Abstract
Dødsfall signale levert av tumor nekrose faktor (TNF) -relaterte apoptose-induserende ligand (TRAIL) kan indusere død i kreftceller med liten cytotoksisitet til normale celler; dette celledød har vært tenkt å involvere caspase-avhengig apoptose. Reaktive oksygenforbindelser (ROS) er også meglere som induserer celledød, men deres roller i TRAIL-indusert apoptose er ikke klarlagt fullt. I denne studien undersøkte vi ROS og caspases i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler gjennomgår to forskjellige typer TRAIL-indusert celledød, apoptose og necroptosis. TRAIL behandling økt ROS i to TRAIL-sensitive bukspyttkjertelkreft cellelinjer, MiaPaCa-2 og BxPC-3, men ROS var involvert i TRAIL-indusert apoptose bare i MiaPaCa-2 celler. Uventet, hemming av ROS ved enten
N
-acetyl-L-cystein (NAC), en peroksyd-inhibitor, eller TEMPOL, en superoksyd-inhibitor, økte annexin V- /propidiumjodid (PI)
+ tidlig nekrotiske befolkningen i TRAIL-behandlede celler. I tillegg er både necrostatin-1, en inhibitor for reseptor-veksel proteinkinase 1 (RIP1), og siRNA-mediert knockdown av RIP3 reduserte annexin V
– /PI
+ tidlig nekrotisk populasjonen etter TRAIL behandling. Videre ble en økning i tidlig apoptose induseres i TRAIL-behandlede kreftceller i henhold til inhibering av enten caspase-2 eller -9. Caspase-2 jobbet oppstrøms av caspase-9, og ingen crosstalk ble observert mellom ROS og caspase-2 /-9 i TRAIL-behandlede celler. Sammen indikerer disse resultater at ROS bidra til TRAIL-fremkalt apoptose in MiaPaCa-2-celler, og at ROS-inhiberende spille en rolle i TRAIL-fremkalt necroptosis av MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler, med caspase-2 og -9 fors regulatoriske roller i denne prosessen
Citation:. Zhang M, Harashima N, Moritani T, Huang W, Harada M (2015) rollene til ROS og Kaspaser i TRAIL apoptose og Necroptosis i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 10 (5): e0127386. doi: 10,1371 /journal.pone.0127386
Academic Redaktør: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA
mottatt: 23 januar 2015; Godkjent: 15 april 2015; Publisert: May 22, 2015
Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:.. Denne studien ble støttet delvis med tilskudd fra departementet for utdanning, vitenskap, sport, kultur og teknologi fra Japan (ingen 25.430.150 til NH, og nr. 24501331 til MH) og fra Shimane University «SUIGANN» Project. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
medlemmer av tumor nekrose faktor (TNF) cytokin familie, for eksempel TNFa og Fas ligand (Fasl), spiller viktige roller i betennelse og immunitet [1]. Selv om TNF-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) er et medlem av denne familien, kan dette molekylet indusere kreft celledød mens forårsaker nesten ingen cytotoksisitet til normale celler [2]. Det finnes positive og negative reseptorer; død reseptor (DR) 4 og DR5 gi pro-apoptotiske signalering, mens attrappen reseptor (DCR) 1 og DcR2 inhibere apoptotisk signale [3]. Normale celler er rapportert å vise TRAIL-motstand med sin fortrinnsrett ekspresjon av DCRs [4]. Derfor TRAIL og dens DR er forventet å være nyttige anti-kreft-molekyler og mål og er blitt anvendt og målrettet i flere kliniske studier [5, 6]. Binding av TRAIL til DR på kreftceller gir caspase-8-avhengige død signalering og utløser «extrinsic» apoptotiske sti [7]. Aktivering av caspase-8 forvandler Bud til tBid, og dermed fremme mitokondriene-mediert caspase-9-avhengig «intrinsic» apoptotiske sti [8]. Alternativt kan ROS (reaktive oksygenarter) også spiller en viktig rolle i celle-død og signale [9]. ROS indusere indre apoptose ved å utløse DNA-skade [10]. Omvendt, DNA-skade induserer ROS produksjon [11]. DNA-skade og /eller ROS-produksjon kan utløse caspase-9-avhengig apoptose. I tillegg har noen rapporter antydet at ROS er involvert i apoptose i TRAIL-behandlede humane kreftceller [12-14]. Men rollene til ROS i TRAIL-indusert kreft celledød er ennå ikke ferdig etterforsket.
I tillegg til apoptose, er necroptosis nå anerkjent som en annen form for programmert celledød [15, 16]. Necroptosis er programmert nekrose som kan aktiveres ved stimulering av TNFa, Fasl, eller TRAIL. Rollene og mekanismer av apoptose og nekrose har blitt godt etablert, mens de av necroptosis har vært fokus for nyere undersøkelser [16-18]. Necroptosis har fått mye oppmerksomhet som en form for celledød som induserer inflammasjon [17]. Under caspase-8-inhibering, reseptor-veksel proteinkinase 1 (RIP1) og RIP3 danne et kompleks og utløser necroptosis [19, 20]; flere nylige rapporter har avdekket at RIP3 spiller en sentral rolle i prosessen [18, 21]. Selv om noen rapporter tyder på at TRAIL kan indusere necroptosis i kreftceller [22-24], har mekanismene ikke klarlagt fullt.
Denne studien undersøkte roller ROS og caspases i TRAIL-indusert apoptose og necroptosis av menneskelig kreft i bukspyttkjertelen celler. Blant fire menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, ble ROS-nivåer forhøyet i bare to TRAIL-sensitive linjer: MiaPaCa-2 og BxPC-3. Imidlertid spilt ROS en pro-apoptotisk rolle bare i MiaPaCa-2-celler, men ikke i BxPC-3-celler. I disse eksperimentene, fant vi at TRAIL behandling under ROS hemming økte befolkningen i annexin V
– /propidiumjodid (PI)
+ tidlige nekrotiske celler i MiaPaCa-2 og BxPC-3 celler, noe som tyder på at ROS spilt en hemmende rolle for TRAIL-fremkalt necroptosis i begge cellelinjer. I tillegg necrostatin-en (en RIP1 inhibitor) reduserte annexin V
– /PI
+ befolkningen i disse TRAIL-behandlede celler, og siRNA-mediert knockdown av RIP3 viste lignende resultater i BxPC-3 celler, noe som tyder at celledød observert var forårsaket av necroptosis. Til slutt, necroptosis ble fremmet ved TRAIL behandling under inhibering av enten caspase-9 eller -2, med den sistnevnte betraktes som en «orphan» caspase hvis rolle i celle-død er ikke fullt ut klarlagt [25, 26]. Sammen utgjør disse funnene tyder på at ROS er økt i TRAIL-sensitive MiaPaCa-2 og BxPC-3 celler, men at ROS er involvert i apoptose bare i TRAIL-behandlet MiaPaCa-2 celler. Våre funn viste også at ROS og caspase-9 /-2 spille regulatoriske roller i TRAIL-indusert necroptosis av menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler.
Materialer og metoder
Cellelinjer
To menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer (ASPC-en og BxPC-3) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). To andre menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer (MiaPaCa-2 og Panc-1) ble vennlig levert av Dr. K. takenaga (Shimane universitet Det medisinske fakultet) [27]. Disse cellelinjene ble holdt i DMEM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) supplert med 10% føtalt kalveserum (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) og 20 pg /ml gentamicin (Sigma-Aldrich). Prec er en normal prostata epitel cellelinje kjøpt fra Lonza (Walkers, MD, USA) og ble opprettholdt i PrEBM (Lonza).
Celleviabilitet analysen
Celleviabilitet ble analysert ved hjelp av WST- 8 analysen (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). Ved slutten av inkubasjonsperioden, ble 10 ul WST-8-løsning tilsatt til hver brønn, og platene ble inkubert i ytterligere 3 timer. Absorbans i hver brønn ble målt ved 560 nm ved hjelp av en mikroplateleser (Beckman Coulter, Brea, CA, USA).
Reagenser
For hemming analyser, følgende hemmere ble tilsatt 1 time før tillegg av TRAIL: pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), caspase-8 inhibitor Z-IETD-FMK (R . Thermo Scientific, Rockford, IL , USA) inneholdende en protease-inhibitor cocktail (Nacalai Tesque). Like mengder protein ble løst på 4-12% stigning eller 12% SDS-PAGE-geler og overført til polyvinylidenfluorid membraner. Membranene ble blokkert og blotter inkubert med følgende primære antistoffer: anti-RIP3 (13526; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-caspase-3 (9668, Cell Signaling Technology), anti-caspase-8 ( M032-3, medisinske og biologiske Laboratories, Nagoya, Japan), anti-caspase-9 (9508, Cell Signaling Technology), anti-caspase-2 (2224; Cell Signaling Technology), anti-β-aktin (BioLegend, San Diego , CA, USA), eller anti-α-tubulin (Santa Cruz Biotechnology). Etter vasking ble romtemperatur inkubering av membraner i 30 minutter med enten geite-anti-kanin eller geit anti-mus alkalisk fosfatase-konjugert sekundært antistoff (Invitrogen) anvendes for å detektere de primære antistoffer. Proteinbånd ble visualisert ved hjelp av CDP-stjerners chemiluminescence og avbildes ved hjelp av en Imagequant LAS-4000 system (FujiFilm, Tokyo, Japan).
Transfeksjon av små interfererende RNA (siRNA)
Transfeksjon av siRNA ble utført ved hjelp Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen), i henhold til produsentens instruksjoner. RIP3 siRNA (sc-61482) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. Kontrollen siRNA (6568) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology. Tre dager etter siRNA transfeksjon, ble cellene brukt for senere eksperimenter.
Statistiske analyser
Data ble evaluert statistisk ved hjelp av uparet tosidige Student
t
-UNDERSØKELSER. En
P
verdi på mindre enn 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans.
Resultater
Produksjon av ROS i TRAIL-sensitive kreft i bukspyttkjertelen celler
først undersøkt følsomheten til fire menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer og en normal prostata epitel cellelinje PREC til TRAIL behandling. Vi valgte disse kreftcellelinjer fordi de har blitt godt karakterisert for sine mutasjoner i
K-ras
og
p53 product: [28], og fordi vi tidligere har undersøkt deres TRAIL følsomhet [29]. Som et resultat av levedyktigheten til begge MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler ble redusert i nærvær av TRAIL i en doseavhengig måte, mens de andre tre linjer (Panc-1, ASPC-1, og prec) viste ingen klar følsomhet mot TRAIL (fig 1A). Vi neste undersøkte uttrykk for TRAIL reseptorer på disse cellene (Figur 1b). Ekspresjonen av DR4 var nesten ikke påvises i alle cellelinjer. Selv DR5 uttrykk på Panc-1 og PREC var lav, alle cellelinjer var positive for DR5. I form av lokkefugl reseptorer, MiaPaCa-2 og PREC cellene var delvis positive for DcR2. Vi neste fastslått om ROS ble produsert i disse cellelinjer og fant at TRAIL behandling betydelig økt ROS-nivåer bare i MiaPaCa-2 og BxPC-3 celler (
P
0,05 for MiaPaCa-2,
P
0,01 for BxPC-3) (fig 1C og 1D). Prec celler reduserte nivået av ROS etter TRAIL behandling. Resultatene indikerte at ROS produseres kun i TRAIL-sensitive bukspyttkjertelkreft cellelinjer (MiaPaCa-2 og BxPC-3).
(A) Fire menneskelige kreft i bukspyttkjertelen linjer og PREC celler ble dyrket i nærvær av TRAIL . Etter 48 timer ble cellelevedyktigheten bestemt ved WST-8-analyse. Dataene som vises representerer gjennomsnittet av tre brønner. (B) Ekspresjon av DR4, DR5, DcR1 og DcR2 i fem cellelinjer ble undersøkt ved strømningscytometri. Linjen representerer farging med mAb spesifikk for enten DR4 eller DR5, etterfulgt av et FITC-konjugert sekundært antistoff. Solid grått representerer farging med FITC-konjugert anti-mus-IgG alene. Når det gjelder ekspresjon av DcR1 og DcR2, representerer den linje farging med mAb spesifikk for DcR1 og DcR2; faste grå representerer farging med isotype-matchet FITC-konjugert anti-mus IgG. (C) fem cellelinjer ble dyrket med TRAIL (50 ng /ml). Etter 6 timer for MiaPaCa-2 og 12 timer for de fire andre linjer, disse cellene ble dyrket med karboksy-H
2DCFDA (50 uM) i 30 minutter og undersøkt for deres ROS-nivåer ved strømningscytometri. Tallet representerer den midlere fluorescensintensitet. (D) De data som er vist representerer gjennomsnittet av tre brønner. MFI: gjennomsnittlig fluorescensintensitet. *
P
0,05, **
P
. kun 0,01, NS, ikke signifikant
Hemming av ROS redusert TRAIL-indusert apoptose i MiaPaCa -2 celler
Vi neste undersøkte effekten av to ROS-hemmere, NAC og TEMPOL [30], på TRAIL-indusert apoptose av TRAIL-sensitive MiaPaCa-2 og BxPC-3 celler. TRAIL økt betydelig de prosenter av annexin V
+ celler hos begge cellelinjene (
P
0,01). Tillegg av NAC, en peroxide inhibitor, betydelig redusert andelen annexin V
+ TRAIL-behandlet MiaPaCa-2 celler (
P
0,05), men ikke klart å redusere apoptose i TRAIL-behandlet BxPC- 3-celler (figur 2A og 2B). Alternativt kan tilsetningen av TEMPOL, en superoksyd-inhibitor, hadde ingen virkning på TRAIL-fremkalt apoptose av MiaPaCa-2-celler, men økte den i TRAIL-behandlede BxPC-3-celler (
P
0,01) (Fig 2C og 2D). Disse resultater indikerer at ROS, peroksyd og superoksid, utøver motsatte effekter på de to TRAIL-sensitive cellelinjer; peroxide spiller en pro-apoptotiske rolle i TRAIL-behandlet MiaPaCa-2 celler, men superoksid er anti-apoptotisk i Trail-behandlet BxPC-3 celler.
(A) MiaPaCa-2 og BxPC-3 celler ble dyrket med TRAIL (50 ng /ml) med eller uten NAC (10 mM) i 24 timer. Etter farging med annexin V-FITC /PI, flowcytometrisk analyse ble utført. Tallene representerer andelene av hvert delsett. (B) Prosentandelene av annexin V
+ celler er vist. (C) Begge cellelinjer ble dyrket med TRAIL (50 ng /ml) med eller uten TEMPOL (1 mM) i 24 timer og analysert ved hjelp av strømningscytometri. (D) Prosent annexin V
+ celler er vist. Alle datapunktene er vist representerer gjennomsnittet av tre kulturbrønnene. *
P
0,05, **
P
0,01, NS, ikke signifikant
RIP1- og RIP3 avhengig necroptosis i TRAIL behandlet. kreft i bukspyttkjertelen celler under ROS hemming
Under undersøkelse av virkningene av ROS hemming på TRAIL-indusert apoptose av MiaPaCa-2 og BxPC-3 celler, fant vi at prosentandelen av annexin V
– /PI
+ tidlige nekrotiske celler ble økt med TRAIL behandling under ROS hemming (fig 2A og 2C). Resultatene av annexin V
– /PI
+ tidlige nekrotiske celler beregnes og presenteres i figur 3A. Tillegg av NAC økte prosenter av annexin V
betydelig – /PI
+ TRAIL-behandlede celler (
P
0,01 for MiaPaCa-2,
P
0,05 for BxPC-3). Et lignende resultat ble observert når TEMPOL ble tilsatt i TRAIL-behandlede BxPC-3-celler (
P
0,01 for BxPC-3), men ikke i MiaPaCa-2-celler. Siden annexin V
– /PI
+ -celler representere begynnelsen av nekrotiske celler, tyder disse resultatene på at TRAIL indusert programmert nekrose (necroptosis) under ROS inhibering, spesielt peroksyd-inhibering. Vi neste spørsmål om tilsetning av necrostatin-1, en inhibitor av RIP1 og nekrose av [31], kunne redusere disse tidlige nekrotiske celler. Som vist i figur 3B og 3C, kombinasjonen av TRAIL og NAC betydelig økt andelen av annexin V
– /PI
+ MiaPaCa-2 og BxPC-3 celler (
P
0,01 for MiaPaCa-2 og BxPC-3), mens tilsetningen av necrostatin-en signifikant redusert dem (
P
0,01 for MiaPaCa-2,
P
0,05 for BxPC-3- )
(A) de prosenter av annexin V
-. /PI
+ celler ble beregnet basert på resultatene av figur 2. (B) Begge cellelinjer ble dyrket med TRAIL (50 ng /mL) og NAC (10 mM), med eller uten necrostatin-1 (20 pM) i 24 timer. Etter farging med annexin V-FITC /PI, flowcytometrisk analyse ble utført. Tallene representerer andelene av hvert delsett. (C) Prosentandelene av annexin V
– /PI
+ celler ble beregnet. Alle datapunktene er vist representerer gjennomsnittet av tre kulturbrønnene. *
P
0,05, **
P
. 0,01
RIP1 og RIP3 er kritiske molekyler for necroptosis [18-21]. Derfor undersøkte vi uttrykket av RIP1 og RIP3 i fire bukspyttkjertelkreft cellelinjer og funnet ut at alle var positive for RIP1, mens MiaPaCa-2 og Panc-1 var negative for RIP3 (fig 4A). Vi undersøkte videre effekten av siRNA-mediert knockdown av RIP3 på necroptosis indusert av coincubation med TRAIL og NAC. Transfeksjon av RIP3 siRNA reduserte RIP3 proteinekspresjon i BxPC-3-celler, men viste ingen effekt på ekspresjonen av RIP1 (figur 4B). Knockdown av RIP3 litt, men betydelig redusert cellen levedyktighet i respons til TRAIL (
P
0,05 på 25 ng /ml,
P
0,01 på 50 ng /ml) ( fig 4C). Som vist på figur 4D og 4E, selektiv knockdown av RIP3 signifikant redusert andelene av annexin V
– /PI
+ -celler etter TRAIL behandling av BxPC-3 celler dyrket med enten NAC eller TEMPOL (
P
0,01 for NAC,
P
0,05 for TEMPOL). Interessant, hemming av peroxide til NAC betydelig økt andelen annexin V
+ apoptotiske celler i RIP3 siRNA-transfektert og TRAIL-behandlet BxPC-3 celler (
P
0,01). Disse resultatene antydet at RIP1 avhengig necroptosis fremmes i TRAIL-behandlet MiaPaCa-2 og BxPC-3 celler etter hemming av peroxide, og at TRAIL behandling etter hemming av ROS (peroxide og superoksid) fremmer RIP3 avhengig necroptosis i BxPC-3 celler .
(A) ekspresjon av RIP3 og RIP1-proteinet ble undersøkt i fire kreftcellelinjer. p-aktin ble benyttet som en kontroll. (B) MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler ble transfektert med kontroll siRNA eller RIP3 siRNA. Tre dager etter transfeksjon ble cellene høstet og undersøkt for RIP3 og RIP1 proteinekspresjon. (C) BxPC-3 celler transfektert med enten kontroll siRNA eller RIP3 siRNA 3 dager før ble dyrket med TRAIL. Etter 48 timer ble cellelevedyktigheten bestemt ved WST-8-analyse. (D) BxPC-3-celler transfektert med enten kontroll siRNA eller RIP3 siRNA 3 dager før ble dyrket med TRAIL og med enten NAC (10 mM) eller TEMPOL (1 mM) i 24 timer. Etter farging med annexin V-FITC /PI, flowcytometrisk analyse ble utført. Tallene representerer andelene av hvert delsett. (E) Prosentandelene av annexin V
– /PI
+ celler og annexin V
+ celler ble beregnet. Alle datapunktene er vist representerer gjennomsnittet av tre kulturbrønnene. *
P
0,05, **
P
. 0,01
Rollene caspases i TRAIL-indusert apoptose og necroptosis
Vi neste undersøkt rollene til caspases i apoptose og necroptosis i TRAIL-behandlet MiaPaCa-2 og BxPC-3 celler. TRAIL behandling aktivert kaspase-3, -8, -9 og i begge cellelinjer (figur 5A). Siden rollen caspase-2 i celledød ikke er etablert fullt [25, 32], overvåket vi dette caspase og fant at TRAIL behandling også aktivert caspase-2. Vi undersøkte videre effekten av et panel av kaspaseinhibitorer for TRAIL-fremkalt apoptose (figur 5B og 5C). Tilsetningen av de pan-kaspaseinhibitor Z-VAD dypt inhiberte TRAIL-fremkalt apoptose i begge cellelinjer, og inhibitorer av kaspase-8, -9, eller -2 også i betydelig grad hemmet TRAIL-fremkalt apoptose (
P
0,01). Vi undersøkte effekten av disse hemmere på annexin V
– /PI
+ tidlige apoptotiske celler (figur 5D). Interessant, hemmere av enten caspase-9 eller -2 betydelig økt andelen av tidlig apoptotiske celler i TRAIL-behandlet MiaPaCa-2 og BxPC-3 kulturer (
P
0,05 eller
P
0,01). Disse resultater indikerer at et panel av caspaser delta i TRAIL-fremkalt apoptose i disse linjene, og tyder på at caspase-9 og -2 spille en hemmende rolle i TRAIL-fremkalt necroptosis.
(A) MiaPaCa-2 og BxPC -3-celler ble dyrket med TRAIL (50 ng /ml) i 12 timer, og protein uttrykk nivåer av caspase-3, caspase-8, caspase-9, og caspase-2 ble evaluert ved immunoblott. a-Tubulin ble anvendt som kontroll. (B) MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler ble dyrket med TRAIL (50 ng /ml) i nærvær av et panel av kaspaseinhibitorer (20 uM) i 24 timer. Etter farging med annexin V-FITC /PI, flowcytometrisk analyse ble utført. Tallene representerer andelene av hvert delsett. Prosentandelene av annexin V
+ celler (C) og annexin V
– /PI
+ celler (D) ble bestemt ved flow-cytometri. Alle datapunktene er vist representerer gjennomsnittet av tre kulturbrønnene. *
P
0,05, **
P
0,01. panCi, pan-caspase inhibitor; C9i, caspase-9-hemmer; C8i, caspase-8 inhibitor; C2i, caspase-2-hemmer. Kjøretøykontroll fikk et likt volum av DMSO.
Ingen crosstalk mellom caspase-2 /-9 og ROS i TRAIL-behandlede kreftceller
Vi neste undersøkt forholdet mellom caspase-9 , -2, og ROS i TRAIL-behandlet kreft i bukspyttkjertelen celler. Tilsetningen av en caspase-2 inhibitor inhiberte TRAIL-fremkalt caspase-9 spalting i to cellelinjer, men hadde ingen tilsynelatende hemmende virkning på caspase-8-aktivering (figur 6A). En caspase-9-inhibitoren ikke undertrykke caspase-2-aktivering (figur 6B). Tilsetningen av NAC mislyktes i å undertrykke TRAIL-indusert aktivering av kaspase-9 og -2 (figur 6C). Til slutt undersøkte vi effekten av caspase-2 eller -9 hemming på ROS produksjon av TRAIL-behandlede celler. Ingen klar undertrykkelse av ROS produksjon ble notert (Fig 6D og 6E). Disse resultatene indikerer at caspase-2 er oppstrøms av caspase-9, og at det ikke er noen krysstale mellom disse caspaser og ROS i TRAIL-behandlede MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler.
(A) MiaPaCa-2- og BxPC-3-celler ble dyrket med TRAIL (50 ng /ml) med eller uten caspase-2 inhibitor (20 uM) i 12 timer, og de protein ekspresjonsnivåene av caspase-3, -8, -9 og ble evaluert ved immunoblott . a-Tubulin ble anvendt som kontroll. (B) MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler ble dyrket med TRAIL (50 ng /ml) med eller uten caspase-9-inhibitor (20 uM) i 12 timer, og protein ekspresjon av caspase-2 ble evaluert ved immunoblott. p-aktin ble benyttet som kontroll. (C) MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler ble dyrket med TRAIL (50 ng /ml) med eller uten NAC (10 mM) i 12 timer, og protein ekspresjon av kaspase-8, -2, -9 og ble evaluert av immunoblot. p-aktin ble benyttet som kontroll. (D) MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler ble dyrket med TRAIL (50 ng /ml) sammen med de indikerte inhibitorer (20 uM). Som en vehikkel kontroll ble et like stort volum DMSO tilsatt. Etter 6 timer for MiaPaCa-2 og 12 timer for BxPC-3, Disse celler ble dyrket med karboksy-H
2DCFDA i 30 min og kontrollert for ROS-nivåer ved strømningscytometri. Tallet representerer den midlere fluorescensintensitet. (E) Data representerer gjennomsnittet av tre kulturbrønnene. MFI: gjennomsnittlig fluorescensintensitet. *
P
0,05, NS, ikke signifikant
Diskusjoner
Siden kreft i bukspyttkjertelen er svært motstandsdyktig mot konvensjonell terapi og er assosiert med dårlig prognose [. ,,,0],33], nye behandlingsmetoder nødvendig. TRAIL kan være nyttig terapeutisk, fordi dette molekyl kan indusere celledød i mange typer kreft mens forårsaker nesten ingen cytotoksisitet til normale celler [2]. I denne studien, må vi først undersøkt rollene til ROS i TRAIL-indusert apoptose av menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. I løpet av disse eksperimenter, har vi uventet funnet at inhibering av ROS fremmet TRAIL-fremkalt nekrose av kreftceller. Vi deretter bestemt at dette celledød var necroptosis.
ROS spille ulike roller i mange typer celler. Lave fysiologiske nivåer av ROS funksjon som andre budbringere i intracellulær signalering og er nødvendig for normal cellefunksjoner, mens overdreven ROS svekke cellefunksjoner og fremme celledød [34]. TRAIL er blitt vist å indusere ROS generasjon i kreftceller [35], og antioksidanter blokkere signalisering DR-mediert apoptose [36, 37], som tyder på at ROS er mediatorer av død ligand-fremkalt apoptose. Her fant vi at ROS ble kun produsert i TRAIL-sensitive bukspyttkjertelkreft cellelinjer, og at peroxide bidrar, i hvert fall delvis, til TRAIL-indusert apoptose i MiaPaCa-2 celler (figur 2B). Alternativt kan inhibitoren av superoksid TEMPOL uventet økt apoptose i TRAIL-behandlede BxPC-3-celler (figur 2D), noe som tyder på at superoxide virker som et anti-apoptotisk mediator under disse betingelser. Hva var den mekanismen av den hemmende effekten av superoksid på apoptose i TRAIL-behandlet BxPC-3 celler? ROS, spesielt superoksid, kan indusere autofagi [26, 38, 39], og autofagi kan fungere cytoprotectively [40]. Vi har nylig rapportert at autofagi spiller en anti-apoptotiske rolle i TRAIL-behandlet kreft i bukspyttkjertelen celler [29]. Derfor utforsket vi om autofagi ble indusert i BxPC-3 celler og superoxide hemmer TEMPOL trykt ROS-indusert autofagi, noe som resulterer i markedsføringen av apoptose. Vi evaluerte nivået av autophagy i kreftceller ved å undersøke ekspresjon av LC3. Som et resultat ble autophagy sterkt indusert i BxPC-3-celler sammenlignet med de andre bukspyttkjertelcancercellelinjer, mens TEMPOL mislyktes i å inhibere ekspresjonen av LC3-type II, som en markør for autophagy [41], i BxPC-3-celler » S1 fig «. Autophagy bidrar ikke til ROS-mediert beskyttelse i TRAIL-behandlet BxPC-3 celler. Videre studier er nødvendig for å klargjøre den nøyaktige mekanismen.
Noen ligander, inkludert TNFa, Fasl, og TRAIL, kan indusere både apoptose og necroptosis [1]. Mekanismene som styrer celle beslutningen om å gjennomgå apoptose eller necroptosis har vært intensivt undersøkt. I apoptose, caspases er bødlene av apoptose; Men disse proteaser har ingen positiv rolle i necroptosis [15]. ROS er foreslått å være bødler av necroptosis [42], og noen celletyper, for eksempel mus L929 og embryonale fibroblaster, produsere ROS svar på TNFa og vise necroptosis [43, 44]. I tillegg behandling med antioksidanter hemmer necroptosis i enkelte celletyper [44]. Imidlertid er ROS ikke nødvendig for necroptosis i alle celletyper og antioksidanter er ute av stand til å beskytte enkelte cellelinjer fra denne type celledød [45, 46]. Disse linjene av bevis tyder på at ROS-mediert necroptosis er sannsynligvis en celletype avhengig fenomen. I denne studien viste vi at tilsetning av NAC å inhibere peroksyd fremmet necroptosis ved TRAIL stimulering i to humane bukspyttkjertel cancer-cellelinjer (figur 3A). Denne økningen ble redusert med necrostatin-1, en RIP1-inhibitor [30] (figur 3B og 3C), og siRNA-mediert RIP3 knockdown redusert necroptosis i TRAIL-behandlede BxPC-3-celler i henhold til inhibering av ROS (peroksyd og superoxide) (fig 4D og 4E). Resultatene indikerte at ROS spille en hemmende rolle i TRAIL-indusert necroptosis i BxPC-3 celler. Alternativt MiaPaCa-2-cellene var negative for RIP3 (fig 4), noe som tyder på at RIP3 var unnværlig for necroptosis i TRAIL-behandlet MiaPaCa-2 celler.
Våre resultater tyder på at det ikke opplagt crosstalk mellom ROS og caspase-2 /caspase-9 finnes i den eksperimentelle system. Det er fortsatt uavklart hvordan en tidlig nekrotisk befolkningen ble indusert av TRAIL behandling under hemming av caspase-2 eller -9. Hemming av caspase-8 fremmer RIP1 /RIP3 kompleks formasjon, noe som resulterer i død signaliserer-indusert necroptosis [19, 20]. Men dette synes ikke å være tilfelle i disse forsøkene, hvor hemming av caspase-8 hadde en mindre effekt enn gjorde hemming av caspase-2 eller -9 (figur 5B og 5D). Videre er det pan-kaspaseinhibitor Z-VAD hadde ingen virkning på TRAIL-fremkalt necroptosis av kreft i bukspyttkjertelen celler.
Caspase-2 har blitt referert til som en «orphan» caspase [25], og dens rolle i TRAIL-indusert apoptose av kreftceller er ikke klarlagt fullt. Det har blitt rapportert at caspase-2 er nødvendig for optimal TRAIL-formidlet kløyving av bud i humane tarmkreftceller [47]. I tillegg primer caspase-2-cancerceller for TRAIL-fremkalt apoptose ved å behandle procaspase-8 [48]. I denne studien viste vi at hemming av caspase-2 undertrykte apoptose i TRAIL-behandlede kreftceller. Alternativt ROS aktivere caspase-2, og DNA-skade induserer også dens spalting [49]. Vi har nylig rapportert at ROS trigger DNA-skade, og dermed fører til aktivering av caspase-2 i nyrecellekreft linjer [50]. Caspase-2 aktivisering som svar på DNA-skade gir et viktig bindeledd mellom skaden og engasjement av apoptotiske sti [50, 51]. I tillegg ROS utløst caspase-2-aktivering og induserte apoptose i en human leukemisk T-cellelinje [51]. Men i denne studien, fant vi ingen crosstalk mellom ROS og caspases (fig 6).
uttrykk for enten DR4 eller DR5 er forutsetning for TRAIL-indusert apoptose. De fem cellelinjer studiene var positive for DR5, men ikke for DR4 (fig 1B).
