert i 5 minutter ved romtemperatur og analysert ved hjelp av MUSE Cell Analyzer. Resultatene ble presentert som proporsjonal levedyktighet (%) ved sammenligning av trabectedin behandlede gruppe med de ubehandlede celler, levedyktigheten av disse er antatt å være 100%.
Celledød analyser
apoptotiske cellen vil fordelingen ble bestemt ved bruk av MUSE Annexin V Død Cell Kit (Merck KGaA) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, etter behandling med trabectedin, var alle celler samlet opp og fortynnet med PBS som inneholdt 1% bovint serumalbumin (BSA) som en fortynningsbuffer til en konsentrasjon på 5×10
5 celler /ml. 100 ul av Annexin V /død-reagens og 100 ul av en enkelt cellesuspensjon ble blandet i en microtube og i mørke i 20 minutter ved romtemperatur. Cellene ble så analysert ved hjelp av Muse celle analysator (Merck Milipore). Den apoptotiske-forholdet ble bestemt ved identifisering av fire grupper: (i) nonapoptotic celler, ikke gjennomgår apoptose detekterbar: Annexin V (-) og 7-AAD (-); (Ii) tidlig apoptotiske celler, Annexin V (+) og 7-AAD (-); (Iii) sent apoptotiske celler, Annexin V (+) og 7-AAD (+); (Iv) celler som har dødd gjennom nonapoptotic sti: Annexin V (-) og 7-AAD (+). Prøvene ble bestemt av Muse Cell Analyzer (Merck Millipore).
Cellesyklus analyserer
Cellesyklus analyser ble utført ved hjelp av en Muse ™ cellesyklus kit fra Millipore i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene dyrket i 6-brønners plater som ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av trabectedin (0,1, 1, 10, 100 nM); deretter høstet ved trypsinering og vasket to ganger med PBS. Cellene ble fiksert med 1 ml 70% kald etanol ved -20 ° C i 5 timer og behandlet med 200 ul Muse cellesyklus-reagens og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur i mørke. Prosentandelen av celler i G0 /G1, S og G2 /M faser ble deretter beregnet ved hjelp av en Muse celle analysator (Millipore, USA).
Sphere dannelse og kolonidannelse analyser
spheroid formasjon potensialet CD133
høy /CD44
høy menneskelig prostata cscs ble evaluert i 3D ikke-klebende kultur tilstand. Utgangspunktet CD133
høy /CD44
høy menneskelig prostata cscs ble dyrket som en monolayer etter som de ble talt opp, re-suspendert og belagt med 1×10
4 celler per brønn i en 6-brønns plate pre-belagt med et tynt lag av 3% Noble agar (vekt /volum) (Difco Laboratories, Inc .; BD Diagnostic Systems, Detroit, MI, USA) i RPMI 1640 inneholdende 10% FBS og inkubert ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. Cellekulturmedier ble erstattet hver 2-3 dag med frisk medium for å fjerne cellerester og kulene som ikke var velformet. Etter begynnelsen av den flercellede tumor sfæroide dannelse, ble trabectedin tilsatt ved forskjellige konsentrasjoner av trabectedin (0,1, 1, 10, 100 nM) og inkubert i 24, 48 og 72 timer. Antallet og diameteren av kolonier i hver brønn ble fotografert og tellet hver dag under mikroskop (Olympus BX-51, Olympus, Hamburg, Tyskland) og bilder av de representative feltene ble tatt. Hver prøve ble analysert i triplikat og alle forsøk ble utført tre ganger.
Immunofluorescence farving
Etter behandling med IC
50 dose av trabectedin, ble celler plassert på lysin-belagte dekkglass, fiksert i 4% paraformaldehyd i 15 min. Deretter ble cellene permeabilisert med 0,1% Triton X-100 i 10 minutter ved romtemperatur, vasket tre ganger med PBS, blokkert med PBS inneholdende 5% bovint serumalbumin i 1 time og inkubert med primære antistoffer mot kaspase-3, caspase- 8, caspase-9 p53, bcl-2 og e-cadherin for over natten ved 4 ° C. Deretter ble cellene behandlet med det sekundære antistoff i 1 time ved romtemperatur i et fuktet kammer. De immunceller ble montert i monteringsmedium som inneholder DAPI og ble visualisert ved en fluorescens mikroskop utstyrt med et kamera (Olympus BX-51 og Olympus C-5050 digital test).
Statistisk analyse
Forsøk ble utført i tre eksemplarer. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en-veis analyse av varians, etterfulgt av Tukey-eller Dunett s post hoc test. p 0,05 ble ansett for å indikere en statistisk signifikant forskjell
Resultater
Purity og sortering priser av CD 133
høy /CD44
høy sortert og ikke-sortert undergruppe
DU145 og PC-3 menneskelige prostata kreft celler ble sortert for CD133 og CD44 overflate uttrykk med FACS (fig 1A og 1B). Resultatene viste at utbredelsen av DU-145 cscs og ikke-cscs var 3,2 ± 5,4% (fig 1A) og 96,8 ± 5,4% (fig 1B), henholdsvis. I PC-3 celler, prisene var 3,9 ± 5,4 for sortering celler og 96,1 ± 5,4 for ikke-sortering celler. En post-slags analyse ble utført for å bestemme renheten av de sorterte cellepopulasjoner; som ble funnet å være . 85%
(A) DU-145 cscs ble isolert fra DU-145 humane prostatacellelinje. (B) PC-tre cscs ble isolert fra DU-145 human prostata cellelinje. CD133
høy /CD44
høye bestander presentert i P6. CD, klynge av differensiering; FACS, fluorescens-aktivert cellesortering.
Økende cytotoksisitetstester av CD133
høy /CD44
høy prostata cscs med trabectedin
For å bestemme effekten av trabectedin på levedyktighet av menneskelige prostata epitelceller (RWPE-1), prostatakreft celler (DU-145 og PC-3), prostata cscs (DU-145 og PC-3 cscs) og bulk befolknings (DU-145 ikke-cscs og PC-3 ikke-cscs) ble utsatt for økende konsentrasjoner av trabectedin (0,1-100 nM) i 24, 48 og 72 timer, og den prosentandel av levedyktige celler i prøvene ble bestemt ved cellelevedyktigheten assay.
trabectedins redusert celle levedyktighet i DU145 menneskelige prostata cellelinje, DU-145 cscs og DU-145 ikke-cscs i et tids- og treringstrinnet avhengig måte (figur 2). Etter 24 timers behandling, for halv maksimal hemmende konsentrasjon (IC
50) verdiene av trabectedin ble funnet å være 100 nM i DU-145 ikke-cscs; mens IC
50 Verdien av trabectedin i DU-145 cellelinje og cscs ikke kunne oppnås (Fig 2A). Etter 48 timers behandling, IC
50 verdier av trabectedin ble funnet å være 10 nM, 100 nM og 9,2 nM henholdsvis i cellelinjen DU-145, DU-145 cscs og DU-145 ikke-cscs (Fig 2B). Etter 72 h behandling, IC
50 verdier av trabectedin ble funnet å være 1 nM, 9,3 nM og 1 nM henholdsvis i cellelinjen DU-145, DU-145 cscs og DU-145 ikke-cscs (fig 2C) .
Cytotoksisitet ble bestemt av Muse ™ cellen analysator. Resultatene er uttrykt som gjennomsnittet av 3 forskjellige eksperimenter (± SD) (s 0,001 sammenlignet med ubehandlet kontroll).
Trabectedins redusert cellelevedyktighet i PC-3 human prostatacellelinje, PC- 3 cscs og PC-tre ikke-cscs i et tids- og treringstrinnet avhengig måte (figur 2). IC
50 Verdien av trabectedin kan ikke oppnås i alle tre gruppe i 24 timer. Etter 48 timers behandling, IC
50 verdier av trabectedin ble funnet å være 100 nM i PC-3 cellelinje og PC-3-non-cscs; mens IC
50 Verdien av trabectedin i PC-3 cscs ikke kunne oppnås (Fig 2B). Etter 72 h behandling, IC
50 verdier av trabectedin ble funnet å være 9 nM, 10 nM og 8 nM henholdsvis i PC-3 cellelinje, PC-3 cscs og PC-3 ikke-cscs (figur 2C). Selv om trabectedin redusert levedyktighet av cscs og ikke-cscs på en konsentrasjonsavhengig måte, levedyktigheten av RWPE-1-celler var signifikant høyere enn prostatakreftceller etter eksponering for trabectedin, noe som indikerer at prostatakreft stamceller var mer følsomme overfor trabectedin enn normal prostata epitelceller RWPE-1 celler.
trabectedin indusert celledød ved apoptose både cscs og ikke-cscs
For å undersøke om cellene gjennomgår apoptose, ubehandlet eller trabectedin behandlet DU-145 cellelinje, DU -145 cscs, DU-145 ikke-cscs, PC-3 cellelinje, PC-3 cscs, PC-3 ikke-cscs ble utsatt for økende konsentrasjoner av trabectedin og evaluert av Muse ™ Annexin V og død celle analyse (fig 3 ). Annexin V og død celle analyse av celler kan skille cellene i fire grupper, nemlig levedyktig (Annexin V (-) og 7-AAD (-), tidlig apoptose Annexin V (+) og 7-AAD (-), sen apoptose, annexin V (+) og 7-AAD (+) og nekrotisk Annexin V (-).. og 7-AAD (+) Trabectedins signifikant induserte apoptose i alle grupper i en konsentrasjonsavhengig måte Statistiske analyser viste en signifikant forskjell mellom trabectedin behandlede celler sammenlignet til kontroll (p 0,001).
(A) cellelinje DU-145, (B) DU-145 cscs, (C) DU-145 ikke-cscs, (d) PC-3 cellelinjen, (E) PC-3 cscs, (F) PC-3 ikke-cscs. celler ble behandlet med 0,1, 1, 10 og 100 nM trabectedin i 48 timer. etter inkubasjonstiden ble cellene samlet og phosphatydilserine eksternalisering ble bedømt ved bruk av Annexin V . protokoll som beskriver Basert på Annexin V reaktivitet og intensiteten av de 7-AAD fluorescens, kan cellene bli klassifisert i fire kategorier:. død, lever, tidlig apoptose og sen apoptose /dead Trabectedins ble vist å indusere apoptotisk celledød i kreft stamceller hovedsakelig med økning i begynnelsen av apoptose (grønn), celler og den tilsynelatende redusert i prosentandelen av levende celler. Trabectedin også signifikant induserte samlede apoptotiske celler (gul) på en doseavhengig måte. Data representerer gjennomsnittet ± SEM av tre eksperimenter. Statistisk signifikans ble bestemt med en-veis analyse av varians, etterfulgt av Tukey-eller Dunett s post hoc test. p 0,05 ble ansett for å indikere en statistisk signifikant forskjell
Resultatene viste at trabectedin eksponering ved økende konsentrasjoner resulterte i høyere populasjon av tidlige apoptotiske celler.. Basert på vår data konkluderer vi med at trabectedin induserer apoptotisk celledød i alle gruppene testet med en markert økning i begynnelsen av apoptose på 48 timer. Trabectedin indusert de totale apoptotiske celler i DU-145 cellelinje (fig 3A), DU-145 cscs (figur 3B), DU-145 ikke-cscs (Fig 3C), PC-3 cellelinje (Fig 3D), PC-3 cscs (figur 3E) og PC-3 ikke-cscs (figur 3F) på en doseavhengig måte.
caspase-3, caspase-8, caspase-9, p53 og bcl-2 modulen flavopiridol-assosiert apoptose
immunfluorescens farging for caspase-3, caspase-8, caspase-9, p53 og bCL-2 støtter våre resultater og ga informasjon om de involverte apoptotiske sti. I DU-145-cellelinjen (figur 4A), DU-145 cscs (figur 4B) og DU-145 ikke-cscs (figur 4C) som ble behandlet 10 nM trabectedin resulterte i en betydelig økning i immunfluorescens farging av caspase-3, caspase-8 , caspase-9 og p53. I motsetning til dette ble immunofluorescens farging av bcl-2 tydelig redusert sammenlignet med kontrollen. Lignende observasjoner ble registrert i PC-3 cellelinje, PC-3 cscs og PC-3-non-cscs: immunfluorescens farging av caspase-3, caspase-8, og p53 ble øket og immunfluorescens farging av bcl-2 ble redusert. Det ble ikke observert signifikante endringer i immunfluorescens farging av caspase-9.
(A) DU-145, (B) DU-145 cscs, (C) DU-145 ikke-cscs. Etter behandling med 10 nM trabectedin; caspase-3, caspase-8, caspase-9, p53 og bcl-2 ble visualisert ved bruk av FITC-konjugert sekundært antistoff (grønn). Nukleær farging ble visualisert ved hjelp av DAPI (blå) fargingen. Bildene er representative for tre uavhengige eksperimenter. Målestokken står for 50 pm.
Cellesyklus regulering med høydose trabectedin behandling
For å vurdere om Trabectedin-indusert veksthemming av celler formidles via endringer i cellesyklus, vi undersøkte effekten av trabectedin på cellesyklus distribusjon av døde celler assay kit. Økning i inkubasjonstid resulterte i en økning av mengden av celler i G2 /M i alle grupper;
henholdsvis spesielt med høy dose (10 og 100 Nm) behandlinger.
Etter 48 timer på 0,1 nM trabectedin behandling cellepopulasjoner i G0 /G1, S og G2 /M faser var 55,3, 27,6 og 17,1%, i DU-145 cellelinje, og 58,3, 23,1 og 18,6%, henholdsvis i DU-145 cscs. Etter en nM trabectedin inkubasjon prosentene var 54,0, 21,2 og 24,8%, henholdsvis i DU-145 celler; og 50.1, 26.9 og 23.0%, henholdsvis i DU-145 cscs. Inkubasjon med 10 nM trabectedin resulterte i prosenter av 35,7, 29,8 og 34,5% i DU-145 cellelinje og 37,0, 32,5 og 30,4% i DU-145 cscs (fig 5A og 5B). Når cellene ble behandlet med 100 nM trabectedin, prosentandelene av de tre klassene av celler var 28,0, 29,5 og 42,5%, henholdsvis, i DU-145-cellelinjen; og 38,1, 21,8 og 40,0%, henholdsvis i DU-145 cscs. I DU-145 ikke-cscs, celle populasjoner i G0 /G1, S og G2 /M faser var 56,2, 24,4, 19,4% henholdsvis etter 48 timers inkubering med 0,1 nM trabectedin. Prosentandelene av de tre klassene av celler med 1 nM trabectedin inkubasjon var 50,1, 19,3, 30,6%; med 10 nM trabectedin og 37,2, 22,9 og 39,9% (Fig 5C); med 100 nM trabectedin 25,5, 29,1, henholdsvis 45,4% etter 48 timers inkubering.
(A) DU-145, (B) DU-145 cscs, (C) DU-145 ikke-cscs, (D) PC-3, (E) PC-tre ikke-cscs, (F) PC-tre cscs. Cellene ble behandlet med 10 nM trabectedin i 48 timer. Prosentandelen av celler i G0 /G1, S og G2 /M-fasene ble deretter beregnet ved anvendelse av en Muse celle analysator. Histogrammer fra en representant eksperiment viser effekten av trabectedin på cellesyklus profil. Spesielt, trabectedin påvirkes vesentlig av cellene i G2 /M fase, særlig i høy-dose behandling. Data som vises her er fra et representativt eksperiment gjentatt tre ganger med samme resultat.
Etter 48 timer med behandling med 0,1 nM trabectedin, cellepopulasjoner i G0 /G1, S og G2 /M faser var 57,0 , 24,6 og 18,4% henholdsvis i PC-3 cellelinjen, og 69,4, 12,7 og 17,8%, henholdsvis i PC-3 ikke-cscs. Inkubasjon med 1 nM trabectedin, prosentandelene av de tre klassene av celler var 45,8, 25,5 og 28,6%, henholdsvis i PC-3-cellelinjen og 48,7, 22,9 og 28,3%, henholdsvis i PC-3 ikke-cscs. Inkubering med 10 nM trabectedin, prosentandelene av de tre klassene av celler var 49,5, 17,7 og 32,7% (figur 5D), henholdsvis i PC-3-cellelinjen og 35,8, 31,1 og 33,0% (figur 5E), henholdsvis i PC- 3 non-cscs. Inkubasjon med 100 nM trabectedin, prosenter var 43,8, 18,9 og 37,3%, henholdsvis i PC-3 cellelinje og henholdsvis 28,0, 26,4 og 45,6% i PC-3 ikke-cscs. Lignende observasjoner ble registrert i PC-3 cscs. Eksponering av disse cellene til trabectedin konsentrasjoner på 0,1, 1, 10 og 100 nM resulterte i 76,4, 62,7, 50,3, 45,8% arrest i G0 /G1 fase, henholdsvis; og 15.0, 22.0, 27.6, 26.3% arrest (henholdsvis) i S-fasen, og 8,6, 15,3, 20,9, 27,9% arrest (henholdsvis) i G2 /M fasen (figur 5F). Disse resultatene indikerer at veksthemming observert i alle gruppene som ble behandlet av trabectedin er i hovedsak knyttet G2 /M fase arrest.
Sammenligning av spheroid forming evne cscs og ikke-cscs
DU-145 og PC-tre cscs og ikke-cscs ble dyrket i 3D kultur forhold ikke-heftende. Spheroid formasjonen ble evaluert under et fasekontrastmikroskop. CD133
høy /CD44
høy menneskelig prostata cscs (Fig 6A og 6B) var i stand til å danne kuler; mens ikke-cscs mislyktes (Fig 6C og 6D).
A) DU-145 cscs, B) PC-3 cscs, (C) DU-145 ikke-cscs, (D) PC-tre ikke- cscs. CD133
høy /CD44
høy menneskelig prostata cscs var i stand til å danne kuler; mens ikke-cscs mislyktes.
Hemming av dannelsen sfære med trabectedin
DU-145 cscs og PC-3 cscs dannet tumoroids på dag fem og tre, henholdsvis. De tidlige sfæroider ble inkubert i 24, 48 og 72 timer, og cellene ble behandlet med 0,1, 1, 10 og 100 nM trabectedin. Antallet og diameteren av kolonier i hver brønn ble bestemt hver dag under mikroskopet. Målinger av tumoroid størrelse og antall avslørte en doseavhengig cytotoksisitet hos behandlede tumoroids når sammenlignet med ubehandlede kontroller. Trabectedin redusert antall og diameter av sfæroider av DU145 cscs og PC3 cscs i en dose- og tidsavhengig måte (figurene 7 og 8). Med økende doser av trabectedin, ble økt celledød observert å følge oppløsningen av kuler av DU145 cscs og PC3 cscs.
(A) DU-145 cscs, (B) PC-tre cscs. Evne til sfære dannelsen av CD133
høy /CD44
høy DU-145 og PC-3CSCs er markert trykkes på en doseavhengig måte fra begynnelsen av spheroid grunnlov. Etter begynnelsen av den flercellede tumor sfæroide dannelse, ble trabectedin tilsatt ved forskjellige konsentrasjoner av trabectedin (0,1, 1, 10, 100 nM) i 24, 48 og 72 timer. En betydelig reduksjon ble observert i diameteren av sfæroide formasjonen. Resultatene er representative for innsamlede data fra minst tre forsøk.
(A) DU-145 cscs, (B) PC-3 cscs. Etter begynnelsen av den flercellede tumor sfæroide dannelse, ble trabectedin tilsatt ved forskjellige konsentrasjoner av trabectedin (0,1, 1, 10, 100 nM) i 24, 48 og 72 timer. Antallet av kuler av 15-20 tilfeldige områder ble tellet og beregnet. Trabectedin redusert antall kuler av DU145 cscs og PC3 cscs i en dose og tidsavhengig måte.
E-cadherin uttrykk redusert i CD133
høy /CD44
høye prostata cscs med trabectedin
for å undersøke hvilken rolle trabectedin i uttrykket av E-cadherin-mediert celle-celle adhesjon i DU-145 og PC-3 cscs dyrket under tredimensjonale forhold i vitro, undersøkte vi immunfluorescens farging av E- cadherin. Våre immunfluorescens analyser Resultatene viste at etter behandling av DU-145 og PC-3 cscs med IC
50 doser trabectedin, E-cadherin uttrykk betydelig redusert sammenlignet med kontroll (Fig 9).
(A) DU -145 cscs, (B) PC-3 cscs. Etter flercellede svulst spheroid formasjonen, ble DU-145 cscs og PC-3 cscs kuler behandles med trabectedin. Trabectedin forstyrret E-cadherin-mediert celle-celle interaksjoner i flercellede kuler av DU-145 og PC-3 cscs. E-cadherin ble visualisert ved hjelp av Alexa Fluor
® 594 -konjugert sekundært antistoff (rød) Kjerner er farget med DAPI (blå). Skala: 100 mikrometer
Diskusjoner
Vår studie er den første til å demonstrere kreftforebyggende effekt av trabectedin på menneskelige prostata cscs.. Nyere kreft studier har avdekket at et mindretall populasjon av celler i svulster bulks er ansvarlig for startfasen, vekst og motstand mot konvensjonelle behandlinger. De fleste av kreftlegemidler som undersøkes, mens drepe hoveddelen av tumorceller, til syvende og sist ikke klarer å eleminate cscs, som årsak til tumorresidiv og metastasering. Derfor har oppmerksomheten vært rettet mot å definere nye kreft narkotika for kreft forebygging og behandling av eliminere cscs.
Trabectedin har potensial til å være et effektivt kjemoterapeutisk middel for utvikling av nye behandlingsstrategier som spesifikt retter prostata cscs. Våre data antyder sterkt at trabectedin hemmer veksten av prostata cscs på en doseavhengig måte, via cellesyklus og apoptose.
