Abstract
Muscle blærekreft (MIBC, scene ≥T2) er vanligvis forbundet med dårlig prognose, som utgjør den nest vanligste dødsårsaken blant urin svulster. På grunn av molekylære heterogenitet betydelige variasjoner høye i naturhistorie og sykdom utfallet har vært observert. Dette har også forsinket innføringen av tilpassede behandlingsformer, noe som gjør avansert stadium av blærekreft nesten en foreldreløs sykdom i form av behandling. Endret protein glykosylering oversatt av ekspresjon av sialyl-Tn-antigenet (STN), og dets forløper Tn, så vel som aktivering av PI3K /Akt /mTOR-reaksjonsveien er kreft-assosiert hendelser som kan holde potensialet for pasientutvelgelse og ledet terapi. Derfor ble en retrospektiv utforming, 96 blæretumorer i forskjellige stadier (Ta, T1-T4) screenet for STN og fosforylerte former av Akt (pakt), mTOR (pmTOR), S6 (PS6) og PTEN, beslektet med det aktivering av PI3K /Akt /mTOR veien. I vår serie uttrykk for Tn var rest og var ikke knyttet til scene eller utfall, mens STN var statisk høyere i MIBC sammenlignet med ikke-muskel invasive svulster (p = 0,001) og tilhørende redusert kreftspesifikk overlevelse (log rank p = 0,024). Motsatt PI3K /Akt /mTOR pathway mellom viste en lik fordeling mellom ikke-muskel invasiv blærekreft (NMIBC) og MIBC og ikke forbinder med kreft-specif overlevelse (CSS) i noen av disse gruppene. Men overekspresjon av Pakt, pmTOR og /eller PS6 lov å diskriminere STN-positiv avansert stadium blære svulster som vender verste CSS (p = 0,027). Videre multivariat Cox regresjonsanalyse viste at overekspresjon av PI3K /Akt /mTOR pathway proteiner i STN + MIBC var uavhengig assosiert med omtrent seks ganger risikoen for død av kreft (p = 0,039). Mus med avansert stadium kjemisk indusert blæren svulster etterligne den histologiske og molekylære natur humane tumorer ble deretter administreres med mTOR-pathway inhibitor sirolimus (rapamycin). Dette reduserte antall invasive lesjoner og, samtidig, uttrykk for STN og også PS6, nedstrøms effektor av PI3K /Akt /mTOR veien. Som konklusjon, ble STN funnet å være markør av dårlig prognose i blærekreft og, i kombinasjon med PI3K /Akt /mTOR sti evaluering, har potensial for å forbedre lagdeling av trinn sykdom. Dyreforsøk tyder på at mTOR pathway hemming kan være en potensiell terapeutisk tilnærming for denne spesifikke subtype av MIBC
Citation. Costa C, Pereira S, Lima L, Peixoto A, Fernandes E, Neves D, et al. (2015) Unormal Protein glykosylering og aktivert PI3K /Akt /mTOR Pathway: Rolle i blærekreft Prognose og målrettede Therapeutics. PLoS ONE 10 (11): e0141253. doi: 10,1371 /journal.pone.0141253
Redaktør: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), SPANIA
mottatt: 28 juli 2015; Godkjent: 06.10.2015; Publisert: 16.11.2015
Copyright: © 2015 Costa et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av portugisiske Foundation for Science and Technology (FCT) postdoktorstipend SFRH /BPD /66288/2009 (José Alexandre Ferreira), SFRH /BPD /101827/2014 ( Luis Lima), SFRH /BPD /85462/2012 (Rui Gil da Costa) og PhD stipend SFRH /BD /103571/2014 (Elisabete Fernandes) og SFRH /BD /111242/2015 (Andreia Peixoto). FCT er delfinansiert av European Social Fund (ESF) under menneskelig potensial Operation Programme (POPH) fra Nasjonal strategiplan Reference Framework (NSFR). Forfatterne erkjenner også økonomisk støtte fra ICBAS-UP (Céu Costa og Sofia Pereira) og den portugisiske Association of Urology /Pfizer premie 2013. finansiører hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av . manuskript
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er den nest mest dødelige urin svulsten og presenterer betydelig dårligere prognose på
muskularis propria
invasjonen [1]. Omtrent 20-30% av de nydiagnostiserte tilfeller er muskel invasiv blærekreft (MIBC, T2-T4 etapper), mens 50% er ikke-muskel invasiv blære svulster (NMIBC) med stort potensial til å utvikle seg til invasjonen. MIBC behandling inkluderer cystektomi og (neo) adjuvant cisplatin-basert kjemoterapiregimer [2]. Imidlertid kan betydelige variasjoner i naturhistorie av sykdommen og responser på behandling observeres mellom svulster med identiske histologiske funksjoner, som gjenspeiler deres høye molekyl heterogenitet [3]. Videre ca 50% av tilfellene utvikle metastaser innen 5 år, oppfordret identifisering av biomarkører for å bistå prognostication og utvikling av mer effektive målrettede behandlingsformer [4].
For å møte dette behovet, har vi nylig adressert uttrykket av kreft-assosiert sialyl-Tn antigen (STN) på en liten prospektiv serie uselekterte pasienter med blærekreft [5]. STN er en unormal post-translasjonell modifikasjon at resultatene fra en tidlig stopp i cellemembran proteiner
O
-glycosylation av sialylering av Tn antigen (Fig 1A). I blæren svulster, STN var det hovedsakelig til stede i avansert stadium tilfeller, mens fraværende fra de fleste lavgradig NMIBC [5]. Dessuten var det ikke uttrykt av normale urothelium, betegner en cancer-spesifikk natur [5]. Studier
in vitro
viste at STN uttrykk utstyrt blære kreft celler med høy invasjon evne [5] og en immunotolerogenic fenotype, potensielt favoriserer sykdom formidling [6]. Endringer i celleoverflateprotein glykosylering har være implisert i aktivering av intracellulære onkogene signaliseringsreaksjonsveier [7], inkludert fosfoinositid-3-kinase (PI3K) /Akt signalveien [8] som er tenkt å spille en avgjørende rolle i blærekreft utvikling . Disse foreløpige observasjoner støtter hypotesen om at STN uttrykk kan spille en nøkkelrolle i sykdomsforløp, som garanterer en dypere etterforskning. Flere studier antyder også at Tn-antigenet, som er en forløper for STN, kan også implisert i onkogene arrangementer [7]; men ingenting er kjent om uttrykket av denne sukker i blæren svulster.
A) Representasjon av membranprotein
O
-glycosylation med vekt på STN uttrykk ved kreftceller. Dette er en svært regulert prosess av avgjørende betydning for proteinstabilitet og funksjon. Kort fortalt nylig syntetiserte proteiner er
O
-glycosylated i Golgi-apparatet ved ppGalNAcTs-mediert tillegg av GalNAc delen til Ser /Thr rester. Dette springer den Tn-antigenet (GalNAc-O-Ser /Thr-proteinryggraden), som er den enkleste O-glykan. I normale celler disse kjedene er utvidet ved sekvensiell tilsetning av andre sukkerarter første av CGALT-1 og deretter andre enzymer. Dette kulminerer i svært komplekse, heterogene og langstrakte glykaner ofte avsluttes av ABO eller Lewis blodtype relaterte antigener (venstre tegning). I kreftceller i Tn antigen umiddelbart sialylert av ST6GalNAc.I, stammer den STN antigen (Neu5Ac-GalNAc-O-Ser /Thr-protein ryggrad), og dermed hemme videre kjedeforlengelse (høyre tegning). Ekspresjonen av STN på celleoverflaten påvirker celle-celle adhesjon og kreft-celle-gjenkjennelse, favoriserer motilitet, invasjon og immun flukt. B) Skjematisk fremstilling av PI3K /Akt /mTOR vei, som er overalt aktivert i blæretumorer. Dette er et sterkt konservert vei reguleres hovedsakelig av en rekke ekstracellulære signaler, deriblant mitogene vekstfaktorer, hormoner, næringsstoffer, cellulære energinivå, og stressbetingelser. Disse signalene aktiverer tyrosin receptor kinaser som rekrutterer PI3K, som katalyserer omdannelsen av membranbundne PIP2 til PIP3. Deretter Akt og PDK-en aktiveres ved binding til PIP3. PTEN fortrinnsvis dephosphorylates PIP3, begrenser signaliserer progresjon. Full Akt aktivering krever dobbel fosforylering av PDK-1 seg selv og PDK-2 (ikke vist). Akt phosphorylates mTOR direkte eller kan også inaktivere TSC1 /TSC2 kompleks, hemme mTOR inaktivering. mTORC1 utløser cellevekst og proliferasjon av fosforylering eukaryote oversettings regulatorer, blant disse p70S6 kinase (p70S6K eller S6K1) som i sin tur fosforylerer den ribosomalt protein S6 (PS6), og den eukaryote translasjonsinitieringssete faktor 4E-bindende protein 1 (4E-BP1 ). For proteinet mTOR å aktivere sin signalkaskade, må det legges til rapamycin følsomme trefoldig kompleks mTORC1. Key PI3K /Akt /mTOR-pathway proteiner Pakt, pmTOR og PS6 utforsket i denne studert er markert med oransje sirkler.
phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) /Akt og mammalian target of rapamycin (mTOR) trasé er sammen signaliserer kaskader essensielle for blære cellevekst og overlevelse (figur 1B). Den PI3K /Akt /mTOR eller mTOR sti integrerer et mangfold av ekstracellulære signaler for å regulere nedstrøms signalering og proteinsyntese, noe som til slutt fører til et konkurransefortrinn vekst, metastatisk kompetanse, angiogenese, og terapiresistens [9]. Den signalkaskade begynner med PI3K-aktivering i cellemembranen, etterfulgt av serin /treonin kinase Akt cellemembrantranslokasjon og aktivering. Det best studerte substrat nedstrøms av Akt er serin /treonin kinase mTOR, hvis nedstrøms effektor er S6-kinase-1 (S6K1). Spesielt har en undergruppe av mTOR pathway endringer vist seg å forekomme i blærekreft, slik som mutasjoner i
PIK3CA
genet, som kulminerer med økt mTOR signal- og blæren kreftceller resistens mot apoptose [10]. Videre er det farmakologiske eller biokjemiske inhibering av PI3K pathway drastisk redusert invasiv kapasiteten til blærecancercellelinjer. Videre er over halvparten av primære humane blæretumorer Liggende høy Akt fosforylering og den avvikende aktivering av denne reaksjonsvei er blitt foreslått for å bidra til invasjon [11]. En annen hendelse som påvirker mTOR pathway aktivering i blæren svulster innebærer tap av tumor suppressor PTEN (fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom ti) funksjon [12]. PTEN undertrykker normalt aktivering av PI3K /Akt /mTOR sti antagonisering av PI3K og hindre aktivering av Akt og PDK-1. PTEN også funksjoner for å regulere kjemotakse og celle motilitet, for derved å fremme tumorinvasjon [13]. I sammendraget er det bevis på at en omfattende evaluering av PI3K /Akt /mTOR pathway forbundet proteiner kan holde betydelig potensial for valuta for pasientutvelgelse. Videre har mange prekliniske og kliniske studier støtter at mTOR-hemmere, som sirolimus (rapamycin) og deres derivater kan forbedre kreftbehandling [13,14].
Basert på disse observasjonene hypoteser vi at Tn og /eller STN kan virke synergistisk med mTOR vei å kjøre blærekreft progresjon. Som sådan, har vi viet til å evaluere uttrykket av STN og proteiner knyttet til aktivering av PI3K /Akt /mTOR sti aktivering i blæren svulster på ulike stadier. Vi forventer at kombinasjonen av ekstracellulære og intracellulære onkogene hendelser kan forbedre pasientutvelgelse og gi innsikt for nye behandlingsformer. Videre har vi beregnet effekten av sirolimus i kjemisk indusert uroteliale svulster hos mus, ser for seg etablering av et rasjonale for mer effektive blæren kreftbehandling.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Dette arbeidet innebærer opplevelser i tumorprøver av pasienter diagnostisert med blærekreft i den portugisiske Insitute of Oncology av Porto. Alle prosedyrer ble utført etter pasientens skriftlig informert samtykke og godkjent av etikkomiteen av portugisisk Institute of Oncology-Porto. All clinicopathological informasjonen ble hentet fra pasientenes kliniske poster.
Det innebærer også dyreforsøk. Alle prosedyrer som involverer dyr ble utført i henhold til EU-direktiv 2010/63 /EU. I løpet av denne studien, ble dyrene fôres
ad libitum
med standardiserte mat (Tecklad Global Diet, Harlan, Spania). Følgende protokoll ble godkjent av den portugisiske etiske komité for forsøk med dyr (Direção Geral de Veterinaria, Godkjenning nr. 520/000/000/2003). Alle mus ble benyttet i eksperimentet ble akklimatisert i en uke i henhold til rutinemessige laboratoriebetingelser før forsøkene. De ble plassert tilfeldig i grupper på 4-5 i plastmerder, med harde flis for sengetøy. Dyrene ble holdt i et rom med en kontrollert temperatur på 23 ± 2 ° C, en 12-timers lys /mørke syklus og 55 ± 5% fuktighet. Dyrenes drikkeløsninger ble endret en gang i uken eller om nødvendig tidligere, og volumet beruset ble registrert. Ukentlig matinntaket ble også bemerket. Alle musene ble overvåket gjennom eksperimentet for tegn til stress og tap av kroppsvekt. Dyrene ble avlivet med 0,4% natrium pentobarbital (1 ml /kg, intraperitoneal).
Befolkning
Denne studien ble utført i en retrospektiv serie av 96 formalinfiksert parafin-embedded blære svulster innhentet fra arkiverte parafinblokker på den portugisiske Institute of Oncology-Porto (IPOP), Portugal. Blæren svulster ble hentet fra 82 menn og 14 kvinner, i alderen 38 til 92 år (median på 69,5 år), innrømmet og behandlet på IPOP mellom 2005 og 2007. Førti sju av de undersøkte svulster ble histologisk klassifisert som NMBIC (Ta og T1) og 49 som invasive lesjoner (T2-T4). Seksten var lav karakter og 80 var høye svulster klasse, i henhold til 2004 WHO gradering kriterier. Videre carcinoma
in situ plakater (CIS) ble funnet samtidig i 20,8% av pasientene. Den gjennomsnittlige oppfølging tidsperiode var 45 måneder (1-134 måneder). Cystektomi ble utført i 64 pasienter (66,7%), mens den andre 32 (33,3%) ble sendt til transuretral reseksjon. Lymphadenectomy ble utført i omtrent 47% av pasientene og fra de som er presentert 37% metastase. Femti fire (56,3%) svulster var primær og 42 (43,7%) var tilbakevendende svulster. Fra tilbakevendende svulster, 38% hadde ingen tidligere behandling, 27% ble behandlet med Mitomicin C, 11% med BCG og 19% ble sendt til begge behandlingene. Videre 5% av disse pasientene ble behandlet med neoadjuvant kjemoterapi før cystektomi. Tabell 1 oppsummerer clinicopathological informasjon.
Kreft spesifikk overlevelse (CSS) ble definert som perioden mellom svulsten fjernes ved operasjon og enten pasienten døde av kreft eller siste oppfølging informasjon. Alle prosedyrer ble utført etter pasientens informerte samtykke og godkjent av etikkomiteen av IPO-Porto. All clinicopathological informasjonen ble hentet fra pasientenes kliniske poster.
Immunohistochemistry
uttrykk for STN antigen, dens forløper Tn, og fosforylerte formene for Akt (Pakt), mTOR (pmTOR), S6 ( PS6) og PTEN i blæretumorer ble nås ved immunohistokjemi hjelp av avidin /streptavidin-peroksydase-metoden, som beskrevet av Ferreira et al. [5]. Informasjon om de primære antistoffer og fortynninger brukt i denne studien er oppsummert i tabell 2. immunreaktivitet ble avslørt ved hjelp av diaminobenzidin (DAB, Thermo Scientific LabVision) som kromogen og seksjoner ble kontra med Harris hematoxylin. Negative kontroller ble utført ved å erstatte det primære antistoff med 5% bovint serumalbumin (BSA). Positive kontroller ble kjent positive vev for antigener som studeres.
Immunohistochemistry scoring av humane tumorer
De immun seksjonene ble vurdert dobbelt-blindt ved lysmikroskopi av to uavhengige observatører (CC og SP) og validert av en erfaren patolog (TA). Disaccording målingene ble re-analysert ved hjelp av en tohodet mikroskop (Olympus BX46, Olympus Corporation), og konsensus ble nådd. En semi-kvantitativ tilnærming ble etablert for å score det immunhistokjemiske merking basert på omfanget og intensiteten av farging.
Gitt fravær av TN og STN i sunn urothelium [5], svulster ble klassifisert som positive for disse antigener ble observert når membranen og /eller cytoplasmisk immunreaktivitet i mer enn 5% av tumoren, som beskrevet av Ferreira et al. [5,15]. Pakt, pmTOR, PS6 og PTEN uttrykk ble scoret i henhold til fargeintensitet (svak-1 poeng, moderate-2 poeng, sterk-3 poeng) multiplisert med prosentandelen av positive celler (0-5% -0 poeng; 5 -25% -1 poeng; 25-50% -2 poeng; 50-75% -3 poeng; 75-100% -4 poeng). Basert på klassifiseringen foreslått av Nishikawa et al. [16], svulster med en poengsum 6 ble vurdert negativt, mens de med en score≥6 ble klassifisert som positive (overekspresjon). Pakt ble evaluert basert på kjernekraft immunoreaktivitets, pmTOR og PS6 basert på cytoplasma uttrykk og PTEN på både cytoplasma og kjernekraft flekker, som foreslått av andre publikasjoner [17,18].
Dyreforsøk med sirolimus og immunhistokjemi scoring
Histologiske snitt av Imprinting kontroll Region (ICR) mus med N-butyl-N- (4-hydroksybutyl) nitrosamin (BBN) indusert blæren lesjoner, som følge av vår tidligere arbeid om virkningen av sirolimus på blærekreft [19 ], ble valgt for denne studien. I korthet, fire-ukers gamle ICR-mus (25 g; Harlan, Barcelona, Spania) ble tilfeldig fordelt i fire grupper, som beskrevet i detalj i en tidligere publikasjon [18]. Gruppe 1 (n = 6) inkludert mus eksponert for 0,05% BBN i 12 uker, etterfulgt av vann fra springen i 8 uker (totalt 20 uker). Gruppe 2 (n = 7) inkludert mus behandlet med 0,05% BBN løsning i tolv uker, vedlikeholdt med vanlig vann fra springen i en uke, administrert intraperitonealt med mTOR-hemmer sirolimus (1,5 mg /kg, Wyeth) for fem dager i uken i seks fortløpende uker, dvs. frem til 19
th uke, etterfulgt av en uke med vann fra springen (totalt 20 uker). Gruppe 3 (n = 6) inkludert mus eksponert for 0,05% BBN i 12 uker, etterfulgt av vann fra springen i 11 uker (totalt 23 uker). Gruppe 4 (n = 7) inkludert mus behandlet med 0,05% BBN og sirolimus, som beskrevet for gruppe 2, men med en eksponering for å tappe vann etterpå på 3 uker (totalt 23 uker). Gruppe 3 og 4 ble opprettet for å estimere mulighet for sen tilbakefall og /eller molekylære forandringer som følge av forlenget overlevelse. Alle prosedyrer ble utført i henhold til EU-direktiv 2010/63 /EU. I løpet av denne studien, ble dyrene fôres
ad libitum
med standardiserte mat (Tecklad Global Diet, Harlan, Spania). De histologiske endringer indusert av disse forsøk omfattet både preneoplastiske og neoplastiske lesjoner med invasiv potensial og invasive tumorer, som beskrevet i detalj av Oliveira et al. [18]. Heri ble lesjoner av høye invasive potensial og muskel invasive tumorer screenet for STN og PS6 ved immunhistokjemi, som beskrevet i detalj for humane tumorer, ettersom antistoffene som anvendes er reaktive mot både humant og mus. Både intensiteten og forlengelsen av immunfarging ble tatt i betraktning ved å score ekspresjonen av antigenene, som beskrevet i forrige avsnitt. Blæren lesjoner og farging ble vurdert dobbelt-blindt av to uavhengige observatører (CC og SP) og validert av en erfaren veterinær patolog (RMGC).
Statistisk analyse
Statistiske data analyse ble utført med IBM Statistiske Package for Social Sciences-SPSS for Windows (versjon 20.0). Chi-kvadrat analyse ble brukt for å sammenligne kategoriske variabler. Kaplan-Meier-overlevelseskurver ble anvendt for å vurdere korrelasjon mellom Stn ekspresjon og cancer-spesifikk overlevelse (CSS) og ble sammenlignet ved hjelp av log-rank test. Videre ble multivariat Cox regresjonsanalyse utført for å vurdere den enkelte effekten av de evaluerte markørene på pasientens overlevelse og juster til potensielle confounders (variabler som kan påvirke CSS av NMIBC og MIBC pasienter). Korrelasjonen mellom PI3K /Akt /mTOR pathway molekyler ble utført ved hjelp av Spearman rho test.
Resultater
Altered protein glykosylering, oversatt av uttrykket av STN antigen og dens forløper Tn, PI3K /Akt /mTOR pathway molekyler (Pakt, pmTOR, PS6), og PTEN inaktivering, er fremtredende trekk ved blæren svulster. Heri vi har viet en omfattende analyse av disse molekylære endringer i en serie av blærekreftpasienter på ulike stadier av sykdommen, ser for seg biomarkører for dårlig kreftspesifikk overlevelse.
Vårt datasett ble komponert av 47 NMIBC og 49 MIBC pasienter, som viste i tabell 1. i henhold til figur 2, NMIBC presentert en høyere kreftspesifikk overlevelse (CSS, mener CSS: 119 måneder) enn MIBC pasienter (gjennomsnittlig CSS: 43 måneder, log rank, p 0,001). Disse resultatene viser at vår serie reflekterte naturlig sykdomsforløp og fremhevet den betydelig lavere CSS av MIBC forhold til NMIBC tilfeller. Derfor spesiell interesse ble satt i identifisering av biomarkører for sent stadium sykdommen basert på sammenligningen mellom NMIBC og MIBC.
Kaplan-Meier analyse viser CSS av NMIBC (Ta og T1) og s av MIBC (T2 , T3 og T4). Sammenligning utført av log-rank test (p 0,001); + sensurert NMIBC pasienter; ⧫ sensurert MIBC pasienter.
Tn og STN antigen uttrykk i blærekreft
Tn antigen ble observert hos ca. 10% av NMBC og MIBC (tabell 2) og dens uttrykk var rest , ikke overstiger 5% av tumorområdet og uten noen definert mønster. På den annen side ble det STN-antigen påvist i omtrent 60% av de studerte blæretumorer, noe som er i overensstemmelse med våre tidligere funn [5]. Antigenet ble hovedsakelig uttrykt på cellemembran, selv om cytoplasmatisk farge kan også observeres. STN-antigen presentert en fokal ekspresjon som ikke overstiger 30% av tumorområdet for de fleste av de positive tilfeller, uavhengig av deres opprinnelse histologisk. STN var hovedsakelig uttrykt av dedifferensierte celler i svulster som viser
lamina propria plakater (T1, 60%) og
muskularis propria plakater (≥ T2, ca 60-90%) invasjonen; omvendt prosentandelen av positive Ta var lavere enn 30% (
p
0,001; figur 3A). Selv uten statistisk signifikans, i Ta svulster STN positive celler var hovedsakelig tilstede i overfladiske kreft lag bort fra skipene. Motsatt ble STN positive celler i T1 svulster (Fig 3B) observert medfølgende og /eller invadere basal laget (figur 3B), mens i MIBC disse cellene ble stort sett funnet i invasjonen fronter (Fig 3B) og invaderende og /eller inne i fartøyer, noe som antyder en rolle i invasjon og sykdomsspredning. Forsterkende disse observasjonene, tilstedeværelse av STN antigen var statistisk høyere i MIBC sammenlignet med NMIBC (
p
= 0,001, Tabell 3).
(A) Fordeling av STN negative og positive tumorer sammen de ulike stadier av blærekreft; (B) Representative bilder av STN flekker i NMIBC og MIBC. Venstre-NMIBC viser en overvekt av STN positive celler i de overflatiske lagene, vekk fra fibrovascular støtte; oppmerksom på fartøy uten positive celler. Høyre-MIBC viser invasjonen front med STN positivt fargede celler; oppmerksom positive STN urotelialceller i skipene (pil), noe som tyder på mulig deltakelse i metastasering.
PI3K /Akt /mTOR sti i blærekreft
Evalueringen av PI3K /Akt /mTOR /S6 veien ble gjort ved hjelp av antistoffer for aktive fosforylerte formene for Akt (Pakt), mTOR (pmTOR), og S6 (PS6). PTEN, som negativt regulerer Akt signalering, ble også vurdert.
Pakt ble påvist både i cytoplasma og kjernen. I NMIBC tilfeller flere områder med ulik intensitet i uttrykket ble observert (figur 4A), betegner et heterogent mønster som ikke var tydelig i MIBC (fig 4B). Videre stromale celler MIBC positive tilfeller viste forbedret fargeintensitet hovedsakelig i områdene nær svulsten. pmTOR immunoreaktivitets var cytoplasma og i sporadiske tilfeller, kjernekraft. I urothelium med tilsynelatende normal histologi pmTOR uttrykk var begrenset til overfladiske cellelag. I NMIBC pmTOR ekspresjon ble jevnt fordelt over flere lag av urotelialceller, selv om det var en mer intens farging i den overfladiske lag (figur 4C). Videre ble flere områder med varierende fargeintensitet observert, betegner et heterogent uttrykk. I MIBC positiver tilfeller pmTOR uttrykk var fokus og heterogen (Fig 4D). PS6 immunoreaktivitets var overveiende cytoplasma. I NMIBC PS6 uttrykk ble registrert i alle de overfladiske lag, både i paraply og differensierte celler (figur 4E). Immunreaktiviteten til PS6 varieres på tvers av tumorceller. I MIBC PS6 presentert en diffus uttrykk gjennom tumoren, blir mer tilstede i basal og mitotiske celler (figur 4F). Flere positive saker present økt PS6 fargeintensitet i invasjonen foran samt PS6 uttrykk i tumor infiltrere lymfocytter og endotelceller.
A og B) Pakt kjernekraft og cytoplasmatic uttrykk i NMIBC (A) og MIBC (B) . I NMIBC tilfeller Pakt presentert en heterogen mønster med områder med forskjellig intensitet i uttrykket. I MIBC, stromale celler hovedsakelig i områdene nær svulsten viste høyere uttrykk. C og D) pmTOR cytoplasmisk ekspresjon i NMIBC (C) og MIBC (D). I NMIBC pmTOR ble uttrykt på tvers av flere lag, selv om det var en mer intens farging i overfladiske seg. I MIBC positive tilfeller pmTOR uttrykk var samlings. E og F) PS6 cytoplasmatic ekspresjon i NMIBC (E) og MIBC (F). I NMIBC ble observert PS6 uttrykk i alle de overfladiske lag både i paraply og differensierte celler. I MIBC den immunoreaktivitets var diffuse, men mer til stede i basal og mitotiske celler. PS6 ekspresjon var høyere i invasjonen foran og i tumor-infiltrerende lymfocytter og endotelceller. G og H) PTEN cytoplasmiske og kjernefysiske uttrykk i NMIBC (G) og MIBC (H). PTEN uttrykk var høyere i NMIBC forhold til MIBC.
Tar hensyn til forlengelse av flekker og dens intensitet, 62/94 (66%), 33/96 (34%) og 45/95 ( 47%) av blæren svulster ble ansett som positivt for Pakt, pmTOR og PS6, henholdsvis. En Spearman rho testen viste at pakt, pmTOR, PS6 uttrykk ble signifikant korrelert (P 0,05) uavhengig av tumoren trinnet, og dermed i henhold til en fullstendig aktiv svei. Videre, til tross for histologiske forskjeller, presenteres disse markørene en lik fordeling mellom NMIBC og MIBC og kunne ikke bli assosiert med muskel invasjon (tabell 3).
På den annen side, 37/92 (40%) av svulster ble ansett som positivt for PTEN. PTEN ble uttrykt i cytoplasma og cellekjernen av de samme cellene, men med lavere forlengelse av ekspresjon i MIBC (33%, figur 4G) sammenlignet med NMIBC (83%, fig 4H). Videre PTEN-negativ fenotype var signifikant forbundet med muskel invasjon (Ta og T1; p 0,001, Tabell 3)., Som kan bidra til å opprettholde en aktiv PI3K /Akt /mTOR /S6 sti i disse tilfellene
Tn, STN, PI3K /Akt /mTOR sti og kreft-spesifikke overlevelse
En Kaplan-Meier analyse ble brukt for å vurdere sammenhengen mellom de adresserte biomarkører og kreftspesifikk overlevelse av pasienter. Vi har observert at pasienter som bærer STN uttrykkende tumorer hadde en lavere CSS, uavhengig av deres trinn (p = 0,024, fig 5A). Dette ble også observert ved vurdering NMIBC alene (p = 0,020; figur 5B). Enda viktigere, blant NMIBC, STN uttrykker T1 svulster presenteres lavere CSS enn negative tumorer (p 0,05). Videre multivariat Cox regresjonsanalyse justert for potensielle confounders, nemlig alder, kjønn, scene, klasse, gjentakelse status, tilstedeværelse av samtidig CIS ble utført. Vi fant at STN er en uavhengig prognostisk markør for verste CSS (HR = 11,836; 95% KI: [1,063 til 131,7]; p = 0,044). Kontrast til STN, viste positive TN, Pakt, pmTOR og PS6 svulster ingen forskjeller i CSS i forhold til negative lesjoner, uavhengig av deres stadium. Vi har også observert at pasienter som hadde PTEN-negative tumorer hadde lavere CSS (p = 0,015, figur 6). Flere studier er nødvendig for å fastslå om mangelen på undertrykkende effekt av PTEN løpet PI3K /Akt /mTOR kan forklare disse funnene
Kaplan-Meier analyse som viser sammenhengen mellom STN og CSS i. (A) studerte blærekreftpasienter; (B) NMIBC pasienter. Sammenligning utført av log-rank test (A: p = 0,024; B: p = 0,020); + sensurert STN negative svulster; ⧫ sensurert STN positive svulster.
Kaplan-Meier analyse som viser effekten i CSS av PTEN uttrykk i alle undersøkte pasienter med blærekreft. Sammenligning utført av log-rank test (p = 0,013); + sensurert PTEN negative svulster; ⧫ sensurert PTEN positive svulster.
Basert på disse observasjonene og tar sikte på å forbedre den prognostiske verdien av STN i sammenheng med sent stadium sykdommen (MIBC), har vi omfattende integrert informasjon fra STN og PI3K /Akt /mTOR sti biomarkører. I henhold til figur 7, innføring av PI3K /Akt /mTOR pathway molekyler tillates å diskriminere positive STN MIBC tumorer med verste CSS (p = 0,027). Videre multivariat Cox regresjonsanalyse (justert til alder, scene, gjentakelse status, tilstedeværelse av samtidig CIS og metastase) viste at nærværet av PI3K /Akt /mTOR pathway molekyler i STN + MIBC uavhengig er assosiert med omtrent seks ganger så risiko for død etter kreft (HR = 5,662; 95% KI: [1,093 til 29,323]; p = 0,039). Disse observasjonene foreslår, for første gang, at kombinasjonen av STN og mTOR pathway biomarkører kan ha potensial til å forbedre den lagdeling av avansert stadium blæretumorer; men bekreftelse i større serie er obligatorisk
Kaplan-Meier analyse som viser sammenhengen mellom Pakt, pmTOR og PS6 uttrykk i CSS av STN positive svulster MIBC. Sammenligning utført av log-rank test (p = 0,027); + sensurert Pakt og pmTOR og PS6 negative tumorer; ⧫ sensurert Pakt og /eller pmTOR og /eller PS6 positive svulster.
Hemming av PI3K /Akt /mTOR sti i dyremodeller
BBN-induserte mus blæren svulster ligne histologi og molekylær natur kreft hos mennesker [20,21], ble screenet for STN og PS6, nedstrøms effektor av mTOR veien. Vi observerte ingen STN-ekspresjon i friske mus urothelium, i samsvar med tidligere observasjon for den friske humane blære [5].
