Abstract
All-trans retinsyre (ATRA) har vært mye undersøkt for behandling av mange kreftformer, inkludert prostata kreft.
HOXB13
, forstummet i androgen reseptor-negative (AR
-) prostata kreft celler, spiller en rolle i AR
– prostatakreft cellevekst arrest. I denne studien ment vi å belyse mekanismene som er involvert i spredning hemming av AR
– prostatakreftceller som utløses av Atrå. Vi oppdaget at Atrå var i stand til å indusere vekst arrestasjon og for å øke
HOXB13
uttrykk i AR
– prostatakreftceller. Både EZH2 og DNMT3b deltok i undertrykkelsen av
HOXB13
uttrykk gjennom en epigenetisk mekanisme som involverer DNA og histon metylering modifikasjoner. Spesielt EZH2 rekruttert DNMT3b til
HOXB13
arrangøren å danne en undertrykkelse kompleks. Videre Atrå kunne oppregulere
HOXB13
gjennom avtagende EZH2 og DNMT3b uttrykk og redusere deres samspill med
HOXB13
promoter. Samtidig ble metylering nivået av
HOXB13
promoter redusert ved behandling av Atrå. Resultatene fra denne studien innblandet en roman effekt av Atrå i hemming av veksten av AR
-. Resistente menneskelige prostata kreft celler gjennom endring av
HOXB13
uttrykk som følge av epigenetiske modifikasjoner
Citation: Liu Z, Ren G, Shangguan C, Guo L, Dong Z, Li Y, et al. (2012) Atrå Hemmer spredning av DU145 prostata kreft celler gjennom Redusere Metylering Nivå HOXB13 Gene. PLoS ONE syv (7): e40943. doi: 10,1371 /journal.pone.0040943
Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 20 april 2012; Godkjent: 15 juni 2012; Publisert: 13.07.2012
Copyright: © 2012 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra The National Natural Science Foundation of China (30971613, 31071149, 91019011, 30800557), og The Fundamental forskningsmidler for sentral universiteter (09ZDQD01). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste kreftformen hos menn i Europa, Nord-Amerika og i en rekke afrikanske land [1], [2]. Forekomsten av prostatakreft har økt som følge av aldringen av befolkningen over hele verden [3]. I dag, konvensjonelle behandlinger som kirurgi og hormonbehandling ofte mislykkes i å oppnå tilfredsstillende effekt. Videre kan kreftceller erverve hormon og resistente funksjoner under disse behandlings påkjenninger [4]. Så langt har arbeidet med å erobre denne ondartede sykdommen oppnådd begrenset suksess [5]. Dermed forskere rettet mot utvikling av nye og mer effektive terapeutiske strategier for prostatakreft forbli en åpen mulighet.
HOXB13
genet tilhører en stor homeobox super, hvorav mange er transkripsjonsfaktorer som regulere aksial regional spesifisering under embryonal utvikling [6], [7]. Begrenset uttrykk for
HOXB13
ble observert ved hale omfanget av ryggmargen, urogenitale sinus, og tykktarm og endetarm celler i en androgen-uavhengig måte; men det uttrykt i prostata med bemerkelsesverdig vev-spesifisitet for å opprettholde dets normale fysiologiske funksjon, og for å indusere terminal differensiering [8], [9].
HOXB13
er forstummet i androgen reseptor-negative (AR
-) prostatakreftceller. Jung
et al
. [5] viste at ektopisk uttrykk for
HOXB13
i en prostatakreft cellelinje indusert G1 cellesyklus arrest gjennom negativ regulering av T-celle faktor-4, men førte ikke til endring i apoptotiske rate. Overekspresjon av
HOXB13
i AR
– prostatakreftceller resulterte i signifikant inhibering av cellevekst [10]. Imidlertid er mekanismen bak dette genet Slå ikke fullt ut forstått. Nylig undersøkte vi funksjonene polycomb gruppe (PCG) proteiner og deres epigenetiske handlinger i stanse av
HOXB13
i prostatakreftceller, og fant ut at det var en crosstalk mellom histone acetylering og medlemmer av PCG proteiner på å undertrykke den
HOXB13
uttrykk [11]. I denne studien har vi gitt ytterligere bevis på at DNA metyltransferaser (DNMTs) og PCG proteiner synergi hemmet
HOXB13
promoter aktivitet.
All-trans retinsyre (ATRA), vitamin A metabolitt, skuespill en viktig rolle i utviklingen ved å regulere cellulære prosesser som proliferasjon, differensiering og migrering [12]. ATRA implementerer sin virkning ved å binde seg spesifikt nukleær reseptor superfamilie, retinsyrereseptorer (RARs). De RARs danner en heterodimer med retinoid X-reseptor [13]. Tidligere studier viste at behandling av leukemiske celler med ATRA førte til apoptose, formodentlig sekundære til differensieringsprosessen [14], [15]. Siden ATRA kan rette avvikende cellevekst og induserer apoptose, har det vært mye undersøkt i prekliniske og kliniske forsøk for behandling av mange krefttyper, inkludert tidlig magekreft og prostatakreft [16], [17]. I AR
– og medikamentresistent DU145 prostatakreftceller, ATRA ble demonstrert å øke følsomheten av celler til anticancermiddelet docetaxel; men mekanismene hvordan ATRA alene induserer cellevekstarrest forblir uklar [18].
PCG proteiner er globale repressorer av genekspresjon gjennom dannelsen av polycomb undertrykkende kompleks (PRC), for eksempel PRC1 og PRC2 [19]. Flere PCG proteiner har vært innblandet i onkogene aktiviteter [20]. Det har vært indikasjoner på at PCG repressor aktiviteten er økt i løpet av prostatakreft progresjon [21]. Videre noen
PCG
genprodukter ble også funnet å være nødvendig for stabil stanse av
Hox
gener gjennom
Drosophila
utvikling [22]. Enhancer av Zeste homolog 2 (EZH2), den katalytiske subenhet av PRC2, besitter en histon metyltransferase aktivitet for histone 3 lysin 27 trimethylation (H3K27me3), som etablerer et sterkt undertrykkende signal for genekspresjon [19]. Det ble vist at ektopisk overekspresjon av
EZH2
ikke bare stimulert celleproliferasjon, men også fremmet forankringsuavhengig vekst og celle invasjon
in vitro product: [20]. I motsetning til utarming av
EZH2
av små interfererende RNA (siRNAs) hemmet celleproliferasjon og indusert apoptose i prostata, bryst og tykktarm kreft celler [23], [24], [25].
Metylering av DNA er en viktig epigenetisk modifikasjon som påvirker gentranskripsjon. DNA metylering i pattedyrceller er etablert og vedlikeholdt av DNMTs. Metylering er initiert av høyt homolog DNMT3a og DNMT3b, og heritably formeres ved DNMT1 [26]. Av disse tre enzymene, oppregulering av
DNMT3b
er en egenskap ved mange kreftceller, og DNMT3b kan spille en kausal rolle i tumorgenese [27]. Studier i en musemodell viste at overekspresjon av
DNMT3b
, men ikke
DNMT3a
, fremmet kolon tumorigenesis i
ApcMin /+
mus [28]. En tidligere studie viste at uttrykk for
HOXB13
ble kontrollert i en metylering avhengig måte og dens metylering ble positivt korrelert med tumor klasse og microvessel invasjonen [29]. I tykktarm kreft celler,
HOXB13
, som et mål av DNMT3b, ble metylert ved en oppstrøms CpG øy, og fungerte som en tumor suppressor i grunnskolen tykktarmssvulster [26].
Siden DNMT3b gjør ikke har DNA-bindende domener, må det transkripsjons co-faktorer for å kommunisere med spesifikke gensekvenser [30]. Det har vært kjent at mange medlemmer av GF, for eksempel EZH2, besitter bindende domener for
HOXB13
promoter, og de undertrykke
HOXB13
uttrykk gjennom histone metylering [31]. Betydelig, EZH2 har vært innblandet å spille en nøkkelrolle i formidling av både histon metylering og DNA metylering av
HOXB13
genet i enkelte kreftceller [21], [32]. Også vi tidligere rapportert at YY1 og histondeacetylase 4 (HDAC4) påvirket prostatakreft cellevekst ved å undertrykke
HOXB13
transkripsjon gjennom histone modifikasjon [11]. Disse tilgjengelige data fascinert oss å spekulere i at EZH2 kan være i stand til å rekruttere DNMT3b til
HOXB13
arrangøren å undertrykke sitt uttrykk gjennom bestemte epigenetiske modifikasjoner.
Hensikten med denne studien var å belyse de mekanismer som er involvert i hemming av proliferasjon i AR
– prostatakreftceller som utløses av ATRA. Våre resultater viser at Atrå hemmet veksten av DU145 prostatakreftceller gjennom upregulating
HOXB13
uttrykk ved å redusere sin metylering nivå. Dette ble oppnådd ved Atrå å svekke virkningen av EZH2 og DNMT3b, som er ansvarlig for metylering av
HOXB13
promoter. Data raknet fra denne studien kan gi nyttige ledetråder til utvikling av nye terapeutiske strategier for AR
– prostatakreft som innebærer bruk av Atrå og epigenetiske modifikatorer
Resultater
HOXB13 var involvert. i ATRA-indusert DU145 cellevekstarrest
ATRA ble rapportert å være i stand til å indusere cellevekstarrest, men mekanismen er ikke fullstendig klar. Overekspresjon av HOXB13 i AR
– prostatakreftceller kan også resultere i signifikant inhibering av cellevekst. For å avklare om HOXB13 spiller en rolle i Atrå-indusert vekst arrest i prostatakreftceller, må vi først testet den relative celleoverlevelsesrate på behandling av Atrå. DU145-celler ble utsatt for økende konsentrasjoner av ATRA (fra 20 til 120 uM) i 24, 48 og 72 timer. Som vist i fig. 1A og 1B, ATRA faktisk indusert cellevekstarrest i DU145-celler på en doseavhengig måte. Høy cytotoksisitet ble observert ved 72 timer. I mellomtiden ble både HOXB13 mRNA og proteinnivåer forhøyet i DU145 cellene ved Atrå behandling (Fig. 1C). Vi bekreftet ytterligere effekt av Atrå i en annen AR
– prostatakreft cellelinje PC-3, og vi har observert lignende doseavhengig effekt av Atrå på cellevekst arrest, som avslørt av MTT-analyser (Fig S1.). I mellomtiden, både HOXB13 mRNA og proteinnivåer ble også forhøyet ved Atrå behandling (fig. S2).
(A) Doseavhengig effekt av Atrå på DU145 cellevekst arrest. DU145-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av ATRA til 72 timer. *
P
0,05, **
P
0,01 (n = 6). (B) Tid løpet av vekststans effekt av ATRA i DU145-celler. *
P
0,05, **
P
0,01 (n = 6). (C) ATRA øket HOXB13 ekspresjon i DU145-celler. DU145-celler ble behandlet med 80 pM av ATRA i 72 timer. Total RNA ble ekstrahert for RT-PCR (
uppe
r), og de helcellelysater var forberedt på western blotting (
lavere
). (D) Atrå-indusert DU145 cellevekst arrest ble delvis reversert ved undertrykkelse av HOXB13 uttrykk. Den cellevekst potente ble målt ved MTT-analyser. *
P
0,05, **
P
0,01 (n = 6)
Neste, for å teste rolle HOXB13 i ATRA-. mediert DU145 cellevekst arrest, vi transient transfektert
HOXB13
siRNA plasmid inn DU145 celler behandlet med Atrå. Konstruksjonen og forstyrrer effektiviteten til HOXB13 siRNA ble beskrevet i vår tidligere rapport [11]. Vi fant at knockdown av HOXB13 av siRNA tilsynelatende reversert cellevekst arrest indusert av ATRA (Fig. 1 D). Dette impliserte at Atrå-indusert DU145 cellevekst arrest ble forbundet, i hvert fall delvis, med uttrykk for HOXB13.
DNMT3b Deltatt i HOXB13 Transkripsjonell undertrykkelse
HOXB13
-genet er slått av i AR
– prostatakreftceller og overekspresjon av HOXB13 i AR
– prostatakreftceller resulterte i signifikant inhibering av cellevekst [10]. Vi undersøkte de molekylære hendelser som er involvert i
HOXB13
genet Slå i AR
– prostata kreft celler. Arrangøren av
HOXB13
er ofte rapportert å være hypermethylated i ulike kreft [33]. For å avklare om lyddemping av
HOXB13
genet formidles av DNA hypermethylation i AR
– prostata kreft celler, vi vurderte metylering status for
HOXB13
promoter ved hjelp av sulfitt-sekvensering PCR (BSP), og vi fant at
HOXB13
promoter ble mer intensivt metylert i DU145 cellene i forhold til at det i de ringe ondartede LNCaP celler (fig. 2A, B).
BSP analyser viste metylering av CpG øyer på HOXB13 promoteren i svært maligne celler DU145 (A) og i ringes ondartede LNCaP-celler (B). (C) HOXB13 ble oppregulert i DU145-celler transfektert med den DNMT3b siRNA plasmid, sammenlignet med celler transfektert med kontroll siRNA vektor. (D) BSP analyser viste redusert metylering nivået HOXB13 promoter i DU145 cellene transfektert med DNMT3b siRNA (
lavere
), sammenlignet med kontroll siRNA (
øvre
).
Siden DNA-metyltransferase DNMT3b spiller en viktig rolle i metylering av kreft-relaterte gener, og
HOXB13
ble rapportert å være et målgen av DNMT3b i primær kolorektale tumorer [26], [27], vi spekulert i at DNMT3b kan også være involvert i
HOXB13
transcriptional undertrykkelse i DU145 cellene. For å bekrefte denne antakelsen, vi banket ned DNMT3b uttrykk med en bestemt siRNA, og vi fant at HOXB13 uttrykket ble tilsynelatende økt i DU145 cellene og forstyrrer effektiviteten av DNMT3b siRNA ble vist (Fig. 2C). Resultatene fra BSP analyser viste at nivået av metylering
HOXB13
promoter i DU145 ble redusert etter knockdown av det endogene DNMT3b (fig. 2D, lavere), sammenlignet med kontrollceller (fig. 2D øvre). Disse resultatene antydet at DNA metylering modifikasjon formidlet av DNMT3b var ansvarlig for stanse av
HOXB13
i DU145 cellene.
PCG Proteiner EZH2 og BMI1 Deltatt i HOXB13 Transkripsjonell undertrykkelse
Deretter beregnet vi å bestemme transkripsjonsfaktor (er) som kan delta i reguleringen av
HOXB13
genet. GF proteiner er blitt rapportert å spille en rolle i progresjon av prostata og bryst kreft, så vel som i stanse av
HOXs product: [3], [21], [34], [35]. Vi først fastslått at uttrykk for PCG proteiner EZH2 og BMI1 var signifikant høyere i svært maligne DU145 cellene enn i ydmyk ondartede LNCaP celler, og deres uttrykk er negativt korrelert til HOXB13 uttrykk, som avslørt av RT-PCR og Western blotting (fig. 3A, B).
mRNA (A) og protein (B) nivåer av BMI1, EZH2 og HOXB13 i ulike malignitet prostatakreftceller, LNCaP og DU145. (C) Et mRNA-nivåene av HOXB13 og EZH2 i DU145-celler transfektert med plasmid EZH2 siRNA. (D) mRNA nivåer av HOXB13 og BMI1 i DU145 cellene transfektert med BMI1 siRNA plasmid. (E) De proteinnivåer HOXB13 og EZH2 i DU145-celler transfektert med plasmid EZH2 siRNA. (F) Protein nivåer av HOXB13 og BMI1 i DU145 cellene transfektert med BMI1 siRNA plasmid.
For ytterligere å avklare om EZH2 og BMI1 deltatt i
HOXB13
transcriptional undertrykkelse i DU145 prostatakreft celler, bygget vi EZH2 siRNA og BMI1 siRNA plasmider og transfektert dem inn DU145 cellene hhv. Vi har oppdaget at både HOXB13 mRNA (Fig. 3 C, E) og protein (Fig. 3D, F) nivåer ble oppregulert når EZH2 og BMI1 ble slått ned. Den inhibitoriske effektiviteten av slike siRNA plasmider på endogen EZH2 og BMI1 på mRNA og proteinnivåer ble vist (Fig.3C, D og E, F). Resultatene indikerte at EZH2 og BMI1 kan undertrykke HOXB13 uttrykk ved formidling av histone metylering modifikasjon.
DNMT3b ble rekruttert til HOXB13 Arrangøren av EZH2
Som co-repressors av transkripsjon, DNMTs ikke besitter kanoniske DNA-bindende domener, og de er vanligvis rekruttert til spesifikke regioner av kromatin transkripsjonsfaktorer [26], [30]. Betydelig, EZH2 har blitt rapportert å spille en nøkkelrolle i formidling av både histon metylering og DNA metylering av
HOXB13
genet i enkelte kreftceller [21], [32]. Vi ønsket da å avgjøre om EZH2 rekrutterer DNMT3b til
HOXB13
promoter. Vi utførte Chip-analyser for å påvise endringer i foreningen av EZH2 på de tre definerte områder (P1-P3) av
HOXB13
arrangøren på knockdown av endogen EZH2. Den langt oppstrøms P4 region ble valgt som en negativ kontroll (Fig. 4A). Brikken Resultatene viste at den overflod av EZH2 på P1-P3 på
HOXB13
promoter ble redusert når endogene EZH2 ble undertrykt av
EZH2
siRNA i DU145 cellene. Samtidig, det H3K27me3 nivå forbundet med EZH2 funksjon på P1-P3 ble tilsynelatende redusert (Fig. 4B).
(A) Diagram av 5′-fl anking regionen HOXB13 genet. P1, P2 og P3 betegner de tre promoter-regionene HOXB13 genet analysert i Chip-analyser, og P4 er en distal negativ kontroll. (B) Chip-analyser i DU145 cellene transfektert med EZH2 siRNA og immunopresipitert med anti-EZH2 antistoff og anti-H3K27me3 antistoff hhv. (C) CoIP analyser for å påvise foreningen av DNMT3b med EZH2 i DU145 cellene. Celle nukleære ekstrakter ble fremstilt og utfelt med anti-EZH2 eller anti-DNMT3b antistoff, og påvist ved immunblotting med anti-DNMT3b eller anti-EZH2 antistoff. (D) brikke analyser ble utført i DU145-celler transfektert med EZH2 siRNA og DNA ble immunopresipitert med anti-DNMT3b antistoff. Mengdene av utfelt DNA ble bestemt ved hjelp av PCR.
Videre CoIP analyser med DU145 celleekstrakter viste at kompleksene ble immunopresipitert med anti-DNMT3b eller anti-EZH2-antistoffer, og kan påvises i immunblotting med anti -EZH2 eller anti-DNMT3b antistoffer, henholdsvis (fig. 4C), som tyder på at DNMT3b og EZH2 var til stede i det samme kompleks. Våre data brikke i fig. 4D videre indikert at overflod av DNMT3b ved de tre promotorområdene (P1-P3) ble redusert ved den knockdown av endogent EZH2. Dermed disse resultatene gitt bevis for at DNMT3b ble rekruttert til
HOXB13
arrangøren av EZH2.
Atrå Nedsatt EZH2 og DNMT3b Expression og svekket deres interaksjoner med HOXB13 Arrangøren
Vi har vist ovenfor at HOXB13 ble nedregulert av EZH2 og DNMT3b, og Atrå behandling resulterte i en økning i
HOXB13
uttrykk i DU145 cellene. For å bekrefte vår antagelse om at Atrå kan lette HOXB13 uttrykk gjennom å svekke de negative regulatoriske virkningene av EZH2 og DNMT3b på HOXB13, vi undersøkte EZH2 og DNMT3b uttrykk i DU145 celler behandlet med 80 mikrometer Atrå, og 5-aza-2′-deoxycytidine (5 -aza-dc) ble anvendt som demetyleringen kontroll. Resultatene viste at uttrykkene for både EZH2 og DNMT3b ble nedregulert etter ATRA-behandling på både mRNA og proteinnivåene (fig. 5A, B). Lignende resultater ble oppnådd fra en parallell studie ved hjelp av en annen AR
-. Ondartet prostatacancercellelinje PC-3 (Fig. S2)
Behandling av 80 uM av ATRA oppregulert HOXB13 og downregulated EZH2 og DNMT3b uttrykk ved mRNA nivå (A) og proteinnivå (B) i DU145-celler. 5-aza-dc ble anvendt som en positiv kontroll demetylering. Kontroll 1 var isopyknisk absolutt etanol og kontroll 2 var isopyknisk eddiksyre (C) Atrå svekket bindingene av EZH2 og DNMT3b, og redusert H3K27me3 nivået HOXB13 promoter. Chip-analyser ble utført i DU145 celler behandlet med 80 pM ATRA og immunopresipitert med anti-H3K27me3, anti-DNMT3b eller anti-EZH2 antistoff. Mengden av utfelt endogen HOXB13 promoter DNA ble bestemt ved PCR. (D) BSP analyser viste redusert metylering av HOXB13 promoter i DU145 celler etter behandling ved 80 mikrometer Atrå, sammenlignet med ubehandlet kontroll.
Våre chip analyser videre vist at bindingene av endogen EZH2 og DNMT3b på
HOXB13
promoter ble redusert etter Atrå behandling, og i mellomtiden H3K27me3 nivåene på P1-P3 regioner ble tilsynelatende redusert (fig. 5C).
videre BSP analyser viste at behandling med Atrå resulterte i reduksjon av metylering nivå av CpG øyer på
HOXB13
promoter i motsetning til ubehandlede DU145-celler (fig. 5D). Angivelig, EZH2 rekruttert DNMT3b til
HOXB13
promoter og utløste genet stillhet ved å fremkalle den H3K27me3 og ved å øke metylering av CpG øyer. I mellomtiden, både DNA metylering og H3K27me3 av
HOXB13
arrangøren kan reduseres ved Atrå.
Diskusjoner
Atrå spiller en avgjørende rolle i utviklingen ved å regulere ulike cellulære prosesser og det har vært mye undersøkt i prekliniske og kliniske forsøk som et middel for behandling av mange krefttyper, inkludert tidlig magekreft og prostatakreft [16], [17]. Også HOXB13 ble vist seg å spille en rolle i vekst arrest i AR
– prostata [10], tykktarmskreft [26] og nyrecellekreft [29]. I tråd med disse tidligere data, resultater fra denne studien viser at Atrå var i stand til å indusere vekst arrestasjonen av to AR
– (.. Fig 1A og Fig S1) prostatakreftceller DU145 og PC-3 på en doseavhengig måte , og denne effekten ble delvis oppnådd gjennom å fremme HOXB13 mRNA og proteinproduksjon (fig. 1C og S2, S3). Derimot har en fersk rapport beskrevet som knockdown av endogen HOXB13 av RNA interferens i humane eggstokkreft cellelinjer ble assosiert med redusert celleproliferasjon [36]. Disse motstridende beskrivelsene kan være resultatet fra den tilsynelatende forskjell mellom ovarie og andre organer, ettersom HOXB13 er unexpressed i normal ovarie [36], mens det uttrykkes på et høyt nivå i normal prostata og nyre [5], [29]. Likevel, data som presenteres i denne rapporten dokumentere at Atrå behandling hemmet veksten av DU145 prostata kreft celler, gjennom en mekanisme som er involvert i oppregulering av HOXB13 ved å redusere metylering nivået på genet promoter.
DNA metylering katalyseres og vedlikeholdes av DNMTs. Visse DNMTs, uttrykt ved relativt lave nivåer i somatiske celler, blir ofte oppregulert i kreftceller. Få-of-funksjon studier viste at DNMT3b men ikke DNMT3a fremmet kolon tumorigenesis i APC
Min /+ mus ved å fremkalle
de novo
metylering av flere gener som bærer CpG øyer [26]. Det var også tegn på at uttømming av DNMT3b resulterte i økt apoptose hastighet og redusert migrasjon av PC-3 prostatakreftceller [37]. I denne studien viste vi at HOXB13 ekspresjon ble stille i DU145 (fig. S4), og BSP-analyser avslørte at dens taushet kan være relatert til den hypermethylation av genet promoter (fig. 2A). Det ble rapportert at
HOXB13
genet var et mål av DNMT3b i tykktarm kreft celler [26]. Det blir derfor viktig å forstå funksjonen av DNMT3b i stanse av
HOXB13
genet i DU145 prostatakreftceller. Våre resultater viser at DNMT3b kunne regulere
HOXB13
transkripsjon gjennom å endre DNA metylering modifikasjon på genet promoter, selv om knockdown av DNMT3b ikke redusere metylering av CpG i
HOXB13
promoter som forventet (Fig. 2C, D). Angivelig, kan andre mekanismer eksisterer underliggende DNMT3b-mediert
HOXB13
undertrykkelse.
I særdeleshet, normal og avvikende metylering mønstre kan være mediert av kromatin proteiner guiding DNA metyltransferaser til sine mål gener [38] . Nå nylig ble PCG protein EZH2 rapportert å rekruttere DNA metyltransferaser, spesielt DNMT1 og DNMT3b, å gjennomføre stanse av
MYT1 Hotell og
WNT1
loci gjennom DNA-metylering [21], [32 ]. Overekspresjon av EZH2 oppstår vanligvis i en mangfoldig av maligniteter, inkludert prostata, bryst og lever kreft, særlig i avanserte tilfeller [39]. Varambally
et al product: [40] konkluderte med at deregulert uttrykk for EZH2 kan være en årsak til prostata kreft progresjon, samt å være en markør som skiller lat prostatakreft fra de i fare for dødelig progresjon. Våre resultater antydet at PCGS deltatt i prostata kreftutvikling. Vi viste at ekspresjon av EZH2 og BMI1 var mye høyere i DU145-celler enn i LNCaP-celler (fig. 3A, B). Mer interessant, fant vi ut at PCGS trykt HOXB13 uttrykk i DU145 cellene. RT-PCR og Western blotting analyser viste at HOXB13 uttrykk ble oppregulert når EZH2 og BMI1 ble slått ned (fig. 3C, D, E og F). Videre våre chip analyser viste at EZH2 var i stand til direkte å binde på
HOXB13
promoter (fig. 4B), og dette kan være en stillemekanisme av
HOXB13
i DU145 ondartet prostatakreft celler.
det er blitt foreslått at EZH2 undertrykker transkripsjon av målgener hovedsakelig gjennom to ulike mekanismer. Den første innebærer binding av EZH2 til målet genets promotor for å indusere H3K27me3 modifikasjon, og dermed redusere promoteraktivitet [39], [41]. Den andre mekanismen antyder at EZH2 rekrutterer en co-repressor eller komplekse, for eksempel DNMT1 og DNMT3b, til arrangøren og dette samarbeidet repressor enten negativt påvirker andre faktorer som er til stede, eller endrer den lokale kromatinstruktur å lette undertrykkelse [30], [35]. Tilsynelatende Resultatene fra denne studien er generelt enighet med begge de to modellene. Spesielt våre data viste at EZH2 var i stand til direkte å binde til
HOXB13
arrangøren å indusere H3K27me3 modifikasjon (fig. 4B). I mellomtiden våre data også foreslått at EZH2 kan rekruttere DNMT3b til
HOXB13
promoter for å påvirke promotoren metylering status og dermed undertrykke gentranskripsjon (Fig. 4C, D). Disse resultatene gir ytterligere bevis for en crosstalk mellom de to forskjellige epigenetiske mekanismer i genet stillhet.
Atrå er vanligvis brukes i kombinasjon med andre stoffer, slik som docetaxel, TSA og zoledronsyre i prostata kreft terapi [18], [42], [43], men den molekylære mekanisme av ATRA handling er uklar. Det faktum at EZH2 rekrutterer DNMT3b til
HOXB13
arrangøren å undertrykke genekspresjon, og at behandling med ATRA resulterer i oppregulering av HOXB13 uttrykk, fascinert oss å foreslå en hypotese om at Atrå kunne oppregulere HOXB13 gjennom å redusere metylering nivå av genet induseres av EZH2 og DNMT3b. Resultatene fra denne studien validert som uttrykk for
EZH2 Hotell og
DNMT3b
ble redusert etter Atrå behandling i både DU145 og PC-3 cellelinjer (Fig.5A, B og fig. S2, S3 ). Også bindingene av EZH2 og DNMT3b bort på
HOXB13
promotoren og H3K27me3 nivå hvorved det ble redusert i DU145 celler behandlet med ATRA (Fig. 5C). Interessant, BSP analyser viste at DNA metylering nivået av
HOXB13
arrangøren ble også redusert i DU145 cellene ved Atrå behandling (Fig. 5D).
Det er tre
RAR
gener, dvs.
RARα, β Hotell og
γ
i celler, og de er alle nødvendige for Atrå funksjon. Siden
RARβ
er forstummet i DU145 cellene, er følsomhet av DU145 cellene til Atrå lavere enn for LNCaP celler [44]. Samtidig vi undersøkte også effekten av ATRA i 293 og 293T-celler, de to normale humane embryonale nyrecellelinjer. Som forventet, følsomhet av disse cellene til ATRA var høyere enn i DU145-celler (fig. S5a). Merkbart, behandling av AR
– prostata kreft celler med Atrå endret ikke uttrykk for HOXB13, EZH2 og DNMT3b på mRNA nivå (Fig S5b.), Impliserer en annen mekanisme Atrå handling i denne mobil bakgrunn. Antagelig de epigenetiske modifikasjoner mediert av Atrå beskrevet i denne rapporten kan trolig være begrenset til visse kreftcelletyper som AR
– prostata kreft celler, siden det har vært noen rapporter om Atrå-medierte epigenetiske modifikasjoner i normale celler til dags dato. Likeledes mer ondartede og resistente PC-3 celler utstilt en enda høyere følsomhet til Atrå enn DU145-celler (fig. S1).
En tidligere rapport avslørt at redusert DNMT3b uttrykk resulterte i hypometylering av
retinoblastom (Rb)
,
RARβ
, og
adenomatøs polypose coli (APC)
genet arrangører [37]. Antagelig kan nedregulering av DNMT3b delvis forsterket følsomhet for DU145 cellene til Atrå, og dette kan etablere en positiv tilbakemelding mellom Atrå behandling og nedregulering av DNMT3b å lette HOXB13 uttrykk, og dermed å indusere vekst arrestasjonen av DU145 cellene. I denne studien fant vi at Atrå var i stand til å oppregulere uttrykk for HOXB13 og å indusere DU145 cellene vekst arrest som følge av redusert metylering nivået av
HOXB13
. Dette reiser et spørsmål om en synergistisk effekt mellom ATRA og DNMTs hemmere, f.eks 5-aza-dc, eksisterer. Resultater fra vår MTT og real-time PCR eksperimenter støttet denne antakelsen, da samtidig behandling av både Atrå og 5-aza-dc utstilt en mye sterkere hemmende effekter til DU145 celler enn hver av de to legemidlene alene (Fig. S6). I mellomtiden var det uttrykk for HOXB13 oppregulert, men begge EZH2 og DNMT3b ble nedregulert markert ved behandlingen av de to legemidlene (Fig. S7).
Til sammen data som presenteres i denne rapporten støtte en arbeidsmodell der HOXB13 , EZH2 og DNMT3b er involvert i Atrå-indusert cellevekst arrest i DU145 cellene (fig. 6). Spesielt hemmer Atrå spredning av DU145 prostatakreftceller gjennom å redusere metylering nivået av
HOXB13
promoter indusert av EZH2 og DNMT3b. I perspektiv, kan data som kommer fra denne studien gi nyttige ledetråder for utvikling av nye terapeutiske strategier for AR
-. Prostata kreft som involverer bruk av Atrå og epigenetiske modifikatorer
EZH2 binder direkte på HOXB13 promoter og induserer trimethylation av H3K27 å undertrykke HOXB13 uttrykk. DNMT3b rekrutteres til HOXB13 arrangøren av EZH2 å indusere DNA hypermethylation resulterer i ytterligere undertrykkelse av genet. I mellomtiden, undertrykker ATRA EZH2 og DNMT3b uttrykk, og svekker deres binding ved HOXB13 promoter for å redusere nivået av metylering HOXB13 promoter, noe som resulterer i aktivering av HOXB13, som i sin tur hemmer veksten av DU145 celler. Videre undertrykkelse av DNMT3b oppregulerer også
RARβ
uttrykk, noe som kan øke følsomhet av DU145 cellene til Atrå. En kombinert behandling av både Atrå og 5-aza-dc bringer om forbedrede effekter på HOXB13 oppregulering og hemming av veksten av DU145 cellene.
Materialer og metoder
Cell Kultur og reagenser
DU145, PC-3, LNCaP, 293 og 293T celler ble kjøpt fra Institute of Cell Biology (Shanghai, Kina).
