Abstract
MDA-7 /IL-24 var involvert i den spesifikke kreft apoptose gjennom undertrykkelse av Bcl-2-ekspresjon, som er et nøkkel apoptose regulatorisk protein av mitokondrie død pathway. Men de underliggende mekanismene for denne forskriften er uklare. Vi rapporterer her at tumor-selektive reproduserende adenovirus ZD55-IL-24 fører til BCL-2 S-denitrosylation og samtidig ubiquitinering, som tar del i 26S proteasomet degradering. IL-24-siRNA fullstendig blokkerer BCL-2 ubiquitinering via hjemfall av BCL-2 S-denitrosylation og beskytter den mot proteasomal nedbrytning som bekreftet den betydelige rolle MDA-7 /IL-24 i regulering posttranslational modifikasjon av Bcl-2 i kreftceller . Nitrogenoksid (NO) er en viktig regulator av protein S-nitrosylation og denitrosylation. NO-donor, natriumnitroprussid (SNP), nedregulerer Bcl-2-S-denitrosylation, demper Bcl-2 ubiquitinering og deretter motvirker MDA-7 /IL-24 induserte kreftcelle apoptose, mens ingen inhibitor 2- (4-karboksyfenyl) -4,4,5,5-tetramethylimidazoline-en-oksygen-3-oksid (ptio) viser motsatt effekt. Samtidig er disse modulatorer NO mislykkes i å påvirke BCL-2 fosforylering, noe som tyder på at NO regulerer Bcl-2-stabilitet i en fosforylering-uavhengig måte. I tillegg ble Bcl-2-S-nitrosylation reduksjon indusert av ZD55-IL-24 skyldes både iNOS reduksjon og TrxR1 øker. iNOS-siRNA forenkler BCL-2 S-denitrosylation og ubiquitin-nedbrytning, mens TrxR1 inhibitor auranofin hindrer BCL-2 fra denitrosylation og ubiquitinering, begrenser dermed caspase signalveien aktivering og påfølgende kreftcelle apoptose. Til sammen våre studier viser at MDA-7 /IL-24 induserer BCL-2 S-denitrosylation via regulering av iNOS og TrxR1. Videre denitrosylation av Bcl-2 resulterer i sin ubiquitinering og påfølgende caspase protease familien aktivering, som en konsekvens, apoptose mottakelighet. Disse funnene tilveiebringe en ny innsikt i MDA-7 /IL-24-indusert veksthemming og karsinom apoptose
relasjon:. Tian H, Wang J, Zhang B, Di J, Chen F, Li H, et al. (2012) MDA-7 /IL-24 induserer Bcl-2 Denitrosylation og Ubiquitin-Nedbrytning Involvert i Cancer Cell apoptose. PLoS ONE 7 (5): e37200. doi: 10,1371 /journal.pone.0037200
Redaktør: Dimitri Vavvas, Massachusetts Eye Ear Infirmary-Harvard Medical School, USA
mottatt: 06.12.2011; Godkjent: 16 april 2012; Publisert: 21 mai 2012
Copyright: © 2012 Tian et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (nr. 81071854) og Science and Technology Department of Jiangsu-provinsen (BK2010177, BK2010179). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
interleukin 24 (IL-24), også kalt melanoma differensiering forbundet gen-7 (MDA-7), er et unikt medlem av IL-10-gen-familien, som viser en selektiv induksjon av kreft spesifikk apoptose uten skadelige effekter på normale celler [1] – [3]. MDA-7 /IL-24 induserer veksthemming og apoptose i et bredt spekter av humane kreftceller, inkludert melanom, ondartet gliom, og karsinomer i bryst [4] – [8]. Involvering av MDA-7 /IL-24-indusert apoptose i tumorvevet ble assosiert med endoplasmatisk retikulum (ER) stress og mitokondriell dysfunksjon og reaktive oksygenarter (ROS) produksjon [7], [9], [10]. Dessuten, MDA-7 /IL-24 induserte potent «bystander antitumor» aktivitet, en evne til å blokkere tumor angiogenese, synergi med stråling, kjemoterapi, monoklonale antistoffbehandlinger og immunmodulerende aktivitet [11], [12], noe som gjør det til en ideell verktøy for kreft genterapi.
Selv om reaksjonsveier for MDA-7 /IL-24 forbedrer apoptose i tumorceller er ikke helt klarlagt, bevis fra flere studier tyder på at MDA-7 /IL-24 formidler mange proteiner viktig for angrep av vekstinhibering og involvering av mitokondriell apoptotisk celledød veien [7]. B-celle lymfom gen 2 (Bcl-2), en av de anti-apoptotiske Bcl-2-familiemedlemmer, er lokalisert i den ytre mitokondriemembranen. Noen antiapoptotic mekanismer for BCL-2 inkluderer regulering av kalsium homeostase og nøytralisering av proapoptotiske protein Bax ved å danne heterodimerer. I tillegg BCL-2 fremmet blokaden av cytokrom c utgivelsen og foreningen med mitokondrie apoptose faktor Apaf1 slutt hindret aktivering av caspase protease familie og bevart mitokondrie integritet [13], [14]. MDA-7 /IL-24 trykt Bcl-2-protein ekspresjon, noe som således øker forholdet mellom spesifikke pro- og anti-apoptotiske proteiner vipping av balanse fra overlevelses til døden i karsinomceller. I motsetning til overekspresjon av Bcl-2-beskyttede prostatakreftceller fra MDA-7 /IL-24-mediert apoptose, hvilket antyder Bcl-2 spiller en viktig rolle i cancercelle apoptose i respons til MDA-7 /IL-24 [8]. Imidlertid har den eksakte mekanismen som MDA-7 /IL-24 regulert Bcl-2 for å lette mitokondriell dysfunksjon ikke blitt identifisert. I denne studien har vi brukt tumor-selektive reproduserende adenovirus som uttrykker IL-24 (ZD55-IL-24) som slettet den essensielle viral E1B 55 kDa genet og hatt en sterk cytopatisk effekt og betydelig apoptose i tumorceller uten normale celler [15] for ytterligere å utforske mekanismen for MDA-7 /IL-24 induserende Bcl-2 ned-regulering og etterfølgende karsinomcellelinje apoptose.
(A) Tid løpet analyse av IL-24-protein ekspresjon i Hela, A375 og 7860 celler behandlet med ZD55-IL-24 (20 MOI). (B) Tid løpet analyse av E1A protein uttrykk i Hela, A375 og 7860 celler behandlet med ZD55-IL-24 (20 MOI). (C) Tid løpet analyse av Bcl-2-protein ekspresjon i Hela, A375 og 7860-celler behandlet med ZD55-IL-24 (20 MOI). β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (D) ZD55-EGFP (5 MOI) som bærer genet rapport EGFP ble brukt til å påvise infeksjon effektivitet av den replikative adenovirus ved forskjellige tidspunkter (forstørrelse x 200). (E) Hela, A375 og 7860 celler levedyktighet behandlet med ZD55-IL-24 (20 MOI) på ulike tidspunkt ble bestemt ved MTT-analyse. Data er middel ± standard avvik (S.D.) fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3); *
p
. 0,05 versus kontrollgruppen
(A) Effekter av ulike titere av ZD55-IL-24 (0,1 MOI, en MOI, 5 MOI, 10 MOI 20 MOI) på BCL-2 uttrykk indusert ved Western blotting 48 timer etter infeksjon av ZD22-IL24. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (B) ZD55-EGFP på de forskjellige titere ble brukt til å påvise infeksjon effektiviteten av replikative adenovirus (forstørrelse x 200). (C) HeLa-cellelevedyktighet ble behandlet med de forskjellige titere av ZD55-IL-24 ble bestemt ved MTT-analyse. Data er middel ± standard avvik (S.D.) fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3); *
p
0,05 versus kontrollgruppen
(A) Hela, A375 og 7860 celler i respons til ZD55-IL-24 (20 MOI) var forberedt på immunoprecipitation bruker. anti-BCL-2-antistoff. De resulterende immunkompleksene ble analysert for anti-S-nitrosocysteine ved Western blotting og sto for Bcl-2-S-nitrosylation nivå ved forskjellige tidspunkter 12 timer, 24 timer, 36 timer og 48 timer, henholdsvis. (B) Tidsforløp av Bcl-2 ubiquitinering i HeLa-celler ble påvist ved immunoutfelling under anvendelse av anti-Bcl-2-antistoff og deretter etterfulgt av immunblotting med anti-ubiquitin-antistoff. (C) Effekt av IL-24-siRNA (100 nM) ved IL-24, Bcl-2-ekspresjon, Bcl-2 S-nitrosylation og ubiquitinering i HeLa-celler ble påvist ved Western blotting og co-immunutfelling. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. De tilsvarende bånd ble skannet, og den optiske tetthet (O.D.) ble bestemt som den ganger endring sammenlignet med kontrollgruppen. Data er middel ± standard avvik (S.D.) fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3); *
p
0,05 versus kontrollgruppe;
#
p
0,05 versus egge siRNA gruppe
(A) Tid løpet analyse av caspase-9, caspase-3 og PARP i Hela celler behandlet med ZD55. -il-24 (20 MOI). De tilsvarende bånd ble skannet, og den optiske tetthet (O.D.) ble bestemt som den ganger endring sammenlignet med kontrollgruppen. (B) Tidlig apoptose og sen apoptose i HeLa-celler ble påvist ved å farge cellene med Annexin V-FITC (grønt) og propidium jodid (rød farge) på forskjellige tidspunkter. (C) HeLa-celler behandlet med ZD55-IL-24 for ulike tidspunkt ble farget med Annexin V-FITC /propidium jodid (PI) og umiddelbart analysert ved hjelp av strømningscytometri. Data er presentert som prosentandelen av Annexin V-positive celler fra tre uavhengige eksperimenter. *
p
. 0,05 versus kontrollgruppen
(A) Hela, A375 og 7860 celler ble forbehandlet med ZD55-IL-24 (20 MOI) i 24 timer og deretter behandlet med NO donor SNP (2 mm), NO hemmer ptio (300 mm) og SNP samtidig administrering av reduksjonsmiddel DTT (10 mM) i 6 timer hhv. Bcl-2-S-nitrosylation ble påvist ved immunoutfelling under anvendelse av anti-Bcl-2-antistoff og deretter etterfulgt av immunblotting med anti-S-nitrosocysteine antistoff. (B) Virkning av NO modulatorer med Bcl-2 ubiquitinering i HeLa-celler ble påvist ved immunoutfelling under anvendelse av anti-Bcl-2-antistoff og deretter etterfulgt av immunblotting med anti-ubiquitin-antistoff. (C) Effekt av NO modulatorer for Bcl-2-ekspresjon i Hela, A375 og 7860 celler ble påvist ved western blotting ved anvendelse av anti-Bcl-2-antistoff. (D) Hela, A375 og 7860 celler ble forbehandlet med ZD55-IL24 i 24 timer og deretter behandlet med proteasomal inhibitor MG132 (10 uM) i 6 timer. Bcl-2-ekspresjon ble analysert ved Western blotting ved anvendelse av anti-Bcl-2-antistoff. (E) Bcl-2-fosforylering i HeLa-celler ble påvist ved Western blotting med anti-p-Bcl-2 (Ser87) antistoff. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. De tilsvarende band ble skannet og intensiteter ble bestemt ved optisk tetthet (O.D.) målinger. Dataene er gjennomsnitt ± standardavvik (S.D.) fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3).
#
p
0,05 versus ZD55-EGFP; *
p
0,05 versus ZD55-IL-24 gruppe;
@
p
. 0,05 versus DMSO gruppe
(A) HeLa-celler ble forbehandlet med ZD55-IL24 (20 MOI) i 24 timer og deretter tilsatt med NO donor SNP (2 mm), NO hemmer ptio (300 mm), SNP samtidig administrering av reduksjonsmiddel DTT (10 mM) og proteasomal inhibitor MG132 (10 mm) i 6 timer hhv. Procaspase-9, spaltet caspase-9, procaspase-3, spaltet caspase-3 ble påvist ved Western blotting. (B) Effekt av NO modulatorer SNP, ptio, SNP + DTT og proteasominhibitor MG132 på tidlig apoptose og sent apoptose i Hela celler behandlet med ZD55-IL-24 ble påvist ved farging med Annexin V-FITC (grønn farge) og propidium jodid (rød farge) respektivt. (C) HeLa-celler ble farget med Annexin V-FITC og propidium jodid og umiddelbart analysert ved flow-cytometri. (D) Effekter av NO modulatorer og MG132 på Hela celle levedyktighet ble bestemt ved MTT-analyse. De tilsvarende bånd ble skannet, og den optiske tetthet (O.D.) ble bestemt som den ganger endring sammenlignet med kontrollgruppen. Dataene er gjennomsnitt ± standardavvik (S.D.) fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3).
#
p
0,05 versus ZD55-EGFP gruppe; *
p
0,05 versus ZD55-IL-24 gruppe;
@
p
0,05 versus DMSO gruppe
(A) Tid løpet analyse av iNOS uttrykk i Hela, A375 og 7860 celler behandlet med ZD55-IL-24. (20 MOI). (B) Hela, A375 og 7860-celler ble transfektert med iNOS-siRNA (100 nM) i 12 timer, deretter behandlet med ZD55-IL-24 i 12 timer. Effekt av iNOS-siRNA på iNOS-ekspresjon ble analysert ved Western blotting. (C) Virkning av iNOS-siRNA med Bcl-2-protein-ekspresjon ble analysert ved Western blotting. (D) Virkning av iNOS-siRNA med Bcl-2-S-nitrosylation ble påvist ved immunoutfelling under anvendelse av anti-Bcl-2-antistoff og deretter etterfulgt av immunoblottet med anti-S-nitrosocysteine antistoff. (E) Effekt av iNOS-siRNA på ubikvitin-Bcl-2 ble påvist ved immunoutfelling under anvendelse av anti-Bcl-2-antistoff og deretter etterfulgt av immunblotting med anti-ubiquitin-antistoff. (F) Effekt av iNOS-siRNA på kaspase-9, caspase-3 og PARP i HeLa-celler ble påvist ved Western blotting. De tilsvarende bånd ble skannet, og den optiske tetthet (O.D.) ble bestemt som den ganger endring sammenlignet med kontrollgruppen. Dataene er gjennomsnitt ± standardavvik (S.D.) fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3). *
p
0,05 versus kontrollgruppe;
#
p
. 0,05 versus egge siRNA gruppe
(A) Tid løpet analyse av TrxR1 uttrykk i Hela, A375 og 7860 celler behandlet med ZD55-IL- 24 (20 MOI). (B) Hela, A375 og 7860-celler ble behandlet med ZD55-IL-24 i 24 timer og deretter tilsatt med TrxR1 inhibitor auranofin (5 pM) i 6 timer. Effekt av TrxR1 inhibitor auranofin på TrxR1 protein-ekspresjon ble påvist ved Western blotting. (C) Virkning av TrxR1 inhibitor auranofin med Bcl-2-protein ekspresjon i Hela, A375 og 7860-celler ble påvist ved Western blot-analyse. (D) Virkning av TrxR1 inhibitor auranofin med Bcl-2-S-nitrosylation ble påvist ved immunoutfelling under anvendelse av anti-Bcl-2-antistoff og deretter etterfulgt av immunblotting med anti-S-nitrosocysteine antistoff. (E) Effekt av TrxR1 inhibitor auranofin med Bcl-2 ubiquitinering i HeLa-celler ble påvist ved immunoutfelling under anvendelse av anti-Bcl-2-antistoff og deretter etterfulgt av immunblotting med anti-ubiquitin-antistoff. (F) Effekt av TrxR1 inhibitor auranofin på kaspase-9, 3 og PARP ble påvist ved Western blotting. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. De tilsvarende bånd ble skannet, og den optiske tetthet (O.D.) ble bestemt som den ganger endring sammenlignet med kontrollgruppen. Dataene er gjennomsnitt ± standardavvik (S.D.) fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3). *
p
0,05 versus ZD55-EGFP;
#
p
0,05 versus DMSO gruppe
(I) IL-24 hemmer iNOS uttrykk som fører til reduksjon av NO omsetning og demping av BCL-2 S. nitrosylation. (II) TRX denitrosylates S-nitrosylated Bcl-2 gjennom dens ditiol del, for derved å danne en redusert Bcl-2 og oksydert Trx; oksidert Trx reduseres (og derfor reaktiveres) ved seleno-flavoprotein Trx reduktase (TrxR) og NADPH, noe som tyder på at TrxR gjennom å redusere oksidert Trx kan lette BCL-2 denitrosylation. (III) Under basal tilstand, stabiliserer BCL-2 S-nitrosylation proteinstruktur og motstår til ubiquitin-proteasome degradering. Dannelse av heterodimerer med proapoptotiske protein som Bax, hemming av cytokrom c utgivelsen og caspase protease familie aktivering og regulering av mitokondrie transmembrane potensialet er noen av mekanismer som BCL-2 utøver sin anti-apoptotisk effekt. (IV) Som svar på IL-24, Bcl-2 S-denitrosylation via både iNOS reduksjon (a) og TrxR1 økning (b) muliggjør Bcl-2 ubiquitinering, som til slutt blir degradert av 26S proteasomet. Bax utløser frigjøring av cytokrom c og aktiveringen av caspase protease familien, som medieres intracellulær proteolyse som er karakteristisk for celle apoptose.
Selv om ekspresjonen av Bcl-2 er regulert av flere mekanismer, som for eksempel transkripsjon , posttranslasjonell modifikasjon, dimerisering og degradering [16], [17], økende bevis viser at posttranslasjonell modifisering spiller en kritisk rolle i en potensiell Bcl-2 i henhold til omsetning spenningstilstand [18], [19], [20]. Enkelte undersøkelser tyder på protein S-nitrosylation er en reguleringsprosess i signaltransduksjonsveiene som justerer funksjon av Bcl-2 ved kovalent binding av et nitrogenoksid (NO) gruppe til en cystein tiol sidekjede. Det har vist seg at de to cysteinrestene av Bcl-2, Cys
158 og Cys
229 er ansvarlig for S-nitrosylation av Bcl-2, og mutasjon av disse to residuer helt inhiberer Bcl-2-S-nitrosylation [16]. S-nitrosylation har vært regulert av NO synthases (Noss) inkludert nevronale NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS) og induserbar NOS (iNOS) [21], [22]. Blant tre INGEN synthases, iNOS, en Ca
2 +-uavhengig enzym, er definert som «high-output «NOS, genererer store mengder NO. Noen tidligere papirer viser også iNOS ble funnet å være økt i fremskredne stadier av melanom og ekspresjon av MDA-7 /IL-24 negativt regulert iNOS ekspresjon i maligne melanom cellelinjer [23], [24], [25], som tyder på at iNOS kan bidra til å øke tumorprogresjon. Likevel, den eksakte rolle iNOS i tumorigenesis er uklart. Enten ZD55-IL-24-indusert iNOS nedgang vil videre påvirke BCL-2 S-nitrosylation nivå er det første målet for vår nåværende studie. Gitt at protein S-nitrosylation nivå ikke bare avhengig av NO-mediert S-nitrosylation via NOS men også denitrosylating enzym som thioredoxin (TRX /TrxR) systemer [26], vi også undersøke om BCL-2 S-nitrosylation reduksjon i respons til ZD55-IL-24 er bestemt av både iNOS og TRX /TrxR systemer.
Noen liggende rapporter viser at cisplatin-indusert produksjon av reaktive oksygenforbindelser bevirker BCL-2 S-nitrosylation som inhiberer 26S-proteasomet nedbrytning, og således indikerer at S-nitrosylation kan utøve den biologiske funksjon gjennom endring av proteinstabilitet. På samme måte kan NO-mediert S-nitrosylation av Bcl-2 i forbindelse med ubiquitin nedbrytning være viktig i apoptose motstand og utvikling av lungekreft indusert av Cr (VI) og andre kreftfremkallende [16], [27]. Det er derfor økende interesse mot å forstå den cellulære mekanismen om BCL-2 S-nitrosylation endring i tillegg til ZD55-IL-24 er innblandet i sin ubiquitinering og proteasomal degradering.
Siden de mekanismer som MDA-7 /IL-24 undertrykker BCL-2 uttrykk og letter kreftcelle apoptose er ikke avklart. Vår foreliggende undersøkelse bestemmes den betydelige rolle Bcl-2 denitrosylation i sin ubikvitin-proteasom-degradering, noe som til slutt medierer caspase signalvei aktivering og kreftcelle apoptose i respons til ZD55-IL-24. Videre BCL-2 S-nitrosylation diminishment svar på ZD55-IL-24 inkluderer både iNOS-mediert S-nitrosylation og Trx /TrxR1 involvert denitrosylation, som senere letter ubiquitin-mediert proteasome degradering. Et slikt tett forhold mellom BCL-2 denitrosylation og ubiquitinering kaster nytt lys på IL-24-indusert BCL-2 nedbrytning og spesifikk svulst apoptose.
Materialer og metoder
Cells og reagenser
den humane Henrietta Mangler (Hela cellelinje), human ondartet melanoma cancercellelinje (A375) og den humane nyrekreft cellelinje (7860) ble oppnådd fra Shanghai Cell Collection (Shanghai, Kina). Hela og A375-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (GIBCO BRL, Grand Island, NY) inneholdende 5% føtalt bovint serum (FBS, GIBCO-BRL), 2 mM L-glutamin, og 100 enheter /ml penicillin /streptomycin og en 5% CO2-miljø ved 37 ° C. Nyrekreft 7860-celler ble dyrket i RPMI1640 medium, supplert med 5% FBS og antibiotika. Natriumnitroprussid (SNP), 2- (4-karboksyfenyl) -4,4,5,5-tetramethylimidazoline-en-oksy-3-oksyd (ptio), ditiotreitol (DTT), dimetylsulfoksid (DMSO) og Z-Leu- Leu-Leu-al (MG132) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO), Antistoffer for Bcl-2, fosfo-Bcl-2 (Ser87), NOS2 (iNOS), protein A-agarose, og IL -24-siRNA, iNOS-siRNA og egge kontroll-siRNA ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, California). Antistoffer for ubiquitin og S-nitrosocysteine var fra Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO). Antistoffer for β-aktin, procaspase-3, kløyvde caspase-3, procaspase-9, kløyvde caspase-9 antistoffer, anti-poly ADP-ribose polymerase (PARP) og spaltet PARP ble kjøpt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA)
Virus konstruksjon og produksjon
pZD55, den E1B 55-kDa-slettet onkolytisk adenovirus konstruksjon plasmid.; pCA13, E1-slettet adenovirus shuttle plasmid; og ZD55 forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) med reporter genet EGFP ble vennlig levert av Professor Liu (Xin-Yuan Liu, Institutt for biokjemi og cellebiologi, Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina). IL-24 ble først klonet inn pCA13 å danne pCA13-IL-24. Da IL-24 spaltet fra pCA13 ble subklonet inn pZD55 å konstruere pZD55-IL-24. Onkolytiske adenovirus, ZD55-IL-24 ble generert i HEK293 celler (Shanghai Cell Collection, Shanghai, Kina) ved homolog rekombinasjon mellom pZD55-IL-24 og adenovirus emballasje plasmid pBHGE3 (Microbix Biosystems), henholdsvis. Rensing i stor skala av alle adenovirus partiklene ble utført ved ultrasentrifugering med cesium-klorid i henhold til standardteknikker. De titere ble bestemt ved bruk av en plakett analyse på HEK293 celler.
Små interfering RNA-analyse
For forsøk med IL-24 spesifikke sirnas, celler (3 × 10
5 per brønn) var sådd ut i 6-brønns plater. Ved 24 timer etter inkubering ble HeLa cellene vasket, etterfylles med frisk medium og behandlet med ZD55-IL-24 (20 MOI) i 12 timer, cellene ble deretter vasket og plassert i friskt kulturmedium og tilsatt IL-24 spesifikke siRNA ( 100 nM) ved hjelp av et siRNA transfeksjon reagens. Etter 24 timer av siRNA transfeksjon, ble cellelysater fremstilt og utsatt for Western blot-analyse, som beskrevet nedenfor.
For forsøk med iNOS-sirnas,-celler ble transfektert med 100 nM iNOS-spesifikk siRNA i 12 timer, cellene ble deretter vasket og plassert i friskt kulturmedium og deretter behandlet med ZD-55-IL-24 (20 MOI) i 12 timer. Etter 24 timer av siRNA transfeksjon, ble cellelysater fremstilt og utsatt for Western blot-analyse, som beskrevet nedenfor.
Western blotting
etter bestemte behandlinger, ble celler inkubert i lyseringsbuffer inneholdende 20 mmol /L Tris-HCl (pH 7,5), 1% Triton X-100, 150 mmol /l NaCl, 10% glycerol, 1 mmol /l Na
3VO 4, 50 mmol /l NaF, 100 mmol /l
fenylmetylsulfonylfluorid, og en kommersiell protease-inhibitor-blanding (Roche Molecular Biochemicals) i 20 minutter på is. Etter at uoppløselig avfall ble pelletert ved sentrifugering ved 14 000 g i 15 minutter ved 4 ° C, ble supernatantene samlet og bestemt for proteininnhold ved anvendelse av Bradford fremgangsmåten (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Proteiner (80 ug) ble løst i henhold til denaturerende betingelser ved SDS-PAGE (10%) og overført på nitrocellulosemembraner. Etter blokkering i 2 timer i fosfatbufret saltvann med 0,1% Tween 20 (PBST) og 3% bovint serumalbumin (BSA), ble membranene inkubert over natten ved 4 ° C med det passende primære antistoff i PBST inneholdende 3% BSA. Membranene ble deretter vasket og inkubert med alkalisk fosfatase-konjugert geite-anti-kanin-IgG eller anti-muse-IgG (Sigma, 1:10 000) i PBST i 2 timer og utviklet ved hjelp av NBT /BCIP-substrat farge (Promega, Madison, USA).
immunoutfelling
immunopresipitering, cytosoliske fraksjoner (hver inneholdende 400 ug protein) ble fortynnet fire ganger med HEPES-buffer inneholdende 50 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Triton X-100, og 1 mM hver av EGTA, EDTA, PMSF og Na
3VO
4. Prøvene ble så pre-inkubert i 1 time med 20 ul protein A-agarose og sentrifugert for å fjerne eventuelle ikke-spesifikt overholdes proteiner fra protein A-agarose. Supernatanten ble deretter inkubert med 2 ug spesifikke antistoff over natten ved 4 ° C. Etter tilsetning av protein A-agarose, ble blandingen inkubert ved 4 ° C i ytterligere 2 timer. Prøvene ble trippel vasket med HEPES-buffer og eluert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE) ladningsbuffer og deretter kokt ved 100 ° C i 5 minutter. Immunkompleksene ble separert ved 10% SDS-PAGE og analysert ved Western blotting som beskrevet ovenfor.
Måling av apoptose av Annexin V-analyse
An Annexin V-bindingsanalysen ble anvendt i henhold til produsentens bruksanvisning. I korthet ble celler (3 x 10
5 per brønn) i seks-brønns plater ble behandlet med ZD55-IL24 (20 MOI) for den annen tid 12 h, 24 h, 36 h, 48 h og 72 h. Celler ble samlet og Annexin V-FITC og propidiumjodid (PI) dual-farging assay ble utført i henhold til produsentens instruksjoner ((Nanjing Keygen Biotech, Kina). Oppsamlede celler ble kort vasket med is-kald fosfat-bufret saltvann (PBS ) to ganger og resuspendert i 200 pl 1 x bindingsbuffer inneholdende 5 ul Annexin V-FITC i 15 minutter og deretter i 300 pl 1 x bindingsbuffer inneholdende 5 ul propidiumjodid (PI) i 5 minutter ved romtemperatur i mørke. etter inkubasjon ble cellene analysert ved hjelp av en FACStar strømningscytometer.
Celleviabilitet assay
carcinoma celler (1,0 x 10
4 per brønn) ble inkubert i triplikat i en 96-brønns plate og behandlet med ZD55-IL-24 og NO-modulatorer. Cell overlevelse ble vurdert ved en standard 3- (4, 5-dimethylthazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse (Sigma, St. Louis , MO) i nærvær eller fravær av de angitte testprøvene i et sluttvolum på 0,2 ml for kortere eller lengre tid ved 37 ° C. deretter ble 20 ul MTT-løsning (5 mg /ml i PBS) ble deretter tilsatt til hver brønn . Etter 4 timer inkubasjon ved 37 ° C, ble 150 ul DMSO ble tilsatt. Endelig platene ble ristet og den optiske tetthet ved 570 nm ble målt på ELX-800 spektrometer leser (Bio-Tek Instruments Inc., USA). Fire replikate brønner ble testet pr assay, og hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger. Prosent cellelevedyktighet ble beregnet som forholdet mellom de eksperimentelle prøver til kontrollprøvene x 100.
Statistisk analyse
Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Statistisk analyse av resultatene ble utført ved anvendelse av Students t-test eller en-veis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Duncan nye multiple range metode eller Newman-Keuls test.
P
-verdier. 0,05 ble vurdert som signifikante
Resultater
Effekt av ZD55-IL-24 på BCL-2 uttrykk og kreftcelle levedyktighet
protein uttrykk for IL-24 og E1A akkompagnert med adenovirus ZD55-IL-24 replikasjon og oversettelse i Hela ble A375 og 7860 celler påvises ved Western blotting på ulike tidspunkter. Våre data viste en tydelig økning av IL-24 fra 24 timer til 72 timer sammenlignet med kontroller, som vist på fig. 1A. På samme tid, E1A protein står for replikasjon evne ZD55-IL-24 viste det åpenbare forbedring fra 12 timer til 72 timer i fig. 1B, som er lik tidsforløpet for forbedret grønn fluorescens protein (EGFP) ekspresjon behandlet med ZD55-EGFP på fig. 1D. I tillegg har Bcl-2 ekspresjon den inverse redusert fra 24 timer til (1c Fig.) 72 timer. Videre ble Bcl-2 nedgang i respons til ZD55-IL-24 er vist på en doseavhengig måte. De effektive titere av ZD55-IL-24 for å inhibere Bcl-2 ekspresjon er 10 og 20 MOI, som vist på fig. 2A. For ytterligere å undersøke hvorvidt ZD55-IL24 påvirker tre karcinomceller overlevelse, ble cellenes levedyktighet bestemt ved MTT-analysen (fig. 1E). Våre resultater viste at ZD55-IL-24 effektivt redusert celleoverlevelse, og denne inhibering ble også vist i en doseavhengig måte (fig. 1E og 2C). Samlet utgjør disse resultatene indikerer ZD55-IL24 kunne megle et høyt nivå og stabil IL-24 uttrykk fra 24 timer til 72 timer og reduserer BCL-2 proteinnivået i tids- og doseavhengig måte.
effekt av ZD55-IL-24 på BCL-2 S-nitrosylation og ubiquitinering
for å undersøke om ZD55-IL-24 ville bidra til endring av BCL-2 S-nitrosylation og ubiquitinering, vi har oppdaget BCL-2 S -nitrosylation og ubiquitinering nivå i Hela, A375 og 7860 celler. Resultatene viste at ZD55-IL-24 i HeLa-celler redusert Bcl-2-S-nitrosylation fra 79% ved 24 timer til 38% etter 48 timer sammenlignet med kontrollgruppen (Fig. 3A). I motsetning til dette økte Bcl-2 ubiquitinering fra 1,4 ganger ved 24 timer til 2,3 ganger etter 48 timer, som vist i fig. 3B. Resultatene fra A375 og 7860-celler var i overensstemmelse med den ovenfor trend. For ytterligere å bekrefte den potensielle rolle til IL-24 i reguleringen av Bcl-2-S-nitrosylation og ubiquitinering, spesifikk IL-24-siRNA ble anvendt for å knockdown IL-24 ekspresjon. Våre data indikerte IL-24-siRNA åpenbart gjenopprettet Bcl-2-S-nitrosylation og således undertrykket Bcl-2 ubiquitinering sammenlignet med egge kontroll siRNA (Fig. 3C). Derfor ZD55-IL-24-indusert redusert BCL-2 S-nitrosylation og økt BCL-2 ubiquitinering.
Effekt av ZD55-IL-24 på caspaseaktivering og kreftcelle apoptose
For ytterligere bestemme hvorvidt Bcl-2 avvikende forringelse i respons til ZD55-IL-24 ville resultere i aktivering av caspase signalreaksjonsveien i HeLa-celler, caspase-9, caspase-3 og PARP ble detektert ved forskjellige tidspunkter 12 timer, 24 timer , 36 h og 48 h henholdsvis, som vist i fig. 4A. Resultatene viste at procaspase-9 gradvis ble redusert fra 76% ved 24 timer til 36% ved 48 timer. I motsetning til dette spaltes caspase-9 tilsvarende øket fra 1,5- til 24 timer til 2,5 ganger etter 48 timer sammenlignet med kontrollgruppen. Caspase-3 og PARP utførte lignende endring som caspase-9. Våre resultater viser at ZD55-IL-24-indusert spaltning av caspase-9, caspase-3 og PARP å aktivere caspase signalvei. I tillegg ble HeLa-celler påvises ved apoptose Annexin V /PI og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri (fig. 4B og C). Resultatene indikerte at ZD55-IL-24 dramatisk forbedret apoptose i HeLa-celler fra 2.3- ved 24 timer til 7,4-fold på 72 timer sammenlignet med kontrollgruppen. Tatt sammen, ZD55-IL-24 initiert caspase signalvei aktivering og kreftcelle apoptose.
Effekt av Bcl-2-S-nitrosylation endring på regulering av dens ubiquitinering i respons til ZD55-IL-24
For å undersøke om ZD55-IL-24 kan regulere BCL-2 S-nitrosylation via NO, som senere påvirker dens ubiquitinering, behandlet vi Hela, A375 og 7860 celler med NO donor SNP, NO hemmer ptio og SNP samtidig administrasjon av reduksjonsmidlet DTT etter administrering av ZD55-IL24, respektivt. Som vist på fig. 5A, eksogene NO donor SNP effektivt økte BCL-2 S-nitrosylation mens dette redning effekten ble opphevet ved samtidig behandling med DTT. På samme tid, NO inhibitor ptio betydelig redusert Bcl-2-S-nitrosylation. Omvendt, NO donor SNP hemmet ubiquitinering av Bcl-2, men DTT ko-behandling motvirket effekten av SNP. Videre, NO inhibitor ptio muliggjort ubiquitinering av Bcl-2 i fig. 5B. Fig. 5C viser ZD55-IL-24 behandling i 24 timer forårsaket en signifikant reduksjon av Bcl-2-ekspresjon, som ble ytterligere redusert ved tilsetning av NO inhibitor ptio. I motsetning til dette, behandling med NO donor SNP betydelig motstand ZD55-IL-24-indusert Bcl-2-nedregulering. 6A. 7A. Fig.
