Abstract
CD133 er en membran molekyl som har vært, kontroversielt, rapportert som et CSC markør i tykk- og endetarmskreft (CRC ). I denne studien, søkte vi å avklare uttrykk og rolle CD133 i CRC. Til å begynne med størrelsen av CD133-uttrykk (CD133 +) populasjonen i åtte godt beskrevne CRC-cellelinjer, ble målt ved flow-cytometri og ble funnet å variere fra 0% til mer enn 95%. Cellelinjen HT29 har en CD133 + populasjon av mer enn 95%, og ble valgt for en undersøkelse av CD133 etter genet knockdown etter RNA-interferens. En gang kurs analysen viste at CD133 hemming hadde ingen signifikant effekt på celleproliferasjon eller apoptose. Imidlertid CD133 knockdown resulterte i økt mottakelighet for staurosporin-indusert apoptose (p = 0,01) og reduksjon i celle motilitet (p 0,04). Siden genet knockdown kan forårsake «off-target» effekter, ble cellelinjen SW480 (som har en CD133 + befolkning på 40%) sorteres i rene CD133 + og CD133- populasjoner for å tillate funksjonell sammenligning av isogene populasjoner kun atskilt av CD133 uttrykk. I samsvar med knockdown eksperimenter, viste en gang kurs analysen ingen signifikante proliferative forskjeller mellom CD133 + /CD133- populasjoner. Også større motstand mot staurosporin-indusert apoptose (p = 0,008), større cellemotilitet (p = 0,03) og større kolonidannende effektivitet ble sett i CD133 + befolkningen enn CD133- befolkningen i både 2D og 3D kultur (p 0,0001 og p 0,003 henholdsvis). Til slutt ble plastisitet av CD133-ekspresjon i tumorceller undersøkt. Kvantitativ PCR-analyse viste at det var transkripsjonen undertrykkelse i CD133- befolkningen i SW480. Langvarig kultur av en ren CD133- befolkning resulterte i ny fremvekst av CD133 + celler. Vi konkluderer med at CD133 uttrykk i CRC er forbundet med noen funksjoner som kan tilskrives stemness og at det er plastisitet CD133 uttrykk. Videre studier er nødvendig for å avgrense mekanistisk grunnlag av disse funksjonene
Citation. Elsaba TMA, Martinez-Pomares L, Robins AR, Crook S, Seth R, Jackson D, et al. (2010) stamcelle Marker CD133 Associates med Enhanced Colony Forming og cellemotilitet i tykktarmskreft. PLoS ONE fem (5): e10714. doi: 10,1371 /journal.pone.0010714
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 9 februar 2010; Godkjent: 27 april 2010; Publisert: May 19, 2010
Copyright: © 2010 Elsaba et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av University of Nottingham og CR-UK. Tarek Elsaba er en mottaker av et doktorgradsstipend som har blitt gitt av den egyptiske regjeringen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
de siste årene har sett fremveksten av «kreft stamcelle hypotesen» som postulerer at et mindretall populasjon av celler i en svulst består av kreft stamceller (CSC) [1], [2]. Denne populasjonen er angivelig ansvarlig for å generere hoveddelen av tumor som består av celler i varierende grad av differensiering. Hierarkiet av en tumor er således antatt å være lik den vev fra hvilken tumor-opprinnelse og cscs anses neoplastiske motstykker av stamceller i normalt vev. I denne forbindelse ville cscs forventes å ha en stamcelle-lignende fenotype (vanligvis referert til som «stemness»). Dette er preget av funksjoner som grenseløs replicative evne, multipotency og motstand mot apoptose [3]. Stamcelle-fenotypen kan også innbefatte cytomegalovirus-beskyttende strategier som evne til aktivt å ekstrudere farlige stoffer fra den celle en funksjon som kan være basis av resistens overfor kjemoterapeutiske midler [3], [4].
I parallelt med fremveksten av kreft stamcelle hypotese, har det vært en økende interesse for isolering og studier av cscs. En rekke studier hevder å ha isolert cscs fra flere forskjellige tumortyper, for eksempel hjerne [5], [6], bryst [7], tykktarm [8], [9], hepatocellulært karsinom [10] og kreft i bukspyttkjertelen [11] . Disse studiene har brukt putative CSC markører for å separere stamceller fra differensierende celler i en tumor. En vanlig metode for separering er fargestoffet eliminasjonsmetoden (dvs. side befolkning [12]), selv om identifikasjon av et antall celleoverflatemarkører (slik som CD24, CD44, CD166, og griner) har tillatt bruk av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) for å isolere cscs [13]. En markør konsekvent rapportert som en stamcelle markør i svulster av ulik opprinnelse er CD133 (også kjent som Prominin 1).
CD133 genet (
PROM1
) maps til kromosom 4p15 og koder for et 120 kD transmembrane glykoprotein (ENSG00000007062). Den CD133 protein er pentaspan celleoverflatereseptor selv om verken sin ligand eller dets sekundære budbringere er kjent. Det ble først anerkjent som en overflate markør for hematopoietiske stamceller [14], [15]. Senere ble det brukt til å gjenkjenne kreftstamceller i mange solide svulster som oppstår i, for eksempel brystkreft [13], bukspyttkjertel [16] og lever [17].
To nyere studier identifisert CD133 som en markør for stamceller in colorectal cancer (CRC) [8], [9]. I disse studiene, CD133 uttrykker (CD133 +) celler ble isolert fra primære CRC og ble vist å ha evnen til å danne svulster som xenotransplantater i nakne mus; I motsetning CD133- celler fra de samme tumorer ble vist å ha svært begrenset evne til å danne transplantater, og selv som ble tilskrevet forurensning av CD133 + celler. Analyse av xenotransplantater som ble dannet viste at størrelsen på CD133 + populasjonen var lik den som sees i den primære tumor og dessuten evne til kontinuerlig å forplante xenotransplantater ble tett forbundet med CD133 uttrykk. Senere studier har imidlertid ikke bekreftet disse observasjonene [18] og i en studie har det blitt rapportert at, i virkeligheten, har CD133- befolkning større kolonidannende evne til [19]. Vår studie søkt å ytterligere å klargjøre uttrykk og rollen til CD133 i CRC. To fremgangsmåter ble anvendt: (i) ekspresjon ble CD133 funksjonelt evaluert i HT29 etter genet knockdown og (ii) SW480 gikk cellesortering inn i en CD133 + -populasjonen og en CD133- befolkning, etterfulgt av sammenlignende funksjonell analyse av de to populasjonene
Materiale og metode
Tissue kultur, flowcytometri og fluorescens aktivert celle sortering
Åtte menneskelige kolorektal kreft cellelinjer (Caco2, DLD1, HT29, Lovo, LS1034, SW480, SW620, SW837) var opprettholdt som tidligere beskrevet [20]. Identiteten til alle cellelinjer ble bekreftet av fingerprinting for mutasjoner i
KRAS, BRAF, PI3KCA, CDC4, TP53 Hotell og testing mikro ustabilitet.
Evaluering av størrelsen på CD133 uttrykke (CD133 +) populasjonen i hver cellelinje ble foretatt ved hjelp av strømningscytometri ved anvendelse av en fykoerytrin (PE) merket antistoff – CD133 /1 (klon AC133 /1, Miltenyi Biotec, UK). Cellene ble løsnet ved hjelp av ikke-enzymatisk celledissosiasjon oppløsning (Sigma) og omtrent 5 x 10
5-celler ble inkubert med antistoff (fortynnet 1:100 i FACS-vask (0,5% bovint serumalbumin, 2 mM NaN
3; 5 mM EDTA)) i 15 minutter ved 4 ° C. En isotype matchet og konsentrasjon PE-merket kontrollantistoff (Miltenyi Biotec, UK) ble anvendt, og prøver merket med dette antistoff ble brukt til å sette lede nivåer. Etter tre 5 minutters vaskinger med FACS-vask ble cellene resuspendert og fiksert i oppløsning inneholdende FACS vask med 1% formaldehyd. Bestemmelse av prosentandel av CD133 + celler og sortering av cellelinjer inn CD133 + /CD133- populasjoner ble utført på en Epics Altra flowcytometri maskin (Beckman Coulter). Resultatene ble analysert ved bruk av WinMDi 2,9 datamaskinprogramvare.
For fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) av SW480 ble cellene merket ved bruk av den samme protokoll, men uten den endelige fiksering trinnet. For å evaluere plastisitet av CD133 ekspresjon, ble sorterte cellene holdt i kultur i 3 uker før under revurdering. For alle andre forsøk ble CD133 + /CD133- populasjoner testet umiddelbart etter sortering.
RNA-ekstraksjon, påvisning av spleisevarianter og mRNA kvantifisering
Total RNA ble ekstrahert fra cellene ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen) etter produsentens anvisninger. Prøver av normal tarmslimhinnen ble samlet inn med full godkjenning av den lokale etikkutvalg (Oxford forskningsetiske komité B, REC henvisning C02.310). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter som prøver ble testet for CD133 uttrykk og spleisevarianter. RNA ble ekstrahert og komplementært DNA (cDNA) ble syntetisert som tidligere beskrevet [20].
To hovedspleisevarianter er blitt beskrevet for CD133. Jo større variant AC133-1 (NM_006017) ble identifisert først og inneholder alle eksoner [15]. Den andre varianten, AC133-2, skjøter ut exon 4 som er 27 basepar langt og koder for et 9 aminosyresekvens i den første ekstracellulære domene av CD133. Ekspresjon av spleisevarianter ble testet ved hjelp av RT-PCR ved anvendelse av en oppstrøms primer i exon 3 og en nedstrøms primer i exon 5 (primersekvenser tilgjengelig fra forfatterne). Dette vil gi et produkt av 199 basepar fra AC133-1 og 172 bp fra AC133-2. Sluttpunkt PCR-analyse ble utført ved å vise PCR-produkter på agarosegel. Imidlertid, gitt at foretrukket amplifikasjon av det mindre produktet kan frembringe data gjenstander, ble undersøkelsen gjentatt ved bruk av sanntids-PCR (med SYBR grønn som rapportør fargestoff) på MX3005P termosykler (Stratagene, UK). Spesifisiteten til PCR ble validert ved toveis direkte sekvensering. Tilstedeværelsen av spleisevarianter ble testet i cDNA hentet fra CRC cellelinjer, de sorterte CD133 + og CD133- bestander av SW480 samt 10 prøver av normal tarmslimhinnen
Ordnet CD133 +/- bestander gikk analyse av mRNA nivåer ved kvantitativ RT-PCR-analyse ved bruk av standardkurven metoden. Analysen ble utført i tre eksemplarer for hver prøve og
CD133
verdier ble normalisert til husholdningsgenet
HPRT
. Hver reaksjon ble utført i et sluttvolum på 25 ul i et MX3005P termosykler (Stratagene, UK). Dataene for Q-PCR ble analysert ved hjelp av MxPro-QPCR programvare.
Gene knockdown
Gene knockdown ble oppnådd ved trans HT29 celler (vist seg å ha høy CD133 uttrykk) med CD133 spesifikke liten interfering RNA (siRNAs). Omtrent 2 x 10
5-celler ble sådd ut i 2 ml DMEM media med 10% FBS i 6-brønners plater (Corning) 24 timer før transfeksjon. -Celler ble transfektert med CD133-spesifikk snike siRNA duplekser (sekvens: 5′-GAGUCGGAAACUGGCAGAUAGCAAU-3 «, Invitrogen) ved en sluttkonsentrasjon på 33 nM ved bruk av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Disse er heretter kommentert som HT29
CD133-. Kontrollene besto av celler transfektert med egge kontroll siRNA (sekvens: 5′-GAGGGAACAGUCGGAUAGACCUAAU-3 «). Og er heretter kommentert som HT29
SSC (kryptert siRNA kontroll)
Western blotting
for Western blotting, ble lysatene forberedt og kvantifisert som tidligere beskrevet [20]. Prøver (30 pg) ble underkastet Sodium Dodecyl Sulfate polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) under anvendelse av en 10% løsning av polyakrylamid-gel og overført til en Hybond-P PVDF-membran (Amersham Bioscience). Etter blokkering med 5% bovint serumalbumin (BSA) /0.1% TPBS (Tween 20 i PBS-løsning) i 60 minutter, membranen ble deretter inkubert over natten ved værelsetemperatur med CD133 (C24B9) Kanin-mAb (Cell Signaling) i en konsentrasjon 1:1000. Membranen ble vasket med 0,1% TPBS 3 ganger i 5 minutter hver og så inkubert i 1 time ved romtemperatur med et pepperrot peroksidase-koblet sekundært antistoff (Sigma Aldrich) (1:10000, anti-kanin-IgG) fortynnet med 5% BSA /PBS inneholdende 0,1% Tween 20. Etter ytterligere 3 vaskinger, ble membranen visualisert forbedrede Chemiluminescence reagenser (Thermo Scientific) for en lastekontroll, ble det monoklonale anti-β-aktin-antistoff (Sigma Aldrich) i en fortynning på 1:2000 mot β-aktin protein som brukes.
proliferasjonsanalyser
En gang kurs analysen for spredning ble utført etter genet knockdown og etter cellesortering. For HT29, ble hver brønn av en 24 brønn plate podet med 10
4-celler 24 timer etter transfeksjon med enten CD133 spesifikk eller kryptert kontroll siRNA. Celle tall ble vurdert på dag 1, 3 og 5. For SW480 de sorterte CD133 + og CD133- populasjoner ble sådd på 10
4 celler per brønn og celle tall vurderes på dag 1, 3, 5, 7 og 9. Minst to uavhengige forsøk, hvert i tre eksemplarer, ble utført. En metylenblått-analyse [21], [22] ble brukt til å kvantifisere antallet adherente levedyktige celler.
Stauropsorine apoptose
Staurosporin ble anvendt for å evaluere motstanden gitt av CD133 for å eksogene apoptotiske påkjenninger . For HT29, ble hver brønn av en 96 brønns plate (Costar) podet med enten HT29
CD133- eller HT29
ssc-celler 72 timer etter transfeksjon. Omtrent 5 x 10
4 celler ble sådd per brønn og inkubert med staurosporin (Sigma) til en sluttkonsentrasjon på 8 uM i 24 timer. Etter denne perioden ble levedyktige og apoptotiske celler målt. For SW480 ble hver brønn av en 96-brønners plate podet med 10
5 celler av de sorterte celler og staurosporin ble tilsatt 24 timer senere ved en konsentrasjon på 8 um. Etter ytterligere 24 timer ble antall levedyktige celler /apoptotiske legemer vurdert. Analysen ble utført i triplikat og gjentatt i det minste to uavhengige eksperimenter.
to-dimensjonal (2D) og 3 (3D) dimensjonal kolonidannende analyse
Muligheten av isolerte enkelt CD133 + og CD133- celler til å danne kolonier ble testet i både to-dimensjonal (2D) kultur og 3-dimensjonal (3D) kultur. For 2D kultur, ble 300 ferskt sorterte cellene sådd ut i individuelle brønner i en 6 brønners plate og dyrket i 14 dager. Cellene ble deretter farget med metylenblått og kolonier som inneholdt mer enn 20 celler ble tellet. Eksperimentene ble utført i triplikat og ved to anledninger.
3D-kultur ble utført for å vurdere evnen colonogenic av de sorterte populasjonene i ikke-adherente betingelser. Celler (2500 fra hver populasjon CD133 + og CD133-celler) ble tellet og resuspendert som enkeltceller i 0,7% DNA grade agarose (Sigma Aldrich) .Dette ble lagt oppå en base av 1% DNA grade agar (Sigma Aldrich) og både topp og baselag ble blandet med 2x DMEM. Forsøk ble satt opp i triplikat og mediet forandret to ganger i uken. Etter to uker ble antall kolonier som utviklet seg i løpet av hver brønn tellet og visualisert under et mikroskop etter farging med 0,05% krystallfiolett i 1 time og representative felt ble fotografert. For både 3D og 2D kultur, ble prosent kolonidannende effektivitet (CFE) beregnet som følger,% CFE = (Antall oppnådde kolonier /Antall dyrkede celler) X 100 [23]. Logg transformerte verdier ble deretter brukt for statistisk analyse.
In vitro
migrasjon analysen
Transwell celle migrasjon analysene ble utført ved hjelp av en Boyden kammer som inneholder en polykarbonat filter med en 8 mikrometer porestørrelse (Costar). Kulturmedium (600 ul) supplert med 20% FBS ble tilsatt til det nedre kammer og 2,5 x 10
5 celler av de sorterte populasjonene ble tilsatt inn i det øvre kammer (i 100 ul kulturmedium supplementert med 10% FBS). Antallet celler som migrerer gjennom membranen ble manuelt tellet etter 24 timer. Analyser ble utført in triplo, og ved to forskjellige anledninger. Cellemigrering ble også målt ved anvendelse av en celle såret analysen ble utført i 6-brønners plater (Costar). Celler ble dyrket til konfluens og deretter sultet i 24 timer i serumfritt medium. En steril 200 ul pipettespiss ble brukt til å lage tre separate parallelle sår og migrering av cellene over såret linjen ble vurdert etter 24 timer. Fotografier ble tatt ved hjelp av et CCD (CCD) kamera (Canon, Japan) som er festet til den omvendte fasekontrastmikroskop med en effekt av X40. Avstanden mellom kantene ble målt ved 6 likt fordelte punkter ved hjelp av ImageJ programvare [33], og deretter analysert ved hjelp av en to-halet t-test. Forsøkene ble gjentatt på to forskjellige anledninger.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble gjennomført ved hjelp av SPSS 13.0 Software. Alle evalueringer ble gjort ved hjelp av uparet to tailed t-test. For studier med celle- og kolonitelling, ble celle tall analysert. For studier med et numerisk fluorescens utgang, ble rå fluorescens verdier brukes.
Resultater
CD133 uttrykke populasjoner i cellelinjer
Størrelsen på CD133 + befolkningen ble testet i åtte CRC-cellelinjer ved flowcytometri, og i hvert tilfelle omtrent 500 000 celler ble analysert. I to cellelinjer (DLD1 og SW837), CD133 + -celler var ikke detekterbare. Størrelsen av CD133 + populasjonen ble funnet å være mer enn 95% i to cellelinjer (Caco2 og HT29). I de resterende cellelinjer, en bimodal populasjon var til stede med en CD133 + populasjonen som strekker seg 32-64% (figur 1).
Åtte CRC-cellelinjer ble testet og viste varierende størrelse av populasjonen av CD133 + -celler. (A) Prøve flowcytometri-bilder er vist for Caco2 (venstre paneler, mer enn 95% positive celler) og SW837 (høyre panel). Analysen ble utført ved å bruke AC133 /1-antistoff (øvre panel) og gating ble utført for hver cellelinje ved hjelp av en isotypekontroll (nedre panel), PMTLin 1 er photmultiplier rør lineær en som indikerer side scatter) (b) viser at i to cellelinjer det var ingen CD133 + celler identifisert mens i to cellelinjer nesten alle celler var CD133 +. De resterende cellelinjer hadde varierende størrelse populasjon av CD133 + celler.
Splice varianter av CD133 i CRC cellelinjer og normal slimhinne
Uttrykk for de to hovedspleisevarianter av CD133 (AC133- 1 og AC133-2) ble testet ved hjelp av RT-PCR i begge cellelinjer og prøver av normal slimhinne. Bare ett produkt ble sett på agarosegeler som ved sekvensering, ble funnet å være kortere AC133-2 spleisevariant for ekson 4 er spleiset ut (figur 2a og 2c). Imidlertid kortere PCR-produktene gjennomgår preferensiell forsterkning, og det er mulig at større produkter kan bli savnet av både agarose gelelektroforese og sekvensering (særlig dersom de er tilstede i små mengder). Analysen ble videreutviklet ved å utføre PCR hjelp SYBR grønn som reporter fargestoff. Evaluering av dissosiasjonskurve viste tilstedeværelse av et enkelt PCR-produkt bare (figur 2b).
Cellelinjer og normale slimhinneprøver ble testet for ekspresjon av de to hoved CD133 spleisevarianter av RT-PCR med primere forankret på hver side av spleiset ut ekson (exon 4). Eksempeldata blir vist som viser kun et enkelt produkt ble identifisert ved PCR-produktene ble analysert på begge (a) agarosegel og (b) den mer følsomme Q-PCR-teknikken ved bruk av SYBR grønn som en reporter. M = størrelsesmarkør, nc = negativ kontroll, * representerer DLD1. (C) Sekvensering av produktene viste at exon 4 ble spleiset ut av den kodende sekvens således bare kortere spleisevariant (AC133-2) ble uttrykt. Sekvensen over elektroferogrammet er av AC133-1 med ekson 4 vist mellom linjene.
knockdown av CD133
HT29 har et høyt nivå av CD133 uttrykk. -Celler ble transfektert med enten CD133 spesifikk eller kryptert kontroll siRNA og ble testet 72 timer etter transfeksjon. Western blot viste at proteinet var praktisk talt umulig å oppdage i de når CD133 spesifikk siRNA ble anvendt. I motsetning til transfeksjon av styre siRNA har ingen effekt på protein uttrykket (figur 3).
HT29-celler ble transfektert med enten CD133 spesifikk siRNA (HT29
CD133-) eller kryptert kontroll ((HT29
SSC). Western blotting bekreftet tapet av CD133 uttrykk av genet knockdown. p-Actin viser lik protein lasting.
Association of CD133 uttrykk med celleproliferasjon
Vi har sammenlignet spredning frekvens mellom celler med høy og lav CD133 nivåer ved hjelp av to eksperimentelle tilnærminger. i HT29 den CD133 protein ble slått ned og celle tall overvåket i 5 dager (figur 4a) mens SW480 ble sortert i CD133 + /CD133- populasjoner og celletall ble overvåket over 9 dager (figur 4b). Begge forsøk viste de samme resultater, dvs. det var ingen signifikant forskjell mellom celler med høy eller lav CD133 uttrykk. Tilsvarende tellinger av flytende apoptotiske legemer i løpet av denne periode viste ingen forskjell (data ikke vist).
Celleproliferering ble evaluert etter knockdown av CD133 i HT29 (figur 4a) og sortering av SW480 til rene CD133 + og CD133- populasjoner (figur 4b). En gang kurs analysen ble utført over flere dager med ingen sammenheng sett mellom CD133 og celle tall.
Association of CD133 uttrykk med staurosporin indusert apoptose og kolonidannelse
En funksjon som kan være ventet på stamceller er motstand mot apoptose følgende eksogene stress. Både eksperimentelle metoder ble anvendt for å teste effekten av CD133 nivåer på resistens mot apoptose når de utsettes for staurosporin i 24 timer. Overensstemmende resultater ble erholdt som indikerer at høye nivåer av CD133 dratt staurosporin motstand. Færre levedyktige HT29
CD133- celler var tilstede enn HT29
ssc celler (figur 5a, p = 0,01); omvendt større antall levedyktige celler var tilstede i den sorterte CD133 + populasjonen enn den CD133- populasjonen (fig. 5b, p = 0,008). Det var imidlertid ingen forskjell mellom cellene når eksponert for DMSO alene.
CD133 ga motstand mot staurosporin indusert apoptose. Figur 5a viser at etter eksponering for staurosporin var det færre levedyktige celler etter transfeksjon med CD133 spesifikk siRNA (HT29
CD133-) enn med egge kontroll (HT29
ssc) (p = 0,01). Det var ingen forskjell mellom celler etter eksponering for DMSO. Figur 5b viser at CD133 + populasjonen av SW480 viste celler viste signifikant større motstand enn den CD133- populasjonen (p = 0,008). Figur 5c og 5d viser CD133 + celler var signifikant mer klonogene enn CD133- celler (p 0,003, 0,0001 og p 0,0001, og P 0,003). I 2D og 3D kultur henholdsvis (figur 5c og 5d)
Association of CD133 uttrykk med cellemigrering
Sammenlignende analyse av cellebevegelighet mellom celler med høy og lav CD133-ekspresjon ble undersøkt ved Transwell migrasjons analyser. Både eksperimentelle forhold produsert samstemmige resultater. Betydelig færre HT29
CD133- celler migrert over membranen enn HT29
ssc celler (figur 6a, p = 0,04). Omvendt, betydelig større antall CD133 + celler migrert enn CD133- celler (Figur 6b, p = 0,03). En celle såret analyse ble også benyttet følgende gen knockdown som viste at sårkantene var betydelig nærmere i HT29
SSC-celler enn i HT29
CD133- celler (p 0,001) bekrefter derved forholdet mellom høy CD133 ekspresjon og økt cellemotilitet (figur 6c).
Transwell migrasjon ble målt etter knockdown av CD133 i HT29 og sortering av SW480 inn CD133 +/- populasjoner. Betydelig færre HT29
CD133- celler migrert over membranen enn HT29
ssc celler (figur 6a, p = 0,04). Omvendt større antall sorterte CD133 + celler migrert enn CD133- celler (Figur 6b, p = 0,03). En såret analysen ble også foretatt og genet knockdown var forbundet med markert forsinket lukking av såret som var visiually merkbar etter bare 24 timer (figur 6c) og statistisk signifikant (p 0,001).
Plastisitet av CD133 ekspresjon i cellelinjer
SW480-cellelinjen ble sortert i CD133 + og CD133- populasjoner som ble opprettholdt i standard vevskultur betingelser og gjennomgikk regelmessig analyse ved strømningscytometri. Umiddelbar re-analyse viste at CD133 + og CD133- populasjoner var henholdsvis 97,6% og 99,9% rent (figur 7a). Kvantitativ PCR viste transcriptional undertrykkelse av CD133 i CD133- befolkningen, og selv om CD133 mRNA var fremdeles synlig, det var bare på 15% av nivået sett i CD133 + befolkningen (figur 8).
SW480 ble sortert i CD133 positive og negative populasjoner som deretter ble dyrket separat. (A) gating ble satt slik at bare de ekstreme populasjoner ble samlet som på umiddelbar retesting, viste seg å være svært rene populasjoner. (B) Etter lengre tids kultur, både av de sorterte populasjonene ble bifasisk. Forholdene på CD133 + og CD133- celler ble stabil etter tre uker og ikke endre seg etter at (selv om de ikke var det samme som den originale foreldrecellelinje).
Q-RT-PCR-analyse av de sorterte populasjonene viste at det var transcriptional undertrykkelse av
CD133
i CD133- befolkningen (selv lave nivåer av mRNA var fortsatt påvises).
Langvarig kultur resulterte i begge populasjoner rever til en bimodal profil. Den CD133 + populasjonen, etter 3 uker, besto av 70% CD133 + celler og 30% CD133- celler, frekvenser som forble stabil deretter i minst 3 måneder. Funnene stride mot publiserte rapporter som rene populasjoner av CD133 + celler gå tilbake til normal forholdet mellom CD133 +/- populasjoner [8]. De CD133- celler utviklet en befolkning på CD133 + celler som, etter 3 uker, nådde 17%, men økte ikke etterpå (figur 7b).
Diskusjoner
Den CD133 + befolkningen er variabel i CRC celle linjer
vist et stort antall celler fra åtte veletablerte CRC-cellelinjer ved strømningscytometri for å kvantifisere størrelsen av CD133 + populasjonen. Vi har funnet at, i to cellelinjer (DLD1 og SW837) var det ingen detekterbare CD133 + -celler, i to cellelinjer (Caco2 og HT29) den CD133 + populasjonen var mer enn 95% av de totale tumorcellene, mens de gjenværende cellelinjene hadde populasjonsstørrelse som strekker seg fra 32% -64%. Våre data er i overensstemmelse med studier av letaet al. og Dalerba et al. [18], [24] som rapporterte tilsvarende nivåer av CD133 uttrykk i cellelinjene HT29, Løvø og ingen uttrykk i DLD1. Våre data er imidlertid stor uoverensstemmelse med de av O’Brien og Ricci-Vitiani [8], [9], selv om årsaken til dette avviket er ukjent. En mulighet er at våre studier benyttet etablerte cellelinjer, mens de andre studier benyttet nye cellelinjer avledet i egne laboratorier. Det er mulig at langvarig kultur kan føre vedlikeholdt endringer i CD133 regulering selv om dette i seg selv skulle tilsi at CD133 uttrykk er ikke en veldig god markør for cscs. Forskjeller i teknikken kan gi en annen forklaring selv om vi brukte de samme antistoffene som O’Brien og Ricci-Vitiani og vi holdt inkubasjonstider med det primære antistoffet ned til 15 minutter. Uansett har våre data utvetydig vist at i 4/8 cellelinjer, er det CD133 + populasjonen enten fraværende eller består av nesten hele tumorcellepopulasjon. Disse dataene sammen med andre data som presenteres nedenfor, får oss til å konkludere med at CD133 er trolig ikke en spesifikk markør av stamceller i CRC.
Bare CD133 spleisevariant AC133-2 er uttrykt i tarmvevet
Selv om en rekke forskjellige spleisevarianter som er beskrevet for CD133, bare en (betegnet AC133-1 og som var den første som skal klones) er avsatt en referansesekvens nummer. Dette inneholder den full lengde kodende sekvens mens en andre spleisevariant (AC133-2, den andre for å bli klonet) ser ut til å spleise ut exon 4. Analysen av 8 CRC-cellelinjer og 10 prøver av normal slimhinne, ved anvendelse av både endepunktet og sanntids metoder, kun identifisert variant AC133-2. Dette ville være i samsvar med den studie av Yu et al. [25] der AC133-2 ble rapportert som skjøten variant som er til stede i mange stamcelle avdelinger mens AC133-1 er begrenset til fosterets hjerne og skjelettmuskulatur.
CD133 uttrykk er forbundet med noen av funksjonene i stamcelle-fenotypen
for å evaluere funksjonen av CD133, ble cellelinjen HT29 testet etter knockdown av CD133 ved RNA-interferens. Denne fremgangsmåten kan også produsere «off-target» effekter og så en komplementær tilnærmingen ble anvendt for å separere SW480-en cellelinje med et CD133 + befolkning på 40% – til rene CD133 + og CD133- populasjoner. Begge typer forsøk ga lignende resultater. For det første, nivåer av CD133 så ikke ut til å endre celleproliferasjon eller apoptose. Det var imidlertid store forskjeller i de funksjoner som kan betraktes som en del av stamcelle fenotype. Således høye nivåer av CD133 var assosiert med øket clonogenicity og motstand mot staurosporin indusert apoptose. Sistnevnte kan skyldes en iboende resistens mot apoptose (muligens mediert av slik rapportert assosiasjoner som mellom CD133 ekspresjon og anti-apoptotiske gener som flip (kaspase 8-inhibitor) og Bcl-2 [26]. Alternativt kan det skyldes forbedrede cellebeskyttende strategier for eksempel muligheten til aktivt å ekstrudere giftige stoffer fra cytoplasma [3].
en annen funksjon vi har funnet å være assosiert med CD133-ekspresjon ble forbedret celle motilitet. Andre studier har foreslått en rolle for CD133 i cellen motilitet siden det er klassisk uttrykt i membran utstikkere [27], [28]. i visse situasjoner, for eksempel embryogenese og sårheling, stamceller må skaffe funksjoner i motilitet. i cscs, kan funksjonene til økt bevegelighet tillater invasjon og metastasering til skje-en forestilling som støttes av studier av Rappa et al som fant CD133 uttrykk var assosiert med metastaser i melanomceller [29]. Våre data gjør imidlertid motsi de av Horst et al. [30] som ikke fant at CD133 uttrykk var assosiert med cellemotilitet i Caco2.
