Abstract
Bakgrunn
Kvantifisering av sirkulerende tumorceller (CTC) er verdifullt for evaluering av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Sensitiviteten av dagens metoder begrenser deres bruk for å oppdage sjeldne CTCs i tidlig stadium. Her vurderer vi en ny metode, ligand-målrettet polymerase chain reaction (LT-PCR), som kan oppdage sjeldne CTCs i NSCLC.
Metoder
CTCs ble beriket av immunomagnetisk uttømming av leukocytter og deretter merket ved et konjugat av en tumor-spesifikk ligand og et oligonukleotid. Etter vasking av frie konjugater, ble de bundne konjugater strippet fra CTCs og deretter analysert ved qPCR. For å evaluere den kliniske nytte ble blodprøver innhentet fra 72 NSCLC pasienter (33 opprinnelig diagnostisert og 39 på kjemoterapi), 20 godartede pasienter og 24 friske givere.
Resultater
Eksperimenter med sunn blod spiked med tumorceller som antydet LT-PCR tillater spesifikk påvisning av CTC. Den kliniske studien viste at de i utgangspunktet diagnostiserte pasienter har i gjennomsnitt 20,8 CTC enheter med metastatisk sykdom, 11,8 CTC enheter med lokaliserte sykdommer, og 6,0 CTC enheter med godartede sykdommer. Med terskel på 8,5 CTC enheter, kan analysen påvise 80% av stadium I /II, 67% av fase III, og 93% av stadium IV kreft. Med godartet pasienter og friske donorer som kontrollgruppe, kan metoden påvise kreft med en sensitivitet på 81,8% og en spesifisitet på 93,2%.
Konklusjon
LT-PCR vil det mulig å kvantifisere CTC i NSCLC pasienter på et mer følsomt nivå, noe som gir en potensiell verktøy for stratifisering maligne lungesykdommer, spesielt på tidlig stadium
Citation. Lou J, Ben S, Yang G, Liang X, Wang X, Ni S , et al. (2013) Kvantifisering av sjeldne Sirkulasjonstumorceller i ikke-småcellet lungekreft etter ligand-Målrettet PCR. PLoS ONE 8 (12): e80458. doi: 10,1371 /journal.pone.0080458
Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center i Dallas, USA
mottatt: 17 juli 2013; Godkjent: 02.10.2013; Publisert: 06.12.2013
Copyright: © 2013 Lou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Key prosjekt Shanghai Science and Technology Commission (Grand No: 10411950600). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne hevder at Dr.Guohua Yang er ansatt hos Genosaber Biotech. Samtidig holder han mindre aksjeopsjoner (mindre enn 5%). I løpet av forskning, Dr. Yang gir bare teknisk støtte til oss for å fullføre den kliniske forskningen. Denne tekniske støtten inkluderer dataanalyse og teknisk beskrivelse av metoden i manuskriptet. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
introduksjon til
Sirkulasjonstumorceller (CTC), kjent som «flytende biopsi», er et lett tilgjengelig markør for overvåking kreft progresjon, respons på behandling og tilbakefall av ondartede sykdommer. Spesielt blir CTC enda viktigere når vevsbiopsi er ikke egnet for visse pasientpopulasjonen. Klinisk betydning av CTC i NSCLC har vært mye rapportert i nyere studier. Høyt antall oppdaget CTC ble rapportert å assosiere med dårlig prognose i metastatisk lungekreft [1] – [5]. Påvisning av visse mRNA eller multi-genet i CTC kan anvendes for prognose av utfallet av debulking kirurgi og radioterapi i NSCLC [6] – [10]. Mer nylig har molekylær karakterisering av CTC i NCSLC vist seg å potensielt lede terapi [1], [11]
For å gå videre CTC deteksjon til neste nivå, er det dukket opp en rekke lovende teknologier for CTC berikelse. 1) CTC var positivt, immunomagnetically fanges opp av anti-EpCAM (epitelial celleadhesjonsmolekyl) antistoff-belagte magnetiske kuler [7], [12], 2) CTC ble anriket ved immunomagnetisk uttømming av leukocytter med anti-CD45 antistoff-belagte magnetiske kuler [5], [1. 3]. 3) CTC ble beriket av størrelse basert filtrering enheter [14], 4) CTC ble beriket av en chip-basert enhet med signatur mikro [15], og 5) CTC ble beriket av samtidig uttømming av erytrocytter og leukocytter ved hjelp densitetsgradientsentrifugering [16], [17]. For etterfølgende, kvantitativ analyse av CTC ble den anrikede fraksjon ved hjelp av de foran nevnte fremgangsmåter immunofluorescently merket og deretter undersøkt mikroskopisk eller ved flowcytometri [12], [18] – [21]. Selv om immunfluorescens baserte metoder oppviste høy spesifisitet, kan følsomheten ikke være tilstrekkelig til å oppdage sjeldne celler på et tidlig stadium av kreft [4], [12], [22]. Revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) ble også brukt for å CTC telling med høy følsomhet [8], [23], [24]. Imidlertid post-transkripsjonell regulering som deregulates gen-ekspresjon ble funnet i en rekke kreftceller [25] – [27]. Denne forskriften endrer genuttrykket gjennom modifikasjoner av mRNA stabilitet og /eller transkripsjonen effektivitet, og gjør proteininnhold ikke korrelerer med mRNA nivå. LT-PCR, utviklet av GenoSaber Biotech, viste lovende i å oppdage CTC gjennom overflateproteiner. Her skal vi evaluere evnen til LT-PCR for å undersøke CTC i NSCLC pasienter. I denne fremgangsmåten, ble CTC merket med et konjugat av en tumor-spesifikk ligand folsyre, selektivt bundet til ikke-småcellet lungekreft celler overuttrykkende folat reseptor [28] – [31], og en syntetisert oligonukleotid (Figur 1) . Konjugatet tjener som en adapter molekyl for å konvertere et CTC til detektormolekylene «oligonukleotider» som kan bli amplifisert for kvantitativ analyse. Denne studien er foreslått å evaluere klinisk verdi detektere folat reseptor positiv CTC i NSCLC.
Etter å ha negative anriking av immunomagnetisk uttømming av leukocytter, CTCs ble merket med et konjugat av en tumor-spesifikke ligand og et oligonukleotid. De merkede CTCs ble vasket grundig for å fjerne frie konjugater. Da de bundne konjugater ble strippet fra CTC og analysert av qPCR.
Materialer og metoder
Reagensene
CytoploRare® sirkulerende lungekreft celle kit ble levert av GenoSaber Biotech Co Ltd (Shanghai, Kina). Settet består av to komponenter: en er for CTC anriking og den andre er for CTC påvisning og kvantifisering. Anrikningen komponenten omfatter røde cellelyseringsbuffer, inkuberingsbuffer, anti-CD45 leukocytt uttømming magnetiske kuler, vaskebuffer, merking buffer, stripping buffer og nøytralisering buffer. Påvisning og kvantifisering komponent omfatter PCR reaksjon buffer, grunning, deionisert vann, positive og negative cellekontroller, PCR-kontroller og standarder. Primersekvensene ble oppført som følgende. RT primer, 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGTTCTAA-3 «; Forover primer, 5»-TATGATTATGAGGCATGA-3 «; Revers primer, 5»-GGTGTCGTGGAGTCG-3 «; Taqman Probe, 5»-FAM-CAGTTGAGGGTTC-MGB-3 «.
Etter produsentens instruksjoner, CTC ble beriket av lysering av erytrocytter og Immunomagnetisk uttømming av leukocytter fra 3 ml blodprøve. Det anrikede CTC ble merket med et konjugat av en tumor-spesifikk ligand folsyre og en syntetisert oligonukleotid. Etter merking ble den anrikede CTC vasket grundig for å fjerne de ubundne konjugater. Da de bundne konjugater ble spesifikt fjernet fra CTC overflate og oppsamlet for kvantitativ PCR-analyse (figur 1). Før amplifikasjon, konjugatet først glødet og utvidet på den RT primer. Etter at den utvidede konjugat ble forsterket og analysert ved hjelp av en Taqman probe basert kvantitativ PCR-metoden. I ovennevnte metode, ble de sirkulerende tumorceller identifisert som folat reseptor positive celler som er merket med folat bundet oligonukleotider.
Cell linje
Vi brukte human nasopharyngeal kreft cellelinje KB, som uttrykker folat -reseptor 1 (FR) på celleoverflaten, for å evaluere gjenvinningsforhold i spiked celleanalyse. KB-celler ble dyrket i folat-manglende RPMI-1640-medium (Life Technologies) med 10% føtalt bovint serum (Life technologies) ved 37 ° C i fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2.
Pasienter
Sytti-to pasienter med NSCLC, 20 med godartede lungesykdommer, og 24 kjønns- og alderstilpassede friske donorer ble inkludert i studien. I NSCLC pasienter, ble 33 pasienter i utgangspunktet diagnosen, og 39 pasienter var på cellegift. Kreftpasient kjennetegn er til stede i tabell 1. Egenskapene til pasient kohort av godartede sykdommer er listet opp i tabell S1 i File S1. Tre milliliter perifert blod ble trukket inn antikoagulerende rør som inneholder EDTA fra fag som deltar denne studien. Alle pasient og friske frivillige inkludert i denne studien undertegnet skriftlig informert samtykke før donere blod. Denne studien ble godkjent av Hospital Ethics Committee of Shanghai Chest Hospital og etikkomiteen av Affiliated Hospital of Nantong University.
Prøvepreparering
For å forberede blodprøver for PCR-analyse, CTCs var beriket av lysering av erytrocytter og påfølgende reduksjon av leukocytter henviser til produsentens protokoll. I korthet, den antikoagulerende fullblodprøver ble først lysert ved rød cellelyseringsbuffer (v:v, 01:04) i 15 minutter på is. Cellene ble deretter behandlet med 200 ul anti-CD45-belagte magnetiske kuler i 30 minutter for å utarme leukocytter. Etter dette ble CTC inkubert med 10 ul merking buffer (folat-bundet oligonukleotid) i 40 minutter ved romtemperatur. Cellene ble deretter vasket 3 ganger med 1 ml vaskebuffer ved 500 g. Til slutt, ble cellene behandlet med 120 ul strippebuffer for å fjerne de ligand-oligonukleotid-konjugater. Supernatanten ble samlet opp ved sentrifugering og nøytralisert med 24 ul buffer nøytralisering for ytterligere PCR-analyse.
PCR-analyse
Sanntids kvantitativ polymerase kjedereaksjon ble utført ved anvendelse av CytoploRare® sirkulerende lungekreft cellesett på ABI StepOne ™ -system (Life-teknologi). To og et halvt mikroliter av de fremstilte prøvene ble lagt inn i en 25 mL PCR reaksjon system å følge produsentens instruksjoner. PCR-reaksjonsbetingelsene var som følger: denaturering ved 95 ° C i 2 minutter, annealing ved 40 ° C i 30 s, forlengelse ved 72 ° C i 30 s, deretter avkjøling til 8 ° C i 5 minutter; 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 10 sekunder, annealing ved 35 ° C i 30 s, og forlengelse ved 72 ° C i 10 s. En serie av standarder inneholdende oligonukleotider (10
-14 til 10
-9 M, svarende til 2 til 2 x 10
5 CTC enheter /3 ml blod) brukes for CTC kvantifisering. Alle pasientprøver ble testet i duplikater med 6 standarder og 3 kvalitetskontroller. Per produsentens protokoll, skal den gjennomsnittlige intra-assay varians (den maksimale forskjellen mellom duplikater) være 0,5 terskel syklus for standarder og kvalitetskontroller, og. en terskel syklus for testede prøvene
Recovery, linearitet og kvantifiseringsgrensen studier
for å etablere en legitim system for å vurdere nøyaktighet og linearitet av denne analysen, ble blodprøver fra friske donorer samlet og delmengde inn i 3 ml prøver, som ble tilsatt 5, 10, 20 , 40, 200 og dyrkede KB-celler. Den unspiked, samlet blod fungert som en negativ kontroll (NC). To hundre tusen dyrkede KB celler fungerte som en positiv referanse (PR). De ovennevnte forsøk ble gjentatt 3 ganger. De observerte celletall ble beregnet ved ligningen nedenfor. Utvinningsgraden ble bestemt ved å dividere mengden av den observerte cellen ved mengden av piggete cellene
For å bestemme linearitet av analysen, har vi analysert observerte og piggete CTC teller på tvers av alle datapunktene ved lineær regresjon. Vi fjernet konfunderende variabel av prosent utvinning ved hjelp av den observerte verdien av den opprinnelige prøven dividert med utvannings faktorer for å finne de forventede verdier for fortynningsrekke for hver testet prøve.
Farging av anriket CTC
Tre milliliter blodprøver fra to metastatisk ikke-småcellet lungekreft pasienter ble beriket med nevnte protokoll. De anrikede CTC prøver og dyrkede KB-celler ble fiksert med metanol i 10 minutter ved -20 ° C. Da cellene ble merket med en pan-cytokeratin monoklonalt antistoff konjugert til fycoerytrin (sc-8018PE, Santa Cruz, fortynnet ved 1:100) og et fluorescerende konjugater av folsyre [19] (Wuxi AppTec, Kina, 10 nM) for en time. Deretter ble prøven vasket tre ganger med PBS, etterfulgt av monterings med 4′-6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) inneholdende monterings media (Life Technologies), og deretter underkastet bildeanalyse ved hjelp av en konfokal mikroskopi (Leica Micro, Tyskland).
kliniske evalueringer
For å evaluere den kliniske nytte, vi har gjennomført en dobbeltblind, to-senter studie på pasienter med godartede og ondartede lungesykdommer. For å vurdere forskjellen mellom testgruppene, vi brukte t-test med Welch korreksjon for ulike variasjoner med 95% konfidensintervall. For å bestemme terskelen, spesifisitet og sensitivitet for metoden, ble dataene fra pasienter med opprinnelig diagnostisert NSCLC utsettes for den mottaker som opererer karakteristikk (ROC) analyse av Prism (GraphPad programvare). Kriteriet for å finne optimal verdi cutoff i ROC-analyse er å maksimere den totale verdien av spesifisitet og sensitivitet.
Resultater
PCR kalibrering og CTC enhet
Som en ekstern kalibrerings~~POS=TRUNC kurven~~POS=HEADCOMP ble seks-standarder inneholdende en serie av konsentrasjoner av de konjugerte oligonukleotider brukt til å beregne mengden av folatreseptorer på CTCs (figur S1). Å ekstrapolere mengden av CTC fra mengden av folat reseptorer, bruker vi en vilkårlig definert enhet, heter CTC enhet. Som bestemmes av kalibreringskurven, mengde folat reseptor tall på 1 x 10
5 KB-celler er 7,5 x 10
-14 mol, som er definert som 1 x 10
5 CTC enheter. Den detekterbare området av analysen er fra 2 til 2 x 10
5 CTC enhet. For kvalitetskontroller, intra-assay koeffisient av variasjon (CV) er fra 2,6% til 3,8%, og inter-assay CV er fra 3,3% til 5,3% (tabell S2 i File S1).
Validering av den ligand-målrettede PCR-metode for kvantifisering CTC
KB celle tilsette undersøkelse viste at 80% av de tilsatte celler kan gjenvinnes ved hver konsentrasjon (5, 10, 20, 40 og 200) (figur 2A ). Den gjennomsnittlige CTC utvinning andel var 81% ved 5 piggete celler i 3 ml blod, og enda høyere i prøvene tilsatt høyere konsentrasjon av celler. Med resultatene fra spiking studien, utførte vi de minst rutene passer for sammenligning av den observerte og piggete kvantitet over alle fortynning serie (figur 2B). Regresjonsligningen var Y = 0,9455 × -0,831 med R
2 = 0,9946. Studien viste at over testet CTC konsentrasjon den gjennomsnittlige utvinnings, som stammer fra regresjonsanalyse, er 94,6%.
A) Recovery forholdet mellom piggete celleanalyse. B) Lineær regresjon kurven av piggete celleanalyse. C) Spesifisitet test av analysen. Spiked KB-celler ble behandlet med (
konkurrerte
) eller uten (
kontroll
) 10 mm folsyre før merking. D) Sunn givernes blodprøver tilsatt 20 KB celler
(20 celler)
eller uten KB tumorceller
(kontroll)
ble merket med 10 nM folat-oligonukleotid konjugat
(konjugert )
eller ukonjugert-oligonukleotid
(oligonukleotid)
etter berikelse. Data er vist med Mean ± SD fra tre uavhengige analyser.
For å vurdere intra-assay varians (unøyaktighet under kjøring), analyserte vi et utvalg av 100 KB celler i 3 ml blod i samme i triplikat følge de ovennevnte protokoll. Deretter vurderte vi inter-assay variasjon (mellom-run unøyaktighet) ved å analysere en samme prøve i tre eksemplarer i 6 separate analyser på 6 forskjellige dager. Den intra-assay CV er 11,2%, og inter-assay CV er 14,2% (tabell S3 i File S1).
For å bestemme spesifisiteten av denne metoden vi gjennomført en konkurranse studie med 10 mm folsyre som et konkurrerende ligand til folat bundet oligonukleotid. Resultatene fra eksperimentet viste at 10 mikrometer folsyre kan blokkere den konjugerte fra binding til KB celler (Figur 2C). Blokkeringen gir bevis for spesifisiteten av folat-bundet oligonukleotid bundet til folat-reseptoren i piggete KB-celler.
Det skal bemerkes at det er «bakgrunn» signaler for friske donorer blodprøver. For å undersøke opprinnelsen til «bakgrunn» signal, merket vi friske donorer blodprøver tilsatt 20 KB-celler eller uten KB-tumorceller ved hjelp av 10 nM folat-oligonukleotid-konjugat eller ukonjugert -oligonukleotid (figur 2D). Blodprøvene tilsatt uten tumorceller binder seg til folat-bundet oligonukleotid eller ukonjugerte oligonukleotider indiscriminatively, som bestemt ved qPCR. I motsetning til dette ble prøvene tilsatt tumorceller kan selvsagt merket med folat-konjugert oligonukleotid snarere enn det ukonjugerte oligonukleotid. Det resultat antydet at «bakgrunn» signaler som er forårsaket av binding av oligonukleotider til de gjenværende blodcellene i de anrikede prøver. Enda viktigere, «bakgrunn» signal forårsaket av «oligo-bindende virkning» vil ikke gå på akkord med spesifikk påvisning av sjeldne CTC som demonstrert under.
For å ytterligere evaluere spesifisitet FR uttrykk på CTC i NSCLC, tre milliliter blodprøver fra to metastatiske pasienter bærende FR positiv CTC ble beriket med nevnte protokoll. Da beriket CTC prøver og dyrkede KB celler ble løst av metanol, og merket med fluorescerende konjugater av folsyre, monoklonalt antistoff for cytokeratins og nukleær farging reagens, DAPI. Som vist i figur 3, ble KB-celler og de sirkulerende tumorceller spesifikt merket med fluorescerende folat konjugater (grønt) og cytokeratins antistoff (rød). I kontrast, kan de små leukocytter ikke merkes av fluorescerende folat konjugater og cytokeratin antistoff (Figur 3H og 3L). Videre under mikroskop observasjon, CTCs og dyrkede KB celler viste en lignende uttrykk nivå av folat reseptoren (figur 3).
KB celler (A-D) og beriket CTCs fra to metastatisk NSCLC pasienter (CTC Eksempel 1 : E-H; CTC prøve 2: i-L) ble fiksert med metanol og farget for cytokeratin (A, E og i) og folat reseptor (FR) (B, F og J). Cellekjernen ble merket med DAPI (C, G og K). De fusjonerte bildene viste cytokeratin og folat reseptoren er kun uttrykt i CTCs (H og V) og KB-celler (D), ikke i hematologiske celler.
CTC utbredelse i kliniske prøver
som vist i tabell 1, ble totalt 72 pasienter med NSCLC inkludert i studien. Som kontrollgrupper, fikk vi perifert blod fra 20 pasienter med godartet lungesykdommer og 24 friske givere.
Først vi sammenlignet CTC nivåer i kreftpasienter ved første diagnose, godartet sykdom pasienter og friske forsøkspersoner. Som vist i figur 4A, er CTC nivåene i blodet fra pasienter med lokalisert (trinn I, II og III, i gjennomsnitt 11,9 CTC enhet; område 3,8 til 25,7 CTC enhet;
p
= 0,0011), eller metastatisk (stadium IV ; bety 20,9 CTC enhet; range 6,8 til 75,0 CTC enhet;
p
= 0,0055) sykdommer er betydelig høyere enn friske frivillige (gjennomsnittlig 6,7; range 3,0 til 11,4 CTC enhet) og godartede lungesykdom pasienter (gjennomsnitts 6,0; spenner 1.6 til 8.7 CTC enhet). De metastatiske pasienter har mer CTC enn lokaliserte pasienter (
p
= 0,045). De ovenfor angitte resultater indikerer at de lokaliserte metastatiske og pasienter som har forskjellige nivåer av CTC. I en mer avansert analyse, ønsker vi å undersøke sensitiviteten av metoden mot forskjellige histologiske undergrupper av NSCLC. For de 16 adenokarsinom pasienter CTC nivåer (gjennomsnitt 18,1, range 3,8 til 75,0) ikke viser signifikant forskjell fra de 11 plateepitelkarsinom (SCC) pasienter (gjennomsnitt 12,4, range 4,3 til 20,8) og andre histologiske undergrupper (gjennomsnitt 15,1, område 10,1 til 25,7) (figur 4B). Dette resultatet foreslo uttrykk for folat reseptoren kan være lik på tvers av alle histologiske subtyper i NSCLC pasienter.
A) CTC nivåer i lokalisert og metastatisk malign lungesykdom, godartet lungesykdom og friske donorer. B) Fordeling av CTC nivåer i ulike histologiske subtyper. ADC, adenokarsinom; SCC, plateepitelkarsinom. C) Mottaker opererer karakteristikk (ROC) analyse mellom ondartet lungesykdom gruppe og godartet sykdom og sunn gruppe.
For ytterligere analyse av sensitivitet og spesifisitet av analysen for ulike patologiske stadier og histologiske subtyper i NSCLC, vi må først etablere cut-off terskel ved ROC analyse. Figur 4C viste at den avskårne terskel mellom kontrollgruppen (godartede pasienter og friske forsøkspersoner) og først diagnostiseres kreft gruppen var 8,5 CTC enhet, følsomheten er 81,8%, og spesifisiteten er 93,2%. Selvfølgelig CTCs ble påvist i blodprøver fra 82% (27 av 32) i utgangspunktet diagnostisert NSCLC pasienter, mens falske positiver i 20 godartet sykdom pasienter (5%, 1 av 20) og 24 friske frivillige var ubetydelig (8%, 2 av 24 ). Som vist i tabell 2, 80% (8 av 10) fra trinn I-II, 67% (6 av 9) trinn III, og 93% (13 av 14) fra trinn IV-pasienter ble funnet å ha mer enn 8,5 CTC enhet. I histologiske subtyper, 69% (11 av 16) av adenokarsinom pasientene var CTC positive, og 91% (10 av 11) av SCC pasientene var CTC positive.
Publiserte studier indikerte kjemoterapi kan kompromittere tilstedeværelsen av CTC i omløp [1], [4], [5]. Vi utførte en forstudie for å sammenligne CTC nummer i NSCLC pasienter ved førstegangsdiagnose og på kjemoterapi. Som vist i figur 5, 16 lokaliserte pasienter på kjemoterapi (gjennomsnittlig 5,8, range 0,7 til 11,5) har betydelig lavere CTC nivåer enn de i utgangspunktet diagnostiserte pasienter (
p
= 0,0006); mens forskjellen i CTC nivåer i metastatiske pasienter med eller uten behandling var ikke så viktig som de lokaliserte pasienter. Selv om gjennomsnitts CTC nivå med metastatisk pasienter ved førstegangsdiagnose var 20,9 CTC enhet i forhold til 13,5 CTC enhet i pasienter på kjemoterapi, gjorde t-test ikke bekrefte at forskjellen var signifikant på
p
verdi på 0,05 . Den statistiske analysen antydet at de lokaliserte NSCLC pasienter kan ha bedre prognose i forhold til de metastatiske pasienter når satt på cellegift
w /o chemo
, opprinnelig diagnostisert NSCLC pasienter.;
med cellegift
, NSCLC pasienter på kjemoterapi.
Diskusjoner
Vi har evaluert LT-PCR teknikk for å kvantifisere CTC i perifere blodprøver fra NSCLC pasienter. Teknologien er basert på negativ uttømming av leukocytter fulgt av merking av CTC med folat bundet oligonukleotid og påfølgende kvantifisering med qPCR. Studier med friske blodprøver tilsatt tumorceller viser at analysen er spesifikk, kvantitativ og lineært fra en rekke 5-200 celler pr 3 ml blod ble analysert. Evaluering av pasientblodprøver viser at metoden er følsom nok til å stratifisere pasienter med forskjellige sykdomsstatus (godartet, lokalisert og metastatisk).
Potensielle fordeler ved LT-PCR til onkologi kan omfatte 1) ikke-invasiv vurdering av tumorbyrden i perifert blod, 2) ultraanalyse som muliggjør avansert lagdeling av lungesykdommer, 3) så lavt som 3 ml samplingsvolum som ikke ville forverre pasientens anemi forårsaket av cytotoksiske bivirkninger, 4) i sanntid langsgående overvåking av sykdomsstatus og effekten av behandlingen, og 5) standardisert plattform som eliminerer kunstig analyse bias.
De fleste
in vitro
diagnostiske blodprøver for NSCLC kreft lider av potensielle falske negative og /eller positive resultater. Bruken av anti-EpCAM belagt magnetiske kuler ble forsøkt for anriking av CTC i NSCLC blodprøver. Imidlertid kliniske studier viste at lave følsomheten av EpCAM basert anrikning i CTC deteksjon for NSCLC [12], [22]. Publiserte studier indikerte også at ikke-EpCAM uttrykke celle kan omfatte flertallet av CTC i NSCLC perifert blod, og dermed EpCAM basert berikelse kan mislykkes i å oppdage sjeldne CTC [22]. Vi oppdaget folat reseptoren uttrykk i EpCAM positive og negative CTCs i NSCLC pasienter. Anti-EpCAM belagte magnetiske kuler som ble anvendt for å separere EpCAM-positive og EpCAM-negativ fraksjon av CTCs. Vi fant FR positive CTC tallet var mye høyere i EpCAM-negative andel enn i EpCAM-positive brøkdel i alle tre NSCLC pasienter (Figur S2). Resultatene indikerte at EpCAM basert fangsten kan gå glipp stor andel av CTCs i lungekreft. Carcinoembryonic antigen (CEA), et glykoprotein involvert i lungekreft utvikling, er også funnet på normale eller godartede syke celler utgitt i sirkulasjon [32]. Anvendeligheten av CYFRA21-1, som er en cytokeratin 19 fragmenter utgitt i blodet, har blitt undersøkt i studier i diagnostisering av NSCLC [33] – [35]. Selv om CYFRA21-1 kan være den mest sensitive tumor markør i avansert NSCLC, er fortsatt lav for tidlig fase sykdom følsomheten av CYFRA21-1 [33], [35].
Publiserte data fra vevsbiopsi har vist 72% -83% lungekreft over-uttrykke FR på celleoverflaten [28] – [31]. Nylige rapporter viste FR positive CTC ble funnet i eggstokkreft [19]. Så langt har ingen studier blitt rapportert for utbredelsen av FR positiv CTC i NSCLC. I denne studien har vi undersøkt klinisk verdi av folat reseptor positiv CTC i NSCLC. Resultatene er angitt i FR er en potensiell overflatemarkør for å identifisere CTC av NSCLC, selv i tidlig stadium. Nyere studier viser at, i primær tumormasse, er mye lavere i SCC enn i adenokarsinom i metastatisk kreft [29] FR uttrykk. Men vi fant FR uttrykk i CTCs er lik på tvers av alle histologiske undergrupper. Dette motstridende funn kan forklares med forskjellig fordeling av patologiske trinn for individuelle histologiske subtyper. Iwakiri
et al.
Rapportert at nedre uttrykk for folat reseptoren ble funnet i avansert stadium sammenlignet med tidlig stadium i NSCLC [36]. I de pasienter som deltok i vår studie, 48% har adenokarsinomer (stadium IV, 44%), 33% har plateepitelkarsinom (stadium IV, 27%) og 18% har uspesifisert lungekreft. Den nedre FR positivitet i adenokarsinomer i vår studie kan forklares med den høye andelen av sent stadium pasienter inkludert i forhold til SCC gruppe. I tillegg eksisterer det en annen mulighet for at CTC kan uttrykke FR forskjellig fra primærtumormasser. Forrige litteratur indikert differensial genuttrykk mellom primærtumor og CTC prøven [37]. En storstilt, vil godt designet klinisk studie være nødvendig for å løse de ovennevnte bekymring.
Selv om folat reseptoren har blitt identifisert i normalt vev, inkludert nyre, milt og lunge etc [28]. Det er imidlertid ingen celler som uttrykker folatreseptorer i sirkulasjons-systemet, bortsett fra CTCs eller aktiverte monocytter [19], [38]. Foreløpige studier har funnet at denne undergruppe aktiverte monocytter er knapt synlig i blodprøver fra friske donorer eller godartede pasienter [19], [39]. I 9% av tilfellene der «CTC» kan oppdages hos friske prøver, kan det finnes mulighet for illegitim uttrykk for monocytter. Men hypotesen må verifiseres i en videre studier. Folat reseptor uttrykk er også funnet i kreft aktiveres makrofager [40]. For å undersøke den makrofager effekt i dette deteksjonssystem i NSCLC, ble anti-CD14-belagte magnetiske kuler som brukes til å tømme de aktiverte makrofager i blodprøven av NSCLC [41], etter uttømming av CD45-positive leukocytter. Vi fant CTC tellinger ble knapt endret under «ekstra-CD14» behandling hos NSCLC pasienter (Figur S3). Dette resultatet antydet uttømming mekanisme ved anvendelse av anti-CD45 magnetiske kuler er tilstrekkelig til å fjerne virkningen av tumor-assosierte makrofager på CTC teller.
I denne studien, har vi funnet en lav bakgrunn «CTC» nivå i friske individer og godartede sykdom pasienter. Som vist på spesifisitet studien, kan bakgrunnssignalet er et resultat av binding av oligonukleotidet til de gjenværende blodceller. Selv om tidligere litteratur er beskrevet en rekke mekanismer for binding av oligonukleotidet til pattedyrceller [42], er det ingen konsensus for denne biologiske prosess. Men disse studiene alle viste at bindings mengden av oligonukleotid som er betydelig lavere sammenlignet med våre konjugater. Vi er sikre på at «bakgrunnen CTC» ikke vil forstyrre påvisning av den virkelige «CTC» i lungekreftpasienter.
Til slutt, fordi høyere CTC tall rapportert å assosiere med dårlig prognose i metastatisk kreft [ ,,,0],2], [4], [43], LT-PCR ville potensielt identifisere undergruppen av pasienter med dårlig prognose i tidlig fase av sykdommen og derfor bistands onkologer å foreskrive mer effektive behandlingsformer. I en mer avansert analyse, vil fenotypen CTC gir direkte bevis for onkologi for å bestemme den optimale behandlingsregime. Med riktig affinitet ligand (f.eks antistoff, peptid, små kjemiske molekyler, etc.), LT-PCR kan bli ytterligere utforsket for fenotyping sjelden CTC i en multiplex, high-throughput fashion.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
kalibreringskurve qPCR og lineality parametere
doi:. 10,1371 /journal.pone.0080458.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Folat reseptor uttrykk i EpCAM positive og negative CTCs i NSCLC pasienter. CTC prøver ble beriket fra 3 ml blod av tre FR-positive pasienter med NSCLC etter lyse av erytrocytter og Immunomagnetisk uttømming av leukocytter. Da beriket CTC prøvene ble inkubert med anti-EpCAM magnetiske kuler (Life Technologies, Cat No. 16203) for 30 min. Etter immunomagnetisk isolering i 10 minutter, ble EpCAM-positive celler fanges opp av magnetiske kuler. EpCAM-negative celler ble samlet opp fra supernatanten ved sentrifugering ved 600 g i 15 min. Etter dette ble de to fraksjoner av CTC prøven merket og detektert som den nevnte protokoll. Data er vist med Mean ± SD fra tre uavhengige qPCR analyser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0080458.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Virkningen av tumorassosierte makrofager i FR positive NSCLC pasienter. CTC prøver ble beriket fra 3 ml blod av tre FR-positive pasienter med NSCLC etter lyse av erytrocytter og Immunomagnetisk utarming av CD45-positive leukocytter. Tabell S1. Tabell S2. Tabell S3.
