Abstract
Phellinus linteus (PL) sopp besitter anti-tumor eiendom. Vi har tidligere rapportert at behandling med PL som skyldes dyrkede humane prostatacancerceller til å gjennomgå apoptose. For ytterligere å studere mekanismene for PL-mediert apoptose, utførte vi xenograft-analyse, sammen med
in vitro
assays, for å evaluere effekten av PL på dannelsen og utviklingen av svulster dannet fra inokulering av prostatakreft PC3 eller DU145 cellene. Etter inokulering ble nakne mus injisert med PL annenhver dag i 12 dager. Selv om PL behandling ikke hindre dannelsen av inokulert svulster, ble veksten av svulstene etter PL behandling dramatisk svekket. Vi testet da effekten av PL på svulstene 12 dager etter vaksinasjonen. Etter inokulerte tumorer nådd en viss størrelse, ble PL administrert til musene ved subkutan injeksjon. Den histokjemi eller Immunokjemiske analyser viste at apoptose forekom med aktiveringen av caspase 3 i tumorene dannet ved inokulering av prostatakreft DU145 eller PC3-celler. Dataene var i god overensstemmelse med det fra dyrkede celler. Således, tyder våre in vivo studie at PL ikke bare er i stand til å dempe tumorvekst, men også for å bevirke tumorregresjon ved indusering av apoptose
relasjon:. Tsuji T, Du W, Nishioka T, Chen L, Yamamoto D Chen CY (2010) Phellinus Linteus Extract sensitizes Advanced prostata kreft celler til apoptose i atymiske nakne mus. PLoS ONE 5 (3): e9885. doi: 10,1371 /journal.pone.0009885
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada
mottatt: 03.12.2009; Godkjent: 11 februar 2010; Publisert: 31 mars 2010
Copyright: © 2010 Tsuji et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet av midler fra JCRT Foundation til CYC. Finansiører hadde ingen rolle i studien, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er et herjet sykdom hos menn. Selv om behandling (for eksempel kirurgi eller androgen ablasjon) har bedret overlevelsen av pasientene fortsatt mangel på suksess med hormon-refraktær prostatakreft. De avanserte svulster er ofte resistente mot cellegifter. Selv om mekanismene for motstand er uklar, er det blitt postulert at utviklingen av svulster, som for eksempel ildfast prostatakreft, er relatert til akkumulering av genetiske eller epigenetiske forandringer. I asiatiske, er PL en av veletablerte medisinske sopper som har blitt brukt for å behandle ulike menneskelige kreftformer. Undersøkelser viste at den vannoppløselige fraksjon av PL er biologisk aktiv, noe som sannsynligvis er polysakkarid [1] – [3]. Det har også blitt vist at PL er i stand til å undertrykke tumorer
in vitro
enten indirekte ved å forbedre vertens immunsystem, eller direkte ved å indusere apoptose i tumorceller [4] – [6]. Nylig rapporterte vi at PL er bemerkelsesverdig effektivt til å inhibere veksten av forskjellige prostatakreft-cellelinjer uten toksiske effekter på normale prostata epitelceller [7]. Siden PL besitter anti-tumor, anti-angiogene og immunmodulerende egenskaper, har det trukket brede interesser i Asia for å utvikle det for anti-kreftbehandling. For å utvikle dette legemidlet sopp som anti-prostatakreft rette, er en bedre forståelse av de underliggende molekylære mekanismene for PL funksjoner nødvendig.
En potensiell av et medikament for å indusere apoptose har vært mye brukt som en strategi for utvikling av ny kreftbehandling. Det er kjent at apoptose kan utløses av en rekke interne eller eksterne signaler. Caspases, en høyt konservert familie av cystein proteaser, er sentrale apoptotiske effektorer i celler og spiller avgjørende roller i reguleringen av apoptose gjennom en kjede cleavage reaksjon [8], [9]. Caspaser eksistere som pro-enzymer i cytosol av celler og aktiveres gjennom proteolyse. Ved celledød stimuleringer, kaspase 8, som en initiator, utløser aktiveringen av nedstrøms effektor caspaser 3 og 7, noe som resulterer i BID spalting og cytokrom c meldingen [10] – [12]. Frigjøringen av cytokrom c fra mitokondriene til cytosol fører til dannelse av det apoptosome, som i sin tur utløser den indre apoptotiske maskineri. PL har vist seg å føre til prostata kreft celler til å gjennomgå apoptose ved å utløse caspase kaskade [6], [7]. Videre lave doser av doxorubicin (en anti-kreft-medikament), sammen med lave konsentrasjoner av PL, har en synergistisk effekt på induksjonen av apoptose i humane prostatacancerceller [13].
Tidligere har vi rapportert det PL er i stand til å sensibilisere dyrkede prostata kreftceller til apoptose, hvori caspaser ble aktivert [7]. Vår foreliggende undersøkelse, som videreføring av undersøkelse av anti-tumor egenskap av PL, videre demonstrert evne til PL å indusere apoptose i tumorene ved inokulering av prostatakreft DU145 eller PC3-celler i nakne mus. Vi viste at injeksjon av PL dramatisk svekket tilblivelsen av svulstene i hårløse mus etter vaksinasjonen. Vår studie viste også at ved PL injeksjon, de dannet svulster ved inokulering DU145 eller PC3 celler til hårløse mus gikk en regresjon, ved å utløse en apoptotiske prosesser.
Metoder
Cells og reagenser
Phellinus Linteus
pulver ble kjøpt fra Panbio-Tech (Taejon, Sør-Korea) og oppløst i vann. Etter å ha kokt i 5 minutter, ble PL oppløsningen sentrifugert og supernatanten ble oppsamlet for studien. DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagles medium); antibiotika (penicillin og streptomycin) og trypsin-EDTA ble kjøpt fra Invitrogen. Humane prostatakreft PC3-celler (American Type Culture Collection) ble dyrket i DMEM-medium supplert med 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin, 100 forener /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin.
Xenotransplantat analysen
Herre naken mus (NCRNU-mM, CrTac: Ncr-Foxn1nu) (Taconic) på alderen 4-6 uker ble brukt. Human prostata cancer PC3-celler (5 x 106) i 100 ul PBS ble inokulert inn i den høyre flanken av hver mus. Tre mus ble tjente som en positiv kontroll. For inhibering av tumordannelse, ble 6-mus behandlet med PL (30 mg /kg i 100 ul PBS) rett etter inokulering og deretter administrert samme mengde PL hver 2 dager. En annen 3-mus ble behandlet med lik mengde av kontroll Hitachi soppløsningen etter samme tidsforløp som den som anvendes for PL. Størrelsen på tumorene ble målt etter 4 dager med en skyvelære, og beregnet i henhold til Tamayko formel [14]. For overvåking tumorregresjon, etter at de implanterte tumorer nådde ca 1,0 cm i diameter, ble musene behandlet med enten PL (30 mg /kg) eller den samme mengde av kontrollsoppløsningen hver 2 dager. Ti dager senere ble musene avlivet og tumorene ble isolert for histopatologi eller histokjemi analyse.
Histopatologi eller immunhistokjemi analyser
Isolerte tumorer ble fiksert i 4% fosfatbufret nøytrale paraformaldehydoppløsning (pH 7,4). De histologiske prøver ble seksjonert og farget med hematoxylin /eosin (H E) (. I Santa Crutz Biotec), TUNEL eller tilsvarende antistoffer
Statistisk analyse
Verktøy og standardavvik av resultatene av. forsøkene ble beregnet. Standardavvik vises som feilfelt i tallene. En Student t test ble brukt, og en
p
verdien av 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
PL demper DU145 eller PC3 celler til å danne svulster i nakne mus
studier har antydet at PL har en anti-tumor egenskap [1], [6], [7]. Vi demonstrerte at PL ikke bare er i stand til å initiere apoptose i forskjellige ondartede prostatakreftcellelinjer, men induserer G
1 arrest i normale prostata epitelceller [6], [7], [13]. For ytterligere å teste den anti-tumor effekt av PL, ble xenograft analyse anvendt. Etter inokulerte humane prostatacancer PC3-celler i nakne mus subkutant, ble PL samtidig injisert i mus. Deretter ble den samme mengde av PL injisert i mus hver to dager. Tolv dager senere ble bilder av mus med svulster tatt (Fig. 1A, øvre panel) og lysbildene montert med tumorvev ble farget med HE (Fig. 1B, nedre panel). Tumorene i PL-behandlede mus var mye mindre enn den i kontrollmusene, og viste et tydelig mønster av HE-farging.
A. DU145 eller PC3-celler ble inokulert subkutant i nakne mus. Tolv dager senere ble bilder av mus med de inokulert svulster tatt (øvre panel). Tumorene ble isolert fra PL behandlede eller kontrollmus. Skinnene monteres med tumorvev var forberedt og farget med HE fargestoff (nedre panel). B og C. En gruppe på 6 mus ble injisert med PL (30 mg /kg) i vann fra dag 0 og deretter administreres hver 2 dager. En annen gruppe av 3 var som kontrollene. En uke senere når inokulert tumor begynt å danne, størrelsen på svulstene ble målt hver 4. dag.
Vi målte også diametrene til de inokulerte tumorer, en uke senere etter inokulering når all musene begynte å vise tegn på dannelse av faste tumormasser. Målingene ble foretatt hver fjerde dag i 12 dager (fig. 1B og C). På dag 12, styre svulst messes fra inokulering av to cellelinjer var i ferd med mer enn 2 bretter større enn de som ble behandlet av PL. For å utelukke muligheten for toksisitet utført av PL, vekten (fig. 2A) og vannforbruk (fig. 2B) av musene ble målt og sammenlignet. PL-behandlede mus hadde en lignende vekt eller vannforbruk som kontrollene, noe som tyder på at PL ikke har en side-effekt på behandlede eller ubehandlede mus. For å kunne fastslå hvorvidt PL behandling hadde noen toksiske virkninger på mus, ble leveren også isolert ut fra dyrene. Den histokjemi farging med HE fargestoff viste at strukturene av leveren fra PL-behandlede mus var tilsvarende som den som er isolert fra kontrollmusene (data ikke vist). Begge lever dukket frisk uten noen bevis på degenerasjon, fibrose, apoptose eller nekrose. Den in vivo studie antyder at PL er i stand til å dempe hastigheten av veksten av de inokulerte tumorer i nakne mus.
A og B. Etter at tumorknuter ble dannet, kroppsvekten (A) og vannforbruk (B) fra hver mus med eller uten behandlet med PL ble målt. Feilfelt representerer standardavvik 3-6 mus.
PL behandling fører til vekst regresjon i svulstene inokulert av prostatakreftceller
Vi testet da effekten av PL på eksisterende svulster. Når de inokulerte tumorene nådde til størrelsen av 1,0 cm i diameter, ble PL injisert i mus annenhver dag i totalt ti dager. Tumorene ble isolert og preparert for histopatologisk eller immunohistochemitry analyse. Den HE-farging viste at svulster isolert fra PL- eller kontroll mus var godt avgrenset med bindevev (Fig. 3A). Celledød viste seg å forekomme i PL-behandlede tumorer fra inokulering av to forskjellige prostatacancer-cellelinjer med flere ufargede vakuoler, som var fraværende i kontroll tumorer. For ytterligere å avgjøre om apoptose skjer i PL-behandlede tumorer, ble immunhistokjemi analyse ved hjelp TNUEL flekker (for å påvise DNA trådbrudd) utført (Fig. 3B). Lysbildene fra PL-behandlede tumorer var sterkt farget med TUNEL flekker, men bare et fåtall TUNEL flekker positive celler ble detektert i kontroll svulster. Prosentene av celler som farget positivt TUNEL ble målt i kontrollgruppen, og PL-behandlede tumorer (data ikke vist). Mer enn 30% av cellene i PL-behandlede tumor hadde brutt DNA-tråd og meget liten prosent av celler fra kontroll tumorer (omtrent 5%) farget positivt. Den immunhistokjemi farging ved anvendelse av anti-kaspase 3-antistoffet ble også utført for å påvise ekspresjon av caspase 3 (fig. 3C). Et stort antall celler i PL-behandlede tumor dannet ved inokulering av PC3-celler ble omsatt med antistoffet. Til sammenligning, bare noen få celler i kontrolltumor uttrykte et høyt nivå av caspase 3. Tilsvarende resultater ble oppnådd fra tumorene dannet ved inokulering av DU145-celler (data ikke vist). Dermed tyder resultatene på at celledød skjedde i PL-behandlede tumor er gjennom apoptose.
A. Tumorene ble fremstilt for hematoksylin og eosin-farging. B og C. Skinnene monteres med tumorvev ble farget med TUNEL middel (B) eller anti-caspase 3 antistoff (C).
For ytterligere å teste evnen til PL å indusere apoptose, DU145 og PC3-celler ble behandlet med PL ved 1 mg /ml eller 2 mg /ml i 48 timer. Annexin V-analyse ble utført (fig. 4). Etter å ha blitt behandlet med PL, omtrent 15% av PL-behandlede celler gjennomgikk apoptose, på en doseavhengig måte. En baseline farging av Annexin V ble sett i kontroll svulster. Interessant, PC3 cellene mer følsomme for PL enn DU145 cellene. Totalt sett,
in vitro
data er konsistent med den som oppnås fra dyreforsøk.
Cellene ble behandlet med 1 mg /ml eller 2 mg /ml i 48 timer, og deretter farget med Annexin V. Feilfelt representerer standardavvik fra 3 uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
vi har tidligere vist at PL induserer dyrkede prostata kreft celler til å gjennomgå apoptose [7], [13 ]. Her, ved hjelp av xenograft-analyse viste vi at PL er istand til å frembringe en apoptotisk respons
in vivo
for å blokkere veksten av tumorene dannet ved inokulering av human prostatakreft DU145 eller PC3-celler. Den histokjemi farging Analysen viste at de fleste av cellene i tumorene isolert fra PL-behandlede mus er apoptotisk, manifestert ved positivt farget med TUNEL og omsatt med et anti-kaspase 3 antistoff. Forekomsten av apoptose ble også demonstrert i dyrkede DU145 eller PC3-celler etter behandling med PL for 48 på en doseavhengig måte. Dermed vår studie, ved hjelp av
in vivo
samt
in vitro
analyser, inidcates at PL Behandlingen fører caspase kaskade å indusere apoptose i prostatakreftceller, som gir et sterkt bevis for potensialet i PL som et anti-prostata cancer middel.
Det er kjent at PL er ikke-toksiske i generell [1]. Tidligere rapporterte vi at PL, ved høye doser, induserer kontroll lunge epitelceller for å arrestere i G
1 fasen av cellesyklusen ved å blokkere ekspresjonen av cyclin D
1 og dets interaksjon med cellesyklus-avhengige kinaser 4 og 6 [6]. I denne studien, data fra histopatologisk analyse viser at injeksjon av PL inn i nakne mus inokulert med enten DU145 eller PC3 prostatakreftceller ikke har noen skadelig effekt på mus, manifestert ved at behandlingen ikke spiller noen rolle i veksten eller vannforbruk av musene. Viktigst, leverprøver fra de behandlede mus er normal uten degenerering eller fibrose. Det er mulig at, som
in vitro
eksperimenter, behandling med PL utløser celle sjekkpunkt styrer i normalt vev eller organer, som ikke er skadelig for mus. I inokulerte svulster, vises den samme behandlingen å være veldig mye cytotoksiske.
Programmert celledød er viktig maskiner for å utelukke unormale eller kreftceller. Aktivering av kaspase-familiemedlemmer er kjernen av apoptose, som representerer et krysningspunkt mellom ulike apoptotiske baner i forskjellige typer kreftceller, inkludert prostata kreftceller. TNF eller Fas /CD95-reseptorer, mitokondrielle proteiner (så som cytokrom c), og granzyme er i stand til å indusere celledød ved aktiveringen av caspase kaskade [8], [9]. Skade på eller stress i ER eller Golgi har vist seg å være i stand til å utløse apoptose [15], [16]. Studier har vist at den ufoldede protein respons eller mangel på kalsium er ansvarlig for ER-mediert apoptose [15]. ER stress har blitt vist å forårsake at translokasjon av visse caspaser til ER eller Golgi og gjennomføring av apoptose der. Kalsium løslatt fra ER i tider med ATP-mangel er et viktig element i apoptose indusert av iskemi-reperfusjon skade. Vi har vist at PL behandling utløser caspaseaktivering i dyrkede prostatakreftceller [7], [13]. Vår
in vivo
Studien indikerer at PL behandling er også i stand til å initiere apoptose via aktivering av caspase 3 som er effektor i caspase kjedereaksjon. Etterforskningen av om andre caspases er involvert i induksjon av apoptose
in vivo
er i gang.
PL er en av veletablerte medisinske sopper som er tatt muntlig som en felles helse- fremme kosttilskudd eller en adjuvant å behandle maligniteter i Asia i mange tiår. Ekstraksjon fra vann-løselige fraksjon PL viser en forholdsvis homogen molekylvektsfordeling på gelgjennomtrengnings-HPLC og er beregnet til å være rundt 150-180 kD fra den retensjonstid på HPLC pullulan molekylære markører [1]. De viktigste komponentene i PL har blitt foreslått å være ulike polysakkarider [1] – [3]. Det har også vist seg at den vannoppløselige fraksjon av PL er i stand til å undertrykke svulster, enten indirekte ved å forbedre vertens immunsystem, eller direkte ved å indusere apoptose i tumorceller [4], [5]. Men det er fortsatt uklart hvilke sammensetninger av polysakkarid i PL har anti-kreft effekt.
I sammendraget, vellykket bruk av PL til å behandle prostatakreft krever fullt forståelse av mekanismene for hvordan PL formidler anti- tumor aktiviteter i svulster. Vår tidligere studien viste at PL, gjennom aktivering av kaspaser, er i stand til å indusere apoptose i dyrkede kreftceller. I den foreliggende undersøkelse, ved hjelp av xenograft assay, vi viser videre at injeksjon av PL inn i nakne mus med subkutane tumorer dannet ved inokulert med prostatakreft DU145 eller PC3-celler induserer flertall av inokulerte tumorceller til å miste sine viabilities. Dermed vår
in vivo
data støtter forestillingen om at PL, ved å slå på en svulst undertrykkelse-relaterte maskiner, kan utvikles som en effektiv terapi for å behandle menneskelige maligniteter, for eksempel ildfast prostatakreft.
takk
Vi takker Dr. Hu (Harvard Medical School, MA) for å gi reagenser for prosjektet.
