Abstract
Til tross for alle blodbaserte biomarkører brukes til å overvåke pasienter med prostatakreft, forblir prostatakreft som andre vanlige årsaken til kreftdødelighet hos menn i USA. Dette skyldes i stor grad manglende forståelse av molekylære mekanismer som er ansvarlig for aggressive former for prostatakreft, den kastrering resistent prostatakreft og metastatisk prostatakreft. Cellesignalveier aktivert av
ErbB2
onkogen eller
RAS
onkogen er ofte funnet som skal endres i metastatisk prostatakreft. For å evaluere og definere rollen til ErbB2 /RAS sti i prostata kreft metastase, har vi vurdert virkningene av
ErbB2 Anmeldelser – eller
RAS
-overexpression på metastatiske potensialer for fire prostatakreft celle linjer avledet fra svulster med forskjellige androgen følsomhet. For å gjøre dette, transfektert vi den menneskelige DU145, LNCaP og PC3 prostata kreft celler og murine Myc-Cap prostata kreft celler med aktivert form av
ErbB2
eller
H-RAS Hotell og vurderes deres metastatiske potensialer av tre komplementære analyser, en sårtilheling analyse, en transwell motilitet analysen, og et transwell invasjon analysen. Vi viste at mens overekspresjon av
ErbB2
økte metastatiske potensialet androgen-insensitive prostatakreftceller (dvs. PC3 og DU145), det gjorde ikke påvirke metastatiske potensialer av androgen-sensitive prostatakreftceller (dvs. LNCaP og myc-cap). I kontrast, etter overekspresjon av
H-RAS bare økt cellemotilitet av Myc-Cap-celler, som overuttrykker human
c-MYC
onkogen. Våre data tyder på at ErbB2 samarbeider med androgen aliserte til fremme prostata kreft metastasering, og at selv om RAS er en av de kritiske nedstrøms effektorer ErbB2, betyr det ikke phenocopy ErbB2 for sin innvirkning på metastatiske potensialer av prostatakreft cellelinjer.
Citation: Tome-Garcia J, Li D, Ghazaryan S, Shu L, Wu L (2014) ErbB2 Øker metastatisk Potentials Spesielt i androgen-insensitive prostata kreft celler. PLoS ONE 9 (6): e99525. doi: 10,1371 /journal.pone.0099525
Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina
mottatt: 11 april 2014; Godkjent: 15 mai 2014; Publisert: 17 juni 2014
Copyright: © 2014 Tome-Garcia et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle data er tilgjengelig i papir
Finansiering:. Oppstarts midler fra Rutgers New Jersey Medical School. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste ikke-hud kreft og andre ledende årsak til kreft dødelighet hos menn i USA [1]. Til tross for økt screening for tidlig oppdagelse og overvåking, prostatakreft spesifikk dødelighet har holdt seg på samme nivå [2]. Dette skyldes sannsynligvis både manglende evne til diagnostisk skille mellom de ikke-invasive, lat lokaliserte prostata kreft og de svært aggressive lokaliserte kreft med høye metastatiske potensialer, og dårlig forståelse av cellulære og molekylære grunnlaget for metastatisk prostatakreft [3].
en av de beste studert gener i menneske maligniteter, inkludert prostata kreft, er
ErbB2
eller
HER2
eller
NEU
onkogen. ErbB2 er et medlem av den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) familie, som består av fire elementer (EGFR, ErbB2, ErbB3 og ErbB4) som fungerer som tyrosin-kinase-reseptorer [4] – [7]. De er ansett som kraftige mediatorer for cellevekst og kreftutvikling [8] – [10]. I brystkreft, forsterkning eller overekspresjon av
ErbB2
er en vanlig hendelse som dukker opp i 15-30% av alle prøvene [11], og
ErbB2
genamplifisering og /eller overekspresjon har vært forbundet med en dårlig klinisk resultat [12], [13]. I samsvar med en viktig rolle ErbB2 i brystkreft metastaser, overekspresjon av en konstitutivt aktivert form av
ErbB2 plakater (dvs.
neut
) [14] i mus er tilstrekkelig til å utløse metastatisk brystsvulster [15 ]. Men den potensielle rolle ErbB2 i utviklingen av metastatisk prostatakreft er uklart dels fordi ulike forsøk på å vurdere frekvenser av
ErbB2
forsterkning /overekspresjon i menneskelige prostata kreft prøver gitt inkonsistente resultater [16] – [25]. Interessant,
ErbB2
overekspresjon har vært innblandet i androgen-motstandsdyktig metastatisk prostatakreft [26], noe som tyder på en mulig rolle for ErbB2 i oppkjøpet av metastatiske potensialer av prostata kreft celler.
Overuttrykte
ErbB2
resulterer i induksjon av flere signalveier, for eksempel fosfoinositid-3-kinase /protein-kinase B (PI3K /AKT) svei og mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) veien [27]. Både PI3K /AKT sti og MAPK-reaksjonsveien regulerer cellulær proliferasjon og celleoverlevelse, og har vært implisert i kreft-metastase [28] – [30]. Rektor nedstrøms effektor ErbB2 som regulerer disse to kinase stier er den onkogene
RAS
, selv om ErbB2 er også i stand til å aktivere PI3K /AKT uavhengig av
RAS
aktivering [31]. Viktigere, PI3K /AKT og MAPK er de eneste RAS-effektor veier vanligvis mutert i kreft hos mennesker [32].
RAS
onkogener kode tre monomere GTPases, H-RAS, N-RAS, og K-RAS, som aktiveres når det er bundet til GTP. Mens hemming av
RAS
i androgen-uavhengig PC3 prostatakreftceller og androgen-avhengige LNCaP prostatakreftceller ført til vekst og apoptose [33], konstitutiv aktivering av RAS /MAPK veien i LNCaP prostatakreftceller forfremmet androgen overfølsomhet [34]. I tillegg immunhistokjemisk analyse av hormon-sensitive og hormon-ildfast prostatakreft prøvene viste at økt uttrykk av
N-RAS
var assosiert med hormon-refraktær prostata kreft, og ble korrelert med kortere tid til tumor tilbakefall og redusert sykdomsspesifikk overlevelse [35]. I en xenograph musemodell, aktivering av to RAS effektor veier,
Raf /ERK Hotell og
RalGEF
, henholdsvis i moderat metastatisk DU145 prostatakreft cellelinje forfremmet metastaser til hjernen og bein, [ ,,,0],36]. Disse dataene antyder en mulig rolle RAS fremme metastaser i humane prostatakreft.
For ytterligere å definere de potensielle roller ErbB2 /RAS vei i å fremme prostata kreft metastasering, vi har undersøkt effekten av overekspresjon av
ErbB2
eller
RAS
på metastatiske egenskaper tre menneskelige prostata kreft cellelinjer og en murine prostatakreft cellelinje med ulike nivåer av androgen følsomhet og ulike metastatiske potensialer. For å gjøre dette, må vi først tilført tre vanlige menneskelige prostata kreft cellelinjer (DU145, LNCaP og PC3) og en murine prostatakreft cellelinje (Myc-cap) med aktivert form av
ErbB2
eller
H-RAS
. Vi vurderte deretter metastatiske potensialer av de genmodifiserte celler ved tre ulike komplementære analyser, en sårtilheling analyse, en transwell motilitet analyse, og en invasjon analysen. Vi fant at mens overekspresjon av
ErbB2
økt metastatiske potensialer spesielt for androgen-insensitive menneskelige prostata kreft celler, overekspresjon av
RAS
ikke har tilsvarende konsekvenser for metastatiske potensialer, men spesielt økt cellemotilitet av
c-MYC
-overexpressing murine Myc-Cap-celler.
Metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og cellekultur
Myc-Cap er en ikke-metastatisk, androgen -sensitive murine prostatakreft cellelinje som ble etablert fra primær prostatakreft isolert fra
Pb-Hi-Myc
mus [37]. LNCaP [38], DU145 [39], og PC3 [40] er tre menneskelige metastatisk prostatakreft cellelinjer med forskjellige androgen følsomheter og ulike metastatiske egenskaper (tabell 1). LNCaP og PC3 cellelinjene ble holdt i RPMI 1640 medium, og Myc-cap-celler ble dyrket i DMEM. Begge media ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). DU145-celler ble opprettholdt i DMEM: Hams F12-medium (01:01) supplementert med 10% serum fra nyfødt kalv. Amfotropisk Phoenix celler ble anvendt for retroviral transfeksjon og ble opprettholdt i DMEM supplert med 12,5% FBS. Senescent BJ humant hud-fibroblast-celler ble samlet ved replikative senescens [41] og ble anvendt som en positiv kontroll for β-galaktosidase-aktivitetsanalyse. De ble holdt i DMEM supplert med 10% FBS. Alle celler ble dyrket i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO
2.
Retroviral Transfeksjon
Retrovirale overekspresjon vektorer
pBabe-puromycin-H- Ras
og
pBabe-puromycin-erbB2
, som overuttrykker en mutert form for menneskelig
H-RAS
genet (
H-RAS
G12V
) og et konstituerende aktivert form av menneskelig
ErbB2
genet (
neut
), henholdsvis, var gaver fra Dr. Gustavo Leone. Høy titer virus ble produsert ved kalsiumfosfat transient transfeksjon av retrovirale konstrukter inn i amfotrofiske Phoenix pakkingscellene som tidligere beskrevet [42]. Vi infisert prostata kreft celler med nye retrovirus ved hjelp av standardmetoder, i nærvær av polybrene (4 ug /ml). Infiserte celler ble utsatt for markering med puromycin (2,5 ug /ml) i fem dager. Puromycin-resistente celler ble dyrket i frisk DMEM uten puromycin for en dag før de blir enten høster for å forberede cellelysater for Western blot-analyse, eller re-belagt for eksperimenter. Alle data presenteres ble samlet ved hjelp av celler fra minst to uavhengige retrovirale transfections som ga tilsvarende nivåer av
ErbB2 Hotell og
RAS
overekspresjon.
Western Blot
cellelysater med like mengder av proteiner (30 ug) ble separert på 8% SDS-PAGE, med unntak av ERK og ekstra fordel, hvor det cellelysatene ble separert på 10% SDS-PAGE. Separerte proteiner ble deretter elektroforetisk overført til en 0,45 uM nitrocellulosemembran (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), som deretter ble blokkert ved 4 ° C i 1 time med 5% fettfri tørrmelk i TBST (50 mM Tris, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Tween 20 (v /v)). Blottene ble deretter inkubert med hensiktsmessige fortynninger av primære antistoffer over natten ved 4 ° C i TBST inneholdende 3% fettfri tørrmelk. Primære antistoffer anvendt for Western blot-analyse omfatte polyklonale antistoffer for H-RAS (sc-520), E2F1 (sc-193), E2F2 (sc-633), ERK1 /2 (sc-135 900), og p-ERK1 /2 ( sc-81492) fra Santa Cruz Bioteknologi (Dallas, TX); aktin (A2066) fra Sigma (St Louis, MO); ErbB2 (MS-730-PI) fra Thermo Fisher Scientific (Fremont, CA); AKT (4691S), p-AKT (4060S), p38 (9212S), og p-p38 (9211S) fra Cell Signaling (Beverly, MA). Etter vasking av 10 min til tre ganger i TBST, ble blottene inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer fra Perkin Eimer (Boston, MA), enten mot kanin (NEF 812001EA) eller mot mus (NEF 822001EA) med en fortynning av 1:3000 i TBST med 3% melk. Etter tre vaskinger med TBST i 10 minutter hver, ble blottene inkubert ved romtemperatur i 1 time med ECL fra Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL), og eksponert for en røntgenfilm for autoradiografi. Antistoffer mot aktin ble brukt som laste kontroller. Kvantifisering av protein nivåer basert på bandets intensiteter på Western blot ble utført med bilde J programvare (NIH, MD, USA, https://rsb.info.nih.gov/ij/).
Sår helbredelse assay
migrasjon evnen som celler ble evaluert ved hjelp av en sårtilheling assay som tidligere beskrevet med mindre modifikasjoner [43]. Cellene ble sådd ut i 35 mm skåler og igjen å vokse til den når 100% samløpet. Konfluente celler ble holdt under de samme dyrkningsbetingelser i 48 timer for å indusere tetthet rest og for å minimalisere cellulær proliferasjon. Konfluente Platene ble skrapet ned tre ganger med en 200 mL pipette, skape venstre, midtre og høyre riper /sår som krysset med to horisontale linjer tidligere trukne som landemerker for kvantifisering. Etter skrape, ble platene vasket en gang med medium for å fjerne flytende celler, og ble erstattet med friskt medium. Celler ble tillatt å migrere på tvers av sårene og bildene ble tatt ved forskjellige tidspunkter ved hjelp av et fasekontrastmikroskop inntil såret var fullstendig lukket. Tids punkter hvor bildene ble tatt var avhengig av trekkfugl evne forskjellige cellelinjer studert. Hvert forsøk ble utført i tre paralleller, og ble gjentatt minst en gang for å validere de første data.
Motilitet Assay (Boyden kammer Assay)
motilitet av cellene ble også evaluert ved bruk av cellekulturer fra innsatser BD Falcon (Franklin Lakes, NJ), og følge protokollen som tidligere er etablert med mindre modifikasjoner [44]. Celler som tidligere ble opprettholdt i en sultemedium med 0,2% FBS i 24 timer for å redusere cellulær proliferasjon, ble resuspendert ved en konsentrasjon på 2 x 10
5 celler /ml i medium inneholdende 0,2% FBS. 1 x 10
5-celler eller 500 ul av cellesuspensjonen ble platet på hver pakning, som på forhånd var belagt med 3 ug /ml rottehalecollagen løsning fra BD (Bedford, MA) over natten ved romtemperatur. Det nedre kammer inneholdt medium med 10% FBS som en chemo-lokkemiddel. Celler ble tillatt å passere gjennom den porøse membran og ble samlet opp ved forskjellige tidspunkter som ble empirisk bestemt ut fra den trekkende evne til hver cellelinje. Ikke-migrerende celler ble deretter fjernet fra overflaten av membranene ved hjelp av bomullspinner. Celler som passerte gjennom porene i membranen ble fiksert og farget med Diff-Hurtig kjerner og cytoplasma flekker kit (Dade Behring, Newark, DE). Farget migrerende celler ble tellet under et mikroskop. Hvert forsøk ble utført i tre paralleller og ble gjentatt minst én gang for å validere de første dataene.
Invasion analysen
invasivitet av cellene ble målt ved hjelp av cellekulturinnsatser fra BD Falcon (Franklin Lakes, NJ) ved å følge en tidligere beskrevet protokoll med mindre modifikasjoner [45]. Som i transwell-baserte motilitet analysen beskrevet ovenfor, ble cellene holdt i et sult medium med 0,2% FBS i 24 timer før poding for å redusere cellulær proliferasjon. Inserts ble belagt med 50 pg /ml rottehalecollagen løsning fra BD (Bedford, MA) i 5 timer ved romtemperatur. Etter inkubering ble innsatser vasket tre ganger med serumfritt medium og ble tillatt å tørke ved 37 ° C over natten. Når tørket, membraner ble dekket med 100 ul av kollagen-oppløsning ved en sluttkonsentrasjon på 1,3 mg /ml (for alle celler) eller med 100 ul av Matrigel (Kat. # 356231) fra BD (Bedford, MA) ved en sluttkonsentrasjon på 300 mikrogram /ml (for bare Myc-Cap-celler), og fikk lov til å stivne ved 37 ° C. Cellene ble resuspendert ved en konsentrasjon på 2 x 10
5 celler /ml i medium inneholdende 0,2% FBS. 1 × 10
5 celler eller 500 mL av cellesuspensjoner ble platet på hvert innlegg. Den gjenværende prosedyre ble utført som beskrevet ovenfor i motilitet analysen delen. Hvert forsøk ble utført i tre paralleller, og ble gjentatt minst en gang for å validere de første data.
Vurdering av Senescence-assosiert β-galaktosidase aktivitet
endogene β-galaktosidase aktivitet av prostatakreftceller var bestemt ved X-gal-farging som tidligere beskrevet [46]. -Celler utsådd i 35 mm skåler i tre paralleller ble fiksert i tre minutter ved romtemperatur i 1 x PBS inneholdende 2% formaldehyd og 0,2% glutaraldehyd. Etter to på hverandre følgende vaskinger med 1 x PBS, ble cellene inkubert i 16 timer ved 37 ° C med fargeløsning (2 ml per skål) som består av X-gal ved en sluttkonsentrasjon på 1 mg /ml i dimetylformamid, 40 mM sitronsyre /natriumfosfatbuffer pH 5,7 (0,1 M sitronsyre /0,2 M natriumfosfat), 5 mM kaliumferrocyanid, 5 mM kaliumferricyanid, 150 mM natriumklorid og 2 mM magnesiumklorid. Bildene ble tatt under et fasekontrastmikroskop. Positive og negative celler ble talt fra minst tre ulike felt.
Cell vekstrate Assessment
prostata kreft celler ble sådd i 6-brønners plater i tre paralleller. Tettheten av den innledende seeding var empirisk bestemt å tillate oss å telle minst fire tidspunkter før cellene nådde 100% samløpet. Dermed celler ble sådd som følger: 70000 celler for PC3, 35000 celler for LNCaP, 120000 celler for DU145 og 70000 celler for Myc-cap. Tolv timer etter utsåing ble cellene tellet ved bruk av et hemocytometer (Hausser Scientific, Horsham, PA), for å bli normalisert som den tilsvarende seeding cellenummer, og for å bli brukt som det første tidspunktet. Cellene ble deretter telles hver 12 time for PC3 og Myc-Cap cellelinjer eller hver 24 time for DU145 og LNCaP cellelinjer. Vekstratene ble estimert ved å beregne og sammenligne den lineære skråningen for hver vekstkurve.
Statistical Analysis
Verdier er presentert som gjennomsnitt ± SD. Statistisk signifikans ble bestemt av Student
t
-test med en betydning terskelen til
P
0,05. I alle tall, ble statistiske betydninger betegnes som
*
P
0,05, **
P
0,01, og ***
P
0,001.
Resultater
Overuttrykte
ErbB2 Hotell og
RAS
Onkogener i Prostate Cancer Cell Grener Retroviral Infeksjon
for å overuttrykker
ErbB2 Hotell og
RAS
onkogener i prostatakreft cellelinjer, vi transfektert prostata kreft celler med
pBabe-Puromycin-
(
PBP-
) basert retrovirus overekspresjon en aktivert form av
ErbB2 product: (
PBP-ErbB2
) eller en mutert form av
H-RAS product: (
PBP-RAS
). Som vist i figur 1, Western blotting-analyse indikerte at transfeksjon av celler med
PBP-RAS
retrovirus ført til moderate up-reguleringer av
RAS
i området fra 1,5 ganger (for LNCAP) til 4,7 gangers (for PC3), og at transfeksjon av celler med
PBP-ErbB2
retrovirus førte til moderat up-reguleringer av
ErbB2
alt fra 2,5 ganger (for DU145) til 4,0 ganger (for Myc- CAP) Interessant, selv om
RAS
overekspresjon ikke endre protein nivåer av ErbB2,
ErbB2
overekspresjon forhøyet protein nivåer av RAS (2,9 ganger) spesielt i Myc-Cap-celler (figur 1), som overuttrykker human
c-MYC
onkogen [37].
ErbB2 og RAS proteinnivåene ble vurdert av Western blot som bruker antistoffer mot H-RAS eller ErbB2 for totale cellelysater fremstilt av prostatakreft celler transfektert med enten kontroll retrovirus (
PBP
), eller retrovirus overekspresjon
PBP Anmeldelser –
H-RAS product: (
RAS
) eller
PBP -ERBB2 product: (
ErbB2
). Blot med antistoffer mot aktin fungerte som lasting kontroller. Tall i hvitt representerer fold endringer i ErbB2 eller RAS protein nivåer i
ErbB2 Anmeldelser – eller
RAS
-overexpressing celler i forhold til de i tilsvarende
PBP
kontrollceller etter aktin normalisering.
Overuttrykte
ErbB2
fører til moderate økninger i cellevekst i LNCaP, DU145 og PC3 celler
Vurderer at aktivering av
erbB2
/
RAS
signalveien i prostatakreftceller kan påvirke deres vekstrater, noe som kan påvirke analysen for å vurdere deres metastatiske potensialer, gjennomførte vi en vekstkurve analyse ved bruk av asynkrone celler. Som vist i figur 2,
ErbB2-overekspresjon
ført til moderate økninger i vekstrater for alle de tre humane prostatacancercellelinjer: et gjennomsnitt på 43% økning i LNCaP-celler, 33% økning for DU145-celler, og 25% økning for PC3-celler. Men overekspresjon av
ErbB2
ikke påvirke veksten av murine prostatakreft cellelinje, Myc-cap. I kontrast,
RAS
overekspresjon hadde ikke signifikant effekt på vekstrater på noen av de fire cellelinjer (figur 2).
Cell vekstrater ble vurdert av celle teller hver 12 timer eller 24 timer for ulike prostata kreft celler som ble transfektert med kontrollretrovirus (
PBP
), eller retrovirus overekspresjon enten
PBP-H-RAS product: (
RAS
) eller
PBP-ErbB2 product: (
ErbB2
).
Overuttrykte
RAS
Reduserer Cell Migrasjon priser fra LNCaP og DU145 cellelinjer
effekten av
ErbB2 Hotell og
RAS
overekspresjon på metastatiske potensialer av LNCaP, DU145, PC3, og Myc-cap prostatakreft cellelinjer ble først vurdert ved å utføre en sårtilheling analysen. For å overvinne mulige virkninger av økt celledeling i
ErbB2
-overexpressing celler (figur 2) på sårtilheling analysen, induserte vi celletetthet arrest ved å opprettholde konfluente plater for 48 timer før du gjør riper /sår. Som vist i figur 3, overekspresjon av
ErbB2
og
RAS
viste forskjellige virkninger på de tre humane prostatacancercellelinjer. Spesielt mens overekspresjon av
ErbB2
hadde ingen signifikant innvirkning på migrasjon priser av alle de tre menneskelige prostata kreft cellelinjer, overekspresjon av
RAS
betydelig redusert vandringsrater LNCaP og DU145 celle linjer. Sammenlignet med de menneskelige prostata kreft cellelinjer, den murine prostatakreft cellelinje Myc-Cap syntes å ha lavere migrasjon priser, noe som gjenspeiles av det faktum at de ikke klarte å fullstendig lukke såret før de begynte å vokse igjen rundt 32 timers tidspunkt (data ikke vist), uavhengig av status for
ErbB2 Anmeldelser – eller
RAS
-overexpression (figur 3). Likevel,
ErbB2 Z -. Eller
RAS
-overexpressing MYC-Cap-celler hadde en moderat men statistisk ubetydelig økning i migrasjon priser i forhold til kontrollceller (figur 3)
Cell migrasjonsrater ble estimert ved en sårtilheling analyse for prostata kreft celler som ble transfektert med enten kontroll retrovirus (
PBP
), eller retrovirus overekspresjon
PBP Anmeldelser –
H-RAS
(
RAS
) eller
PBP-ErbB2 product: (
ErbB2
). Venstre paneler viste prosenter av sår forble ved ulike tidspunkt. Prosentene av sårene ble estimert basert på gjennomsnittet av 12 målinger på hver plate reflekterende målinger av fire jevnt fordelt seksjoner på hver av de tre sår /riper på hver plate. Data ble presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre gjentak. Høyre panel viser representative bilder tatt på forskjellige tidspunkter. Alle bildene ble tatt på samme skala med en skala bar på 200 mikrometer vist i det første bildet.
ErbB2
Overuttrykte Øker Cell Motilities av androgen-insensitive DU145 og PC3 celler og
RAS
overuttrykte Øker cellemotilitet av Myc-Cap Cells
for å utfylle sårheling data presentert ovenfor, har vi også vurdert effekten av overekspresjon av
erbB2
og
RAS
på cellemotilitet av prostata kreft cellelinjer ved en transwell-basert cellemotilitet analysen bruker porøs membran inserts i transwells. Mens sårtilheling analyse tiltak lateral cellemotilitet skyldes forstyrrelser i celle-celle interaksjoner [47], Boyden kamre Transwell analysen måler chemo-attraktiv migrasjon, som i motsetning til sårheling analysen, er uavhengig av brudd i celle-celle veikryss [48]. Derfor er disse to analyser er komplementære og er ofte brukt i parallell for å oppnå biologiske innsikt i forskjellige typer av cellemigrering. For å minimere effekten av differensialcellevekstrater på
ErbB2
overekspresjon på motilitet analysen, induserte vi cellesyklus arrest ved å opprettholde celler under serum sult betingelser for 24 timer før du utfører motilitet analysen. Som vist i figur 4, overekspresjon av
ErbB2
betydelig økt celle motilities av de to mer metastatisk, androgen-insensitive cellelinjer, DU145-celler og PC3-celler, med en økning på 30% og en 6-gangers økning, henhold . I kontrast,
ErbB2
overekspresjon betydelig redusert de motilities av de to ydmyk eller ikke-metastatisk, androgen-sensitive prostatakreftcellelinjer, LNCaP og Myc-cap. I tillegg, mens
RAS
overekspresjon betydelig redusert de motilities av LNCaP celler og PC3 celler, det betydelig økte bevegeligheten av Myc-Cap celler som overuttrykker
c-MYC
onkogen.
Cell motilities ble vurdert av en transwell-basert motilitet analyse for prostata kreft celler som ble transfektert med enten kontroll retrovirus (
PBP
), eller retrovirus overekspresjon
PBP Anmeldelser –
H-RAS product: (
RAS
) eller
PBP-ErbB2 product: (
ErbB2
). Hver søylediagram viste de relative antall celler som har gått gjennom transwellenheter /membraner, som ble farget og telles under et mikroskop for minst 10 felt per innsats. Data ble presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre gjentak. Representative bilder tatt på et gitt tidspunkt ble vist under hver søylediagram. Alle bildene ble tatt på samme skala med en skala bar på 200 mikrometer vist i det første bildet.
ErbB2
Overuttrykte Fremmer Cell Invasivitet i androgen-insensitive DU145 og PC3 celler
De metastatiske potensialer av
ErbB2 Z – eller
RAS
-overexpression i ulike prostatakreftcellelinjer ble videre undersøkt ved å vurdere deres relative invasivitet av en transwell basert invasjon analysen bruker celleinnsatser belagt med et kollagen matriks. Denne invasjonen analysen gjør det mulig for celler å gå gjennom en 100 um tykk kollagenmatriksen fra en lav-serumholdig medium til et serum anriket miljø. Som vist i figur 5, ble invasivitet av androgen-insensitive DU145-celler og PC3-celler i det vesentlige forsterket i nærvær av
ErbB2-overekspresjon
men ikke i nærvær av
RAS
overekspresjon. Disse data er i overensstemmelse med data fra transwellbaserte motilitet analysen viser at overekspresjon av
ErbB2
i DU145-celler og PC3-celler førte til økt celle motilitet (figur 4). I overensstemmelse med deres lave eller ingen metastatiske potensialer, hverken Myc-cap-celler eller LNCaP-celler viste seg å være i stand til å trenge inn i kollagenmatriksen, selv etter 96 timers inkubering (data ikke vist). Viktigere, overekspresjon av
ErbB2
eller
RAS
var tilstrekkelige til at enten Myc-cap celler eller LNCaP celler til å passere gjennom kollagen matrise (data ikke vist).
Cell invasivitet ble vurdert av en transwell basert invasjon analysen for prostata kreft celler som ble transfektert med enten kontroll retrovirus (
PBP
), eller retrovirus overekspresjon
PBP Anmeldelser –
H-RAS
(
RAS
) eller
PBP-ErbB2 product: (
ErbB2
). Hver søylediagram viste antallet celler som har gått gjennom kollagen matrise enten 72 timer (for PC3 celler) eller 96 timer (for DU145 celler) etter plating. Transwell inserts var farget og invaderende celler ble talt for hele innsatser. Data ble presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre gjentak. Representative bildene ble vist under hver søylediagram. Alle bildene ble tatt på samme skala med en skala bar på 200 mikrometer vist i det første bildet.
Siden overekspresjon av
RAS
økte cellemotilitet spesielt i Myc-cap celler (figur 4), utførte vi en transwell-basert invasjonen analysen på Myc-cap celler ved hjelp av Matrigel å erstatte kollagen. Sammenlignet med kollagen matriksen, er det Matrigel matrisen et rekonstituert basalmembran fremstilt fra en mus sarkom som bedre etterligner den ekstracellulære miljø av en kreft. Som i tilfellet av kollagen matriks, ble ingen celle-sett til å passere gjennom Matrigel matriksen enten i kontrollcellene eller i
RAS
-overexpressing-celler (data ikke vist).
moderat nivå av
ikke RAS
Overuttrykte ikke fremme Cellular senescence i prostata kreft celler
Tidligere studier har vist at langvarig uttrykk for onkogene
RAS
i menneskelige og gnager primær fibroblast celler
in vitro product: [49] eller høye nivåer av overekspresjon av oncognic
RAS
i mammary epitelceller
in vivo product: [50] førte til økt mobilnettet senescence. Siden
RAS
-overexpressing LNCaP celler og DU145 cellene viste reduserte evner til å lukke en provosert såret (figur 3), og siden
RAS
-overexpressing LNCaP celler og PC3 celler viste redusert celle motilities i transwell mobilitet analyse (figur 4), forsøkte vi å finne ut om redusert mobilitet i disse
RAS
-overexpressing menneskelige prostata kreft celler kan forklares med en potensiell økning i mobilnettet senescence i disse cellene. For dette formål anvendes vi
in vitro
X-gal-farging for å vurdere de senescence-assosierte β-galaktosidase-aktivitet, en vanlig brukt biomarkør for cellulær senescens [51]. Som vist i Figur 6A og 6B, moderate nivåer av
RAS
overekspresjon i vår eksperimentell innstilling (Figur 1) ikke signifikant økning mobilnettet senescence i LNCaP, PC3 og DU145 cellene, noe som gjenspeiles av det faktum at
RAS
-overexpressing celler viste lignende prosenter av X-gal-positive celler som de tilsvarende
PBP
kontrollceller. I kontrast, PC3 celler med et mye høyere nivå av
RAS
overekspresjon (dvs 13,6 ganger; figur 6C, «
Hi-Ras»
) viste en signifikant økning i andelen av X-gal -positive celler enn enten PC3 celler infisert med kontroll vektor (figur 6C, «
PBP»
) eller PC3 celler med en moderat uttrykk for
RAS plakater (dvs. 4,2 ganger; figur 6C «
RAS»
) (Figur 6A og 6B). Den økte prosentandel av X-gal-positive PC3-celler med et høyere nivå av
RAS
overekspresjon er forenlig både med begynnende alderdom-lignende morfologi (dvs. store og flate) (figur 6A) og med en tidligere rapport at høye nivåer av
Ras
overekspresjon ført til økt mobilnettet senescence [50]. Til sammen våre data tyder på at manglende evne til RAS for å fremme cellemotilitet eller invasivitet i menneskelig prostata kreft cellelinjer er ikke på grunn av for tidlig cellealdring.
(A) Senescence-forbundet β-galaktosidase virksomhet ble vurdert av X-gal farging for menneskelige prostata kreft cellelinjer transfektert med enten kontroll retrovirus (
PBP
) eller retrovirus overekspresjon
PBP-H-RAS product: (
RAS
). PC3 celler som uttrykker et ekstremt høyt nivå av
RAS product: (
Hi-RAS
) ble inkludert for sammenligninger. Senescent BJ humant hud-fibroblast-celler ble anvendt som en positiv kontroll for X-gal-farging. Representative bilder ble vist med representative X-gal-positive celler blir merket med røde piler. Setter inn i hvert bilde viste forstørret, representative X-gal-positive celler. (B) Kvantifiseringen av innsamlede data fra panelet (A). Data ble presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre gjentak.
