Abstract
proteintyrosinfosfatase lokalisert til mitokondrie 1 (PTPMT1) er en dobbel spesifisitet fosfatase utelukkende lokalisert til mitokondriene, og er nylig blitt vist å være en kritisk komponent i den kardiolipin biosyntetiske vei. Den nedregulering av PTPMT1 i pankreatiske p-celler har vist seg å øke cellulære ATP nivåer og insulinproduksjon, men har den generaliserte rolle PTPMT1 i kreftceller ikke er blitt karakterisert. Her kan vi rapportere at nedregulering av PTPMT1 aktivitet er tilstrekkelig til å indusere apoptose av kreftceller. I tillegg ved å stanse all PTPMT1 reduserer Cardiolipin nivåer i kreftceller, mens selektivt øke ATP nivåer i glycolytic media. I tillegg subletal nedregulering av PTPMT1 synergizes med lave doser av paclitaxel for å fremme kreftcelledød. Våre data antyder at inhibering av PTPMT1 bevirker en metabolsk krise i kreftceller som induserer celledød, og kan være en mekanisme ved hvilken kreftceller kan bli sensibilisert for tiden tilgjengelige terapier
relasjon:. Niemi NM, Lanning NJ, Westrate LM, MacKeigan JP (2013) nedregulering av mitokondrie fosfatase PTPMT1 er tilstrekkelig for å fremme Cancer Cell Death. PLoS ONE 8 (1): e53803. doi: 10,1371 /journal.pone.0053803
Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: May 21, 2012; Godkjent: 05.12.2012; Publisert: 10 januar 2013
Copyright: © 2013 Niemi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av award nummer R01CA138651 fra National Cancer Institute i JP MacKeigan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mitokondrier, mest kjent som «kraftpakke av cellen, «inneholder proteiner med omfattende posttranslasjonelle modifikasjoner, inkludert fosforylering og acetylering. Disse modifikasjonene i sin tur påvirker metabolsk kapasitet, dynamikk, og samlet homeostase av organeller [1], [2], [3], [4]. Lokalisering av en rekke kinaser og fosfataser i mitokondriene tyder på at fosforylering er et aktivt regulert prosess som spiller en betydelig rolle i mitokondrie protein funksjon [5], [6]. Til tross for en omfattende katalog av fosforylering arrangementer, samt enzymer som kan katalysere disse hendelsene, den samlede reguleringen av mitokondrie prosesser ved fosforylering, og hvordan disse hendelsene påvirker celle skjebne, er fortsatt uklar.
PTPMT1 er en dual spesifisitet fosfatase lokaliserte spesielt og utelukkende til mitokondriene [7]. Det er forankret inne i den indre mitokondrie-membran med sin fosfatase domene eksponert til matriksen, plassere den proksimalt for en rekke enzymer som er ansvarlige for energiproduksjon og metabolisme. Interessant er imidlertid innledende
in vitro
studier med rekombinant PTPMT1 antydet at dette enzymet har en klar preferanse for lipid substrater enn proteinsubstrater [8], som tyder på at PTPMT1 kan direkte påvirke lipid rommet i mitokondrie. En fersk studie bekreftet dette, viser at PTPMT1 fungerer som pattedyr fosfatidylglyserol fosfat (PGP) lipid fosfatase, kata nest siste trinn av kardiolipin biosyntesen [9]. Viktigere er kardiolipin syntetisert og benyttet utelukkende innenfor mitokondrie, og de andre kritiske syntetiske enzymer av denne reaksjonsvei er kjent for å være forankret i den indre mitokondrie-membran [10]. Dette plasserer PTPMT1 spesifikt og selektivt på det sted kardiolipin biosyntese, og antyder at modulering av dette lipid kan være en kritisk funksjon av denne fosfatase.
forstyrrelser i kardiolipin homeostase har tidligere blitt knyttet til apoptose. Kardiolipin inne i den indre mitokondrie-membran er blitt vist å binde seg til cytokrom c, og det har blitt foreslått at oksydasjonen av dette lipid er nødvendig for full cytokrom c frigivelse og påfølgende mitokondrie-avhengig apoptose [11]. I tillegg har kardiolipin vært innblandet i målretting av mange pro-apoptotiske proteiner til mitokondriene, inkludert tBID, en BH3-bare protein kjent for å indusere cytokrom c frigjøring gjennom å fremme mitokondrie ytre membran permeabilization [12]. Som en blokk i apoptose er ansett for å være et kjennetegn på kreft [13], kan feilregulering av kardiolipin påvirke karsinogent potensial av cellene ved å påvirke deres evne til å gjennomgå celledød. I tillegg, endringer i den kardiolipin biosyntetiske vei har også blitt knyttet til apoptose. RNAi-mediert knockdown av kardiolipin syntase (CLS1; genet navn
CRLS1
). Er tilstrekkelig til å frigi cytokrom c fra den indre mitokondriemembranen, og sensitizes kreftceller til apoptotiske stimuli [14]
Til tross for slående homologi mellom PTPMT1 og en annen lipid fosfataseaktivitet, PTEN, innenfor sine katalytiske domener [8], en kjemisk screening tilnærming er identifisert en forbindelse, aleksidin dihydroklorid, som er spesifikk for PTPMT1
in vitro product: [15]. Alexidine dihydroklorid er et bisbiguanide sammensatt opprinnelig identifisert for sine anti-bakterielle egenskaper, men interessant er også identifisert som induserer mitokondrie dysfunksjon og apoptose [16]. Som PTPMT1 er lokalisert spesifikt i mitokondriene, kan aleksidin dihydroklorid være modulere mitokondriell dysfunksjon og påfølgende pro-apoptotiske virker via inhibering av PTPMT1 fosfatase-aktivitet.
Den foreslåtte rolle kardiolipin i den normale apoptotiske prosess, kombinert med den robust celle-død induserende fenotype av Alexidine dihydroklorid, ledet oss til hypoteser om at nedregulering av PTPMT1 genuttrykk vil indusere en apoptotisk mobil skjebne i kreftceller. For å utforske denne hypotesen, brukte vi RNAi til knockdown PTPMT1 og bestemme den cellulære resultat av tap av denne bestemte genet produktet. I tillegg har vi undersøkt effekten av PTPMT1-målsøkende forbindelse, aleksidin dihydroklorid, i sin evne til å indusere celledød både i kreftceller, så vel som for å sensibilisere disse celler overfor kjemoterapeutiske midler ved subletale doser. Her viser vi at RNAi-mediert stanse av PTPMT1 er tilstrekkelig til å fremkalle kreft celledød. Dette celledød fenotype er forbundet med slående metabolske forandringer, blant annet en betydelig nedregulering av kardiolipin ved tap av PTPMT1, så vel som en økning i ATP-nivåer selektivt i glukoseholdig medium. Disse data belyse en rolle for PTPMT1 som en kritisk overlevelse gen i kreftceller, og foreslår at målretting dette fosfatase kan være en effektiv måte å bevisstgjøre kreftceller til nå tilgjengelige kjemoterapeutika.
Resultater
RNAi -mediert knockdown av PTPMT1 årsaker celledød
for å undersøke effekten av å slå ned PTPMT1 på celle skjebne, benyttet vi to unike siRNA sekvenser rettet mot ikke-overlappende områder av PTPMT1 åpen leseramme. Hver av disse siRNAs gir robust knockdown av PTPMT1 mRNA-transkript 30 timer etter transfeksjon, med både PTPMT1 sirnas gi over 98% knockdown i forhold til GAPDH (figur 1A). For å finne ut om disse sirnas effektivt forstyrre PTPMT1 protein uttrykk, bestemt vi muligheten for hver siRNA å slå ned uttrykt, FLAG-merket protein (figur 1B, topp panel) samt endogene PTPMT1 (figur 1B, midtre panelet). Disse eksperimentene demonstrerer klart å stanse all PTPMT1 protein uttrykk 48 timer etter transfeksjon med hver siRNA.
(A) Kvantitativ RT-PCR analyse av PTPMT1 mRNA nivåer i HeLa celler etter knockdown med to ikke-overlappende PTPMT1-specfic sirnas eller en ikke-målsøkende kontroll. (B) HeLa-celler ble transfektert med to PTPMT1 sirnas eller et ikke-målsøkende kontroll i 48 timer. I ett eksperiment ble PTPMT1 overuttrykt (med et FLAG-merke) i 20 timer (total siRNA transfeksjon tid 48 timer) og ekspresjon ble probet med en FLAG antistoff (øvre panel). siRNA slå ned ble også bestemt for endogen PTPMT1 (midtre panelet). Tubulin (nederst panel) demonstrerer lik belastning av proteinlysatene i alle baner. (C-E) HeLa-celler ble transfektert med kontroll eller PTPMT1 sirnas og samlet opp etter angitte tidspunkter, ved hvilke celledød ble analysert ved propidiumjodid eksklusjon. Feilfelt angir standardavvik for tre eksperimenter. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av en students t-test; * – P 0,05; ** – P 0,01; *** – P 0,001. (F) HeLa-celler ble transfektert med kontroll eller PTPMT1 sirnas og analysert for levedyktighet i sann tid (mer enn 120 timer). Ved hjelp av xCELLigence system
Interessant nok begge disse siRNA sekvensene forårsake celledød etter 72 timer etter knockdown, som ble mer fremtredende på 96 og 120 timer etter knockdown (Tall 1C-E, F). For å bestemme prosentandelen av celler som gjennomgår celledød, utførte vi FACS-analyse av propidiumjodid-positive celler ved 72, 96 og 120 timer etter siRNA knockdown i celler transfektert med enten PTPMT1 siRNA eller et ikke-målsøkende kontroll. Som forventet, celler transfektert med et ikke-målrettet mot styre siRNA viste liten celledød over 120 timers periode overvåkes, med 10,8% maksimal celledød sett i løpet av denne tidsperioden (som bare er litt høyere enn basalt behandlede HeLa-celler (p = 0.2 -0.9, ns)). Tvert imot, enten siRNA rettet mot PTPMT1 forårsaket robust celledød, spesielt tydelig på 96 timer (PTPMT1 siRNA # 1 p 0,001; PTPMT1 siRNA # 2 p 0,05) og 120 timer (PTPMT1 siRNA # 1 p 0,01; PTPMT1 siRNA # 2 p. 0,001), som viste seg betydelig over begge ubehandlede celler (0 hr tilstand, figurene 1C-E) og tids matchet ikke-targeting kontroller
for å finne ut mer presise kinetikk dette celledød, vi overvåket sanntids cellelevedyktigheten ved transfeksjon av HeLa-celler med enten en ikke-målsøkende kontroll siRNA (blå) eller en av de to unike PTPMT1 siRNA-sekvenser (PTPMT1-1, grønn, PTPMT1-2, orange) (figur 1F). Recapitulating propidiumjodid- celledød data, både siRNA sekvenser begynte å bremse cellulær proliferasjon ca 72 timer etter transfeksjon og fremmet signifikant cellulær avdeling (indikativ for celledød) ved 96 og 120 timer etter transfeksjon. Disse dataene viser at uttrykk for PTPMT1 er nødvendig for cellenes levedyktighet i HeLa-celler, og antyder at PTPMT1 kan være nødvendig for levedyktighet i kreftceller.
PTPMT1 knockdown Årsaker Bax /Bak Dependent apoptose
Forrige rapporter har knyttet nedregulering av Cardiolipin nivåer med cytokrom c utgivelsen og allergi til apoptotisk celledød i kreftceller samt cardiomyocytes [14]; [17]. Således har vi antatt at celledød fenotype sett i respons til PTPMT1 knockdown var en iboende eller mitokondrie-avhengige, apoptotiske respons. For å bestemme hvorvidt PTPMT1 knockdown induserer apoptose, analysert vi caspase-3 cleavage, så vel som spalting av dets godt karakterisert substrat, PARP. Figurene 2A og B viser at ved 96 timer etter transfeksjon, ble celler transfektert med et ikke-målsøkende siRNA ikke viser anrikning i enten caspase-3 eller PARP-spaltning. Men transfeksjon med enten PTPMT1 målretting siRNA indusert en robust berikelse både caspase-3 (Tall 2C og D) og PARP cleavage (Tall 2E og F). Viktigere, både caspase-3 cleavage og PARP cleavage spor tett sammen i disse forsøkene, med vekt på apoptotisk fenotype etter PTPMT1 knockdown.
(A-F) Jakten celler ble transfektert med kontroll ikke-måls siRNA (A, D ), PTPMT1 siRNA # 1 (B, E), eller PTPMT1 siRNA # 2 (C, F) i 96 timer. Celler ble samlet opp og farget for spaltede caspase-3 (toppfeltene) eller spaltet PARP (bunnplater) under hver betingelse, med positivitet indikert som en økning i fluorescens på FACS-histogram (nedre høyre kvadrant). (G-I), HeLa-celler ble transfektert med kontroll, PTPMT1, og /eller BAX /BAK sirnas i 96 timer. Celler ble samlet opp og farget for spaltet caspase-3 (G, H) eller propidiumjodid positivitet (I). Feilfelt angir standardavvik for tre eksperimenter. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av en students t-test; * – P 0,05; ** – P 0,01; *** – P 0,001
Mens caspase-3 er en markør for apoptotisk celledød, er det aktivert i respons til både indre og ytre apoptotiske signaler.. For å avgjøre om PTPMT1 knockdown indusert mitokondrie-avhengig apoptose, brukte vi sirnas til dually knockdown de pro-apoptotiske proteiner BAX og BAK, hvis uttrykket er nødvendig for klassisk, mitokondrie-avhengig apoptose [18]. I nærvær av en ikke-målsøkende kontroll normalisert for siRNA konsentrasjon, PTPMT1 indusert caspase-3 spalting med lignende kinetikk som vist i figur 2C (figur 2G). Påfallende, men Bax /Bak dual knockdown fullstendig eliminert PTPMT1-mediert apoptotisk induksjon (figur 2 H). For å sikre at PTPMT1 knockdown ikke forårsaker en ikke-apoptotisk celledød i nærvær av Bax /Bak knockdown, vi gjentok disse forsøk og analysert celler for propidiumjodid positivitet. I samsvar med våre tidligere data, fører PTPMT1 siRNA en økning i propidiumjodid- positivitet over en ikke-måls kontroll (figur 2I, blå søyler). Denne økningen i celledød er fullstendig blokkert av Bax /Bak knockdown, noe som gir betydelig beskyttelse fra propidiumjodid- opptak sett i PTPMT1 knockdown celler (figur 2I, grønne linjer; p 0,01 for PTPMT1 siRNA # 1, p 0,001 for PTPMT1 siRNA # 2). Disse dataene viser at Bax /Bak uttrykk er nødvendig for PTPMT1-indusert celledød, og foreslår at PTPMT1 knockdown induserer en egenverdi, mitokondrie-avhengig apoptotisk celledød som er avhengig av cytokrom c utgivelsen.
PTPMT1 knockdown Årsaker apoptotiske celledød i flere kreftcellelinjer
Selv om våre data har vist at to uavhengige, ikke-overlappende PTPMT1 målrettet sirnas fremme en apoptotisk celledød i HeLa-celler, genet inaktivering av PTPMT1 i mus embryonale fibroblaster eller hematopoetiske celler har liten effekt på cellulær levedyktighet. Vi antok at nedregulering i transformerte celler kan ha en alternativ effekt på celle skjebne i forhold til disse ikke-transformerte, primære celler. For å finne ut om tapet av PTPMT1 induserer celledød i bare underpanelet av cellelinjer (som HELAS), eller har tilsvarende effekter i andre transformerte celler, valgte vi et panel av kreftcellelinjer som er svært mottagelig for siRNA transfeksjon (alle vev av opprinnelse (ben, hjerne, lunge og nyre); og tumorigenicity
in vivo
. I likhet med våre tidligere forsøk, ble disse cellelinjene transfektert med et ikke-målsøkende siRNA eller PTPMT1 siRNA # 1 og # 2. 120 timer etter transfeksjon, ble cellene samlet og analysert for apoptose via Annexin V-positivitet (y-akse Figurene 3A-C) og propidiumjodid positivitet (x-aksen, Figurene 3A-C). Som vist i figurene 3B og C, transfeksjon av både PTPMT1 sirnas forårsaket sterk økning i Annexin V og PI farging, noe som indikerer at disse sirnas føre disse cellelinjene for å gjennomgå apoptose. I de fleste cellelinjer som ble testet, var dette en robust reaksjon, med en gjennomsnittlig 3.8- og 3.9- gangers økning i celle-død som oppstår i seks av åtte cellelinjer som ble testet med PTPMT1 siRNA # 1 og # 2 siRNA, henholdsvis (figur 3D). Vi fant at celler 786-0, en renal karsinom-cellelinjer, ble ikke signifikant påvirket av PTPMT1 knockdown med enten siRNA (data ikke vist). Disse data viser at PTPMT1 knockdown forårsaker celledød i denne undergruppe av cancercellelinjer, noe som tyder på sin ekspresjon er kritisk for overlevelsen av disse cellelinjene.
(A-C) for lunge carcinoma cellelinje H1299 og osteosarkom cellelinje HOS ble transfektert med ikke-målsøkende (A), PTPMT1 siRNA # 1 (B) eller PTPMT1 siRNA # 2 (C). Etter transfeksjon av disse sirnas i 120 timer, ble populasjon av celler som gjennomgår apoptose og celledød målt gjennom propidiumjodid positivitet (y-aksen) og Annexin V positivitet (x-aksen). (D) Et panel av svært transfectable cellelinjer som stammer fra mange vevstyper (se fargede etiketter ovenfor heatmap) ble transfektert med ikke-målretting eller PTPMT1 sirnas. Celledød og apoptose ble analysert ved propidiumjodid og Annexin V positivitet som i (A-C). Ganger endring i apoptose ble bestemt ved å normal prosent celledød sett i celler transfektert med et ikke-målsøkende kontroll til en, med gangers endring som følge av mengden av celledød over denne terskelen i PTPMT1 knockdown-celler. Heatmap viser en rekke ganger endring fra 1 (svarte firkanter) til 5 + (fem eller høyere fold, rød kvadrat).
Titrering av PTPMT1 Knockdown Endrer Påvirkning av Cellular levedyktighet
RNAi titrering har blitt brukt tidligere for å bestemme en genekspresjon terskel som er nødvendig for cellulær levedyktighet [19]. I disse eksperimentene, ble siRNA oligonukleotider fortynnet og titrert ned til et lavt nivå nanomolar for å forstå den relative ekspresjonsnivået at et gen skal opprett for å indusere eller hindre en spesifikk cellulær skjebne, slik som celledød. Til mer fullstendig forstå siRNA-indusert celledød vi hadde sett i PTPMT1 knockdown celler, titrert vi hver PTPMT1 siRNA, samt en ikke-måls siRNA kontroll, og undersøkte effekten av disse differensialknockdowns på HeLa celle levedyktighet og spredning. Som forventet, titrering av en ikke-måls kontroll fra 50 nM ned til 5 nM hadde liten effekt på levedyktighet eller spredning kapasitet på HeLa-celler i løpet av en 120 timers tidsramme (figur 4A, B, marineblå datapunkter). PTPMT1 uttrykk ble forskjellig nedregulert ved titrering av både unik PTPMT1 sirnas, med økende knockdown effektivitet som hver siRNA konsentrasjon økt fra 5 nM til 50 nM (data ikke vist). Interessant, titreringen av hver PTPMT1 siRNA forandret proliferative og levedyktighet profiler av PTPMT1 knockdown celler; mens 25 til 50 nM PTPMT1 siRNA # 1 og # 2 er tilstrekkelig til å indusere cellulær løsgjøring, en indikasjon på celledød, 5 til 10 nM av den samme siRNA synes å stanse proliferasjon uten å indusere cellulær løsgjøring, som indikert ved en nøytral skråning på sanntid levedyktighet plott (figur 4A, B).
(A) HeLa-celler ble transfektert med en dose respons av ikke-måls (blå linje), PTPMT1 # 1 (grønn linje) eller PTPMT1 # 2 (oransje linje) siRNA over 120 timer. Cellene ble transfektert med 0, 5, 10, 25, eller 50 nM av hver siRNA og sanntids levedyktighet ble sporet ved hjelp xCELLigence. (B) Valuta endring i mobilnettet impedans, som reflekterer endringer i spredning (positiv helling) og /eller levedyktighet (negativ helling) i celler transfektert med kontroll eller PTPMT1 sirnas. En lavere hastighet av endring i impedans er forbundet med redusert cellulær festing, en indikasjon på celledød. Feilfelt angir standardavvik for tre eksperimenter. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av en students t-test; * – P 0,05; ** – P 0,01; *** – P 0,001
knockdown av PTPMT1 sensitizes kreftceller til å sublethal doser Paclitaxel
observasjon at forskjellsknockdown nivåer av PTPMT1 endret kreftcelle skjebne hevet muligheten for at. suboptimal knockdown av PTPMT1 (til et nivå som ikke er tilstrekkelig til å indusere apoptose) kan sensibilisere kreftceller for lave nivåer av kjemoterapeutisk som ellers ville være forholdsvis lite effektiv. For å teste denne hypotesen, transfektert vi 5 nM av kontroll eller PTPMT1-spesifikke sirnas i HeLa-celler i 30 timer før du utsetter disse cellene til å lave konsentrasjoner (5 nM) av kjemoterapeutiske paclitaxel i ytterligere 24 timer. Figur 5 viser at transfeksjon av HeLa-celler med lave nivåer av ikke-målsøkende siRNA ikke fremmer sensibilisering for lave doser av paclitaxel, med 5 nM paclitaxel å indusere en 21% reduksjon i cellelevedyktigheten ikke-målsøkende siRNA (figur 5A). Transfeksjon av 5 nM PTPMT1 var tilstrekkelig til å sensibilisere celler overfor paclitaxel behandling: mens 21% av kontrollceller gikk celledød i nærvær av 5 nM paclitaxel, 38% eller 57% av 5 nM PTPMT1 siRNA-behandlede celler gjennomgikk betydelig mer celledød i henhold de samme betingelser (sirnas 1 og 2, henholdsvis; p 0,01 til PTPMT1 siRNA # 1, s 0,001 til PTPMT1 siRNA # 2, figur 5B og C). Viktigere, ikke 5 nM av hver siRNA rettet mot PTPMT1 ikke medføre betydelig cellulær toksisitet på 72 timer (Figur 5D, E), som viser at døden indusert av 5 nM PTPMT1 siRNA kombinert med er 5 nM paclitaxel behandling trolig en synergistisk interaksjon. For å bekrefte disse observasjonene, bestemt vi populasjon av celler som gjennomgår celledød på paclitaxel eksponering etter inkubasjon med 5 nM PTPMT1 siRNA. Mens hverken 0,1 nM eller 1 nM paclitaxel induserer propidiumjodid positivitet i celler transfektert med et ikke-målsøkende siRNA (figur 5F, sorte stolper), begge disse doser av paclitaxel i betydelig grad øke populasjonen av celler som gjennomgår celledød etter transfeksjon med PTPMT1 sirnas ( Figur 5F, grå søyler). Samlet disse data viser at sub-letal RNAi-mediert knockdown av PTPMT1 er tilstrekkelig til å sensibilisere HeLa-celler for å subletale doser av det kjemoterapeutiske paclitaxel.
(A-C) HeLa-celler ble transfektert med 5 nM non for målretting for siRNA (A), PTPMT1 siRNA # 1 (B), eller PTPMT1 siRNA # 2 (C) i 30 timer før behandling med en dose respons av subletal paclitaxel (inntil 5 nM) i 24 timer. Levedyktighet ble målt ved hjelp av Cell Titer Glo. (D) Levedyktigheten av ubehandlede HeLa-celler transfektert med hver siRNA i 54 timer. (E, F) Kvantifisering av HeLa celle levedyktighet (E) eller HeLa celledød ved propidiumjodid utstøting (F) med 5 nM ikke-målretting eller PTPMT1 siRNA (54 hr total behandling) og 5 nM paclitaxel behandling (24 timers total behandling) . For hvert eksperiment, feilstolper indikerer standardavvik for tre eksperimenter. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av en students t-test; * – P 0,05; ** – P 0,01; . *** – P 0,001
PTPMT1 Knockdown induserer betydelige metabolske forandringer i kreftceller
Ved å bli identifisert som en mitokondrie fosfatase, ble PTPMT1 funksjon knyttet til mitokondrie stoffskiftet når det var vist at PTPMT1 knockdown fører til en sterk økning av cellulære ATP-nivåer i pankreatiske p-celler [7]. Nylig, PTPMT1 ble identifisert som en nøkkel fosfatase i biosyntesen av kardiolipin, en nøkkel mitokondriell lipid knyttet til både mitokondrie metabolisme og apoptose. Viktigere, mangler i cellulære Cardiolipin nivåer har vært knyttet til apoptose [14], [20], som fører oss til å undersøke om PTPMT1 knockdown i kreftceller endrer dette mitokondrie lipid. Jakten celler ble transfektert med et ikke-målretting eller pool av PTPMT1 siRNAs (sirnas # 1 + # 2) i 72 timer, hvorpå cellulære lipider var radiomerket, pakket ut, og løses via tynnsjiktskromatografi. I samsvar med tidligere publiserte resultater [9], ablasjon av PTPMT1 ekspresjon fører til en sterk reduksjon i kardiolipin nivåer i forhold til celler som uttrykker et ikke-målsøkende kontroll (77% reduksjon, p 0,001, figur 6A og B). Disse endringene i mitokondriell lipidsammensetning er blitt demonstrert å endre den metabolske kapasiteten av celler, med tap av PTPMT1 ekspresjon resulterer i en økning i ATP-nivåer som følge av en kompenserende forskyvning til forbedret glykolyse [9]. For å avgjøre om mitokondriell metabolisme endres i PTPMT1 knockdown celler, ble ATP-nivåer målt i celler som uttrykker enten en ikke-målretting eller PTPMT1 siRNA basseng (sirnas # 1 + # 2). Som vist i figur 6C, PTPMT1 knockdown celler har betydelig mer ATP pr celle enn celler transfektert med et ikke-målsøkende kontroll når dyrket i standard medium inneholdende glukose (40,5% mer ATP /celle, p 0,001). For å finne ut om denne økningen er avhengig av glukose metabolisme, også utførte vi dette eksperimentet i celler dyrket i media som kun inneholder pyruvat som en karbonkilde, ikke tillate glycolyic program å være engasjert. Under disse forhold er det ingen signifikant forandring i ATP-nivåer i PTPMT1 knockdown-celler sammenlignet med kontroll-celler (10% mer ATP /celle, figur 6C, p = 0,178). Til sammen tyder disse data på at PTPMT1 knockdown reduserer kardiolipin nivåer i HeLa-celler, noe som fører til en forbigående økning i ATP-nivåer uavhengig av mitokondriell metabolisme, mest sannsynlig på grunn av økt glykolyse.
(A, B) HeLa-celler ble transfektert med ikke-målretting eller en pool av PTPMT1 siRNAs (# 1 + # 2) i 72 timer. Celler ble inkubert med
32P-ortofosfat og radioaktivt merkede lipider ble ekstrahert og løst via tynnsjiktskromatografi. Cardiolipin er vist som det høyeste punktet avbildes på TLC plater (A), og total Cardiolipin nivåene ble kvantifisert (B). (C) Totalt ATP /celle ble undersøkt i celler transfektert med et ikke-målretting eller PTPMT1 dam av sirnas i 72 timer. ATP /celle ble bestemt i celler som vokser i både høye som inneholder glukose media eller media som kun inneholder pyruvat. Feil linjer indikerer standardavvik av minst tre forsøk. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av en students t-test; * – P 0,05; ** – P 0,01; . *** – P 0,001
Alexidine Dihydrochloride hemmer PTPMT1
in vitro Hotell og induserer apoptose i kreftceller
En fersk publikasjon har identifisert forbindelse Alexidine dihydroklorid som en selektiv hemmer av PTPMT1
in vitro product: [15]. Vi søkte å validere disse dataene ved hjelp av rekombinant PTPMT1. Som en kontroll ble også testet vi muligheten av aleksidin dihydroklorid for å inhibere MKP-3, en dobbel spesifisitet fosfatase med liten homologi til PTPMT1. I samsvar med data generert av Doughty-Shenton et al., Hemmer aleksidin dihydroklorid fosfatase aktiviteten til PTPMT1 med en betydelig lavere IC
50 enn andre fosfataser, inkludert MKP-3 (2,5 uM for PTPMT1 v. 265 pM for MKP-3- Figur 7A). Før den ble identifisert som en spesifikk inhibitor for PTPMT1 fosfatase-aktivitet hadde aleksidin dihydroklorid blitt vist å indusere apoptose i kreftceller [21]. For å bestemme om aleksidin dihydroklorid-indusert celledød i vårt eksperimentelle system, utførte vi en enkel dose respons eksperiment hvor vi utsettes HeLa-celler til to-gangers seriefortynninger av aleksidin dihydroklorid i 24 timer. I samsvar med forrige rapport, Alexidine dihydroklorid fremmet robust celledød, med en EC
50 nær 2,8 mikrometer (Figur 6b). Viktigere, denne konsentrasjonen er i nærheten av konsentrasjonen som spesifikt hemmer rekombinant PTPMT1
in vitro
, noe som tyder på at den spesifikke målrettingen av denne fosfatase kunne være ansvarlig for dette celledød fenotype.
(A) Rekombinant PTPMT1 og MKP-3 ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av aleksidin dihydroklorid,
in vitro
fosfatase analyser ble utført, og de resulterende virkning på enzymatisk aktivitet målt. IC
50 for hvert enzym ble beregnet og vises ved hjelp av Sigmaplot. (B) HeLa-celler ble behandlet med en doserespons av aleksidin dihydroklorid i 24 timer og resulterende endringer i levedyktighet ble målt ved hjelp av Cell Titer Glo. (C, D) HeLa-celler ble behandlet med aleksidin dihydroklorid i 24 timer før måling av celledød (C) ved propidiumjodidfarging (C) eller induksjon av apoptose av Annexin V-farging (D). For hvert eksperiment, feilstolper indikerer standardavvik for tre eksperimenter. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av en students t-test; * – P 0,05; ** – P 0,01; . *** – P 0,001
For å bekrefte at Alexidine dihydroklorid ble indusere en apoptotisk celledød i likhet med hva vi så med PTPMT1 siRNA knockdown, vi utsatt HeLa cellene til en dose respons av Alexidine dihydroklorid, å bestemme hvilke konsentrasjoner indusere celledød (via propidiumjodidfarging) og om dette celledød var apoptotiske (ved bestemmelse av Annexin V positivitet). Disse data viser at det er en dramatisk økning i HeLa celledød mellom 2,5 og 5 uM aleksidin dihydroklorid behandling (figur 7C), som stemmer overens med vår innledende doseresponskurve. Viktigere, dette skiftet til celledød er apoptotisk, som en tilsvarende økning i Annexin V-positive celler er synlig med det samme doserespons (figur 7D), og er i den lavt mikromolområde, som spesifikt målrettet PTPMT1 fosfataseaktivitet
in vitro
. Disse data tyder på at den apoptotiske fenotype indusert av Alexidine dihydrochloride behandling kan skyldes hemming av PTPMT1 fosfatase aktivitet.
sublethal Doser Alexidine Dihydrochloride er tilstrekkelig til å bevisstgjøre kreftceller for lave nivåer av paclitaxel, men er ikke helt avhengig av PTPMT1 Hemming
Våre data tyder på at sub-dødelige knockdown av PTPMT1 kan sensitiv celler til sub-dødelige doser av kjemoterapeutiske antydet at sub-dødelige doser av Alexidine dihydroklorid kan også resensitize celler til kjemoterapeutiske. Ved hjelp av doseresponskurver ble analysert på figur 6, behandlet vi HeLa-celler med en sub-letal dose av enten 0,5 uM eller 1 uM av aleksidin dihydroklorid i 24 timer. Viktigere, ingen konsentrasjon av medikament-indusert celledød i dette tidsrommet (figur 7B-D). Deretter utsettes de aleksidin dihydrochloride behandlede celler, eller celler behandlet med et kjøretøy bare kontroll, til en doserespons av paclitaxel i ytterligere 24 timer før analysering av levedyktighet. Begge dosene av aleksidin dihydroklorid var tilstrekkelig til å sensibilisere celler til et bredt spekter av paclitaxel-konsentrasjoner. Interessant, 0,5 mikrometer Alexidine dihydroklorid var ikke i stand til å betydelig bevisst celler til doser av paclitaxel under sine EF
50 (doser 0,01 til 7,8 nM, figur 8A). Men ved høyere doser, som alle overstiger 15,6 nM paclitaxel, er Alexidine dihydrochloride forbehandling stand til å betydelig bevisst celler til paclitaxel behandling (for 15,6 nM dose, p 0,05, for 31,25 til 250 nM paclitaxel, p 0,01, Figur 8A). Til sammenligning sensitizes 1fiM Alexidine dihydrochloride celler til paclitaxel ved alle doser som ble undersøkt (for 0,01 nM dose, p 0,05, for alle andre doser, p 0,001, 8B). For å bekrefte disse data bestemmes at det er prosentandelen av celler eksponert for subletale nivåer av aleksidin dihydroklorid (0,5 uM eller 1 uM) som en positiv flekk for propidiumjodid etter behandling med 1 nM paclitaxel. Mens behandling av celler med et kjøretøy har kun minimale effekter for å kontrollere celler eksponert for paclitaxel (8,0% v. 8,6% celledød, p = 0,24, NS, figur 8C), forbehandling av celler med enten 0,5 uM eller 1 uM aleksidin
