Abstract
Bakgrunn og metoder
Pim familie proteiner er onkogene kinaser involvert i flere typer kreft og er involvert i reguleringen av celleproliferasjon, overlevelse og motilitet. Her har vi undersøkt muligheten for Pim kinaser å fremme metastatisk vekst av prostata kreft celler i to xenograft modeller for menneskelig prostatakreft. Vi har også vurdert effekten av Pim-hemmere å motvirke disse effektene.
Resultater
Vi viser her at tumorigent vekst av både subkutant og orthotopically inokulert prostatakreft xenografter forsterkes av stabil overekspresjon av enten Pim-en eller Pim-3. Dessuten, Pim-overekspresjon ortotopiske prostatakreft er meget inngripende og i stand til å overføre ikke bare til de nærliggende prostata-drenerende lymfeknuter, men også inn i lungene til å danne metastaser. Når xenopodet musene daglig behandlet med PIM-selektiv hemmer DHPCC-9, som begge volumene samt metastatisk kapasitet av svulstene er drastisk redusert. Interessant er det Pim-forfremmet metastatisk vekst av ortotopiske xenografter assosiert med økt angiogenese og lymphangiogenesis. Videre tvunget Pim uttrykk øker også fosforylering av CXCR4 chemokine reseptoren, noe som kan gjøre det mulig for kreftceller til å migrere mot vev som lungene som uttrykker CXCL12 chemokine ligand.
Konklusjoner
Våre resultater indikerer at Pim overekspresjon forbedrer invasive egenskapene til prostatakreftceller
in vivo
. Disse effekter kan reduseres ved den Pim-selektiv hemmer DHPCC-9, som kan nå tumorvev uten alvorlige bivirkninger. Dermed Pim målretting behandlinger med DHPCC-9-lignende forbindelser kan bidra til å hindre utviklingen av lokale prostata karsinom å skjebnesvangert metastatisk kreftsykdom som
Citation. Santio NM, Eerola SK, Paatero jeg, Yli-Kauhaluoma J, Anizon F, Moreau P, et al. (2015) Pim kinaser Fremme Migrasjon og metastatisk vekst av prostatakreft xenografter. PLoS ONE 10 (6): e0130340. doi: 10,1371 /journal.pone.0130340
Academic Redaktør: Jeffrey K. Harrison, University of Florida, USA
mottatt: 20 november 2014; Godkjent: 19 mai 2015; Publisert: 15 juni 2015
Copyright: © 2015 Santio et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Academy of Finland (tilskudd 121 533 til Pjk, gi 269 541 til PH), Tuli Program ved University of Turku (Pjk), Sigrid Juselius Foundation (PH), FinPharma Doctoral Program (NMS), Emil Aaltonen Foundation (NMS), kreft organisasjoner for Vest-Finland (NMS), Orion-Farmos Research Foundation (NMS), finsk Cultural Foundation (NMS), Åbo universitet Foundation (SKE), og Walter och Lisi Wahls Stiftelse för Naturvetenskaplig Forskning (JYK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Johanna Tuomela ble ansatt Pharmatest Services Ltd for en periode i løpet av studien. Pharmatest ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Den spesifikke rolle JT er artikulert i seksjon «Forfatter bidrag»
Konkurrerende interesser:. Johanna Tuomela ble ansatt Pharmatest Services Ltd for en periode i løpet av studien. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling, eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke JT tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Pirkko Härkönen er en PLoS ONE Editorial styremedlem, men dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
pim
familie gener ble først identifisert som provirale integreringssteder for Moloney murin leukemivirus [1], men har senere blitt vist å være involvert i utvikling av humane lymfoide ondartede sykdommer og faste tumorer [2]. Proteinene kodet av tre
pim
familie gener er serin /treonin-spesifikke kinaser som har vist seg å fremme tumorigenesis ved å øke både spredning og overlevelse av celler [2,3]. Flere nylig, vi og andre har også innblandet dem i regulering av migrasjon og invasjon av heftkreftceller [4-6], mens resultater fra kliniske studier viser sammenslutning av unormalt høye nivåer av Pim kinaser med flere ondartede kreft av epitelial opprinnelse [7 -9].
på grunn av sine nye roller i kreftutvikling, Pim kinaser har blitt svært attraktive som terapeutiske mål [10-12]. Det er også fysiologiske og strukturelle grunner til å rettferdig Pim kinaser som narkotika mål. Først blir inaktivering av Pim kinaser forventes ikke å gi alvorlige bivirkninger, siden mus som mangler for alle tre Pim familiemedlemmer er levedyktig [13]. Dernest unike strukturelle trekk innenfor hengsel regionen som forbinder de N- og C-terminale lapper rundt ATP-bindende lomme gjengi Pim kinaser konstitutivt aktiv og gjør design av svært selektive hemmere [14]. Vi har nylig identifisert potente og selektive Pim kinase hemmere i løpet av to strukturelt urelaterte grupper av forbindelser, tetrasykliske pyrrolocarbazoles [15] og trisykliske benzo [
cd
] azulener [16]. Vi har også funksjonelt validert dem begge
in vitro Hotell og cellebaserte analyser [6, 17].
tumorxenotransplantater gi gode fysiologiske innstillinger for prekliniske proof-of-concept studier, både til identifisere terapeutiske mål og å vurdere
in vivo
effekt av forbindelser rettet mot dem. Subkutan inokulering av PC-3 prostata kreft celler som overuttrykker enten Pim-en eller Pim-2 inn immunsvikt mus har tidligere vist seg å resultere i større svulster [18], men sammenlignbare data om Pim-3 har vært mangler som også direkte bevis for evnen til Pim-kinaser for å bidra til dannelsen av metastaser. Ennå informasjon fra cellebaserte assays motilitet, så vel som kliniske data koble oppregulering av PIM-kinaser til kreftcellemigrering, invasjon og mer ondartet oppførsel [4-9]. I tillegg har Pim-1 blitt vist å regulere CXCR4 /CXCL12 kjemokin vei, som spiller en viktig rolle i migrering og invasjon av både leukemiske [4, 19] og prostatakreft-celler [20-23].
I denne studien har vi vurdert effektene av Pim kinaser og deres hemmere med både subkutan og ortotopiske mus xenograft modeller for menneskelig prostatakreft. Vi viser at overuttrykte Pim-1 eller Pim-3-kinaser fremme ikke bare veksten av PC-3 celle-stammer xenografter, men også metastatiske egenskaper orthotopically indusert svulster, og at Pim-hemmende stoffer kan hindre disse effektene. Vi viser også at Pim-forfremmet metastatisk vekst er assosiert med økt angiogenese, lymphangiogenesis og CXCR4 fosforylering.
Resultater
Pim-3 kinase forbedrer vekst og metastatiske egenskaper av prostatakreft xenografter
for å undersøke muligheten for Pim-3 for å fremme tumorvekst og metastasering under
in vivo
forhold, vi etablert en stabil PC-3 /Pim-tre prostatakreft cellelinje som uttrykker human Pim-3 sammen med Tomato som et fluorescerende oppfølging markør. For å evaluere den karsinogent potensial på PC-3 /Pim-3 cellelinjen i forhold til den mock-transfekterte PC-3-kontroll cellelinje, ble cellene inokulert subkutant i atymiske nakne hannmus. I løpet av oppfølgingsperioden på opp til 24 dager, ble tumorvolum målt både med en caliper og ved fluorescerende avbildning av Tomato uttrykk. Etter offer, ble svulster og vevsprøver skåret for fluor og morfometriske analyser. Disse viste at den PIM-3-overuttrykkende transplantater var blitt betydelig raskere enn den mock-transfekterte celler, selv om svulster hadde forblitt lokal uten noen tegn på metastaser (fig 1A og 1B). De manuelt målt tumorvolum korrelert med de områdene som bestemmes av fluorescerende imaging (S1 fig). For ytterligere å analysere vekst egenskapene til disse svulstene ble mitotiske celler farget fra parafininnstøpte vevsprøver. Interessant, andelen av mitotiske celler var klart høyere i Pim-3-overekspresjon tumorvev enn i kontrollene (fig 1C og S1 Fig). Forskjellen i tumorvolumer kan også bli detektert fra hele tumor skanner som benyttes for analyse av mitotiske celler (S1 Fig). Samtidig til de subkutane forsøkene ble cellene dyrket i tre uker uten antibiotika valg for å bekrefte stabiliteten av PIM-3 overekspresjon (S1 figur).
PC-3-avledede cellelinjer som var blitt stabilt transfektert med tom vektor (C) eller en vektor som uttrykker Pim-3 (P3) ble subkutant eller orthotopically injisert i atymiske nakne mus. Tumorer og isolerte vev ble farget med Hematoxylin og Eosin for visualisering av deres struktur. Ytterligere stainings ble utført med anti-fosfo-histon H3-antistoff for å visualisere antallet av mitotiske celler. I de subkutane forsøk ble tumordannelse, etterfulgt av fluorescens avbildning av tomat uttrykket (A) og omtrentlige tumorstørrelsene ble målt ved palpasjon på forskjellige tidspunkter (B). Etter 24 dager ble musene avlivet og deres tumorer og vev ble oppsamlet. Vist er gjennomsnittsverdier fra alle fullt avbildes kreft seksjoner fra angitte tall (
n
) hos mus etter farging av mitotiske celler (C). I ortotopiske forsøk ble de stabile PC-3-celler tillates å vokse i prostata i tre uker. Deretter mitotiske celler (brune) ble analysert fra eksempelbilder (D), mens metastaser (indikert med piler) ble talt fra prostata-drenering lymfeknuter og lunger (E).
Siden subkutane xenografter hadde ikke invadert inn i kroppen, fortsatte vi våre studier med en orthotopic prostatakreft modell, hvor svulsten mikromiljøet var ventet å være mer gunstig mot metastatisk vekst [24-26]. I den første pilot sett av eksperimenter, kontroll eller Pim-3-overuttrykkende celler ble orthotopically inokulert inn i prostata av nakne hannmus. Tumorvekst ble fulgt i løpet av en periode på tre uker, hvoretter dyrene ble avlivet og tumorene sammen med utvalgte organer ble oppsamlet. I denne studien ble det ikke store forskjeller i tumorvolumer oppdaget. Men analyse av parafininnstøpte vevsprøver ikke bare avdekket høyere mitotiske potensialet i Pim-3-overekspresjon celler, men også deres evne til å invadere i lungene (Fig 1D og 1E). I motsetning til den mildere metastatiske adferd mock-transfekterte kontrollceller bekreftet våre tidligere observasjoner på evnen av foreldre PC-3-celler til å invadere i prostata-drenerende lymfeknuter, men sjelden mer fjerntliggende organer [25-26].
Pim hemming er tolerert av sebrafisk embryoer og voksne mus
de lovende resultater med invasiv Pim-3-overekspresjon ortotopiske svulster bedt oss om å utføre et annet sett av eksperimenter, hvor vi også testet effekten av Pim hemming av tetrasykliske pyrrolocarbazole DHPCC-9 [6] og trisykliske benzo [
cd
] azulene BA-1a [17]. Til sammenligning har vi også etablert en stabil PC-tre cellelinje overekspresjon menneskelig Pim-en.
Før dyreforsøk, effekt og toksisitet av Pim-hemmere ble testet i cellebaserte analyser og
in vivo
. Begge hemmere antagonized effektivt de pro-trekkende effekter av Pim-en og Pim-3, og redusert migrasjon av alle stabile cellelinjer til en lignende grad (S2 fig). Innenfor 24 h oppfølgingsperioden av sårheling analysen ble cellenes levedyktighet bare lite påvirket, mens begge inhibitorer dramatisk redusert det i alle cellelinjer ved et senere tidspunkt 72 h-punkt. Når
in vivo
sikkerheten til hemmere ble analysert med sebrafisk embryoer innenfor sitt vannmiljøet, både DHPCC-9 og BA-1a ble godt tolerert, mens vår cytotoksiske kontroll sammensatte BA-2c [17] førte til massive utviklingsproblemer og død (S3 Fig og S1 tabell). Men ble litt buet haler og forstørrede pericardiac sekker observert i embryoer som ble behandlet med 10 mm DHPCC-9 (S3 figur), noe som tyder på at riktig Pim aktivitet er nødvendig for normal fosterutvikling. Men disse dataene ikke tillater for sikre konklusjoner om sikkerheten av inhibitorer hos voksne organismer.
Andre sikkerhetstester ble deretter utført med voksne mus. Men med de høye konsentrasjonene som er nødvendig for disse testene, bare DHPCC-9 kunne bli suspendert i DMSO, mens BA-1a var oppløselig bare i N, N-dimetylacetamid (DMA).
I en første ti dagers oppfølgingsperiode, DHPCC-9 behandlinger (50 mg /kg) forårsaket ingen store endringer i mus atferd, injeksjon område eller kroppsvekt (S4 fig). I motsetning til DMA-baserte behandlinger (25 mg /kg) forårsaket urolig opptreden og litt redusert kroppsvekt. I tillegg DMA syntes å indusere arrvev formasjonen i injeksjonsområdet. Deretter ble sikkerhetstesting fortsatte med mindre mengder av DMA (10-20 mg /kg), som ikke forårsaker noen synlige endringer i injeksjonsområdet, mus atferd eller vektøkning i løpet av 17-dagers oppfølging (S4 fig). Basert på disse resultatene, 50 mg /kg DHPCC-9 i 20 pl DMSO og 20 mg /kg av BA-1a i 10 mL av DMA ble besluttet å brukes daglig til å teste sine effekter på orthotopic Pim-3-overekspresjon prostata xenografter.
Pim hemming reduserer Pim avhengig metastatisk vekst av ortotopiske prostata xenografter
i det andre settet med ortotopiske eksperimenter, mock-transfekterte PC-3 celler eller celler stabilt overekspresjon Pim-en eller Pim -3 ble orthotopically inokulert inn i prostata av nakne hannmus. Mus med Pim-3-overekspresjon xenotransplantater ble randomisert inn i 4 grupper og administrert med daglige doser av de inhibitorer eller like volum av DMSO eller DMA som kontroller. Mus oppførsel og vektøkning ble fulgt i løpet av eksperimentet, men ingen store hemmer relaterte endringer ble detektert (S5 Fig). Etter offer, ble tumorer skåret ut og musene uten tumorer ble ekskludert fra videre analyser (S2 Table). For å bekrefte stabiliteten av cellelinjene,
ex vivo
scanning ble utført for å påvise Tomat signaler i tumorer (S6) Fig, mens immunohistokjemi ble anvendt for å visualisere xenopodet tumorceller som uttrykker Pim proteiner fra V5-merkede konstruksjoner ( S7 figur).
Når svulstvolum ble beregnet, Pim-overekspresjon svulster var igjen betydelig større enn de som er dannet av mock-transfekterte celler (figur 2A og 2D). Men Pim-1 xenografter kan ikke sammenlignes direkte med andre, siden mus som bærer dem ikke hadde fått noen kjemiske behandlinger. DHPCC-9 behandling signifikant redusert mengden av PIM-3-overekspresjon svulster, hvilket antyder at denne forbindelsen hadde vært i stand til å nå tumorvevet og hemme Pim-3-aktivitet der (Fig 2B og 2D). Derimot, fikk BA-1a ikke viser noen effekt i forhold til å redusere tumorvolum (Fig 2C og 2D). Tilsynelatende denne forbindelsen ikke hadde nådd sitt mål-vev, som også foreslått ved nærvær av et gult bunnfall rundt injeksjonsstedet.
PC-3-avledede stabilt transfekterte celler (Mock = C, Pim-1 = P1, Pim-3 = P3) ble orthotopically inokulert inn i prostata av atymiske nakne mus. Mus ble behandlet daglig med enten DMSO eller DMA (kontrollbehandlinger) eller med Pim-inhibitorer (50 mg /kg av DHPCC9 i DMSO eller 20 mg /kg av BA-1a i DMA). Etter tre uker med behandling ble musene avlivet og deres tumorvolumer ble målt. Først volumene ble sammenlignet mellom angitte tall (
n
) mus uten inhibitor behandlinger (A). Da volumene av tumorer avledet fra inhibitor-behandlede dyr ble sammenlignet med tumorer fra dyr med passende kontrollbehandlinger DMSO (B) eller DMA (C). Før svulst fiksering, ble representative bilder tatt (D). Senere parafininnstøpte tumor snitt ble farget med anti-fosfo-histon H3-antistoff for å visualisere mitotiske celler (brun). Vist er gjennomsnittsverdier kombinert fra alle fullt fotografert svulstvev seksjoner fra DHPCC-9-behandlet og DMSO eller DMA-behandlede kontrollgrupper samt representative bilder fra Pim-3-overekspresjon svulster (E).
mitotiske priser ble også målt fra vevssnitt avledet fra ortotopiske svulster. Mens i de subkutane eksperimenter og i det første settet av ortotopiske eksperimenter hadde det vært klart mer mitotiske celler i tumorer dannet av Pim-3-overuttrykkende celler sammenlignet med mock-transfekterte celler (figur 1C og 1D), i den andre ortotopisk settet forskjellene var mindre (figur 2E). Men behandling med DHPCC-9 hadde redusert antall mitotiske celler i Pim-3 xenografter (Fig 2E).
Siden Tomato-avledet fluorescens var ikke sterk nok til å tydelig avsløre mikrometastaser (S6 Fig), histologiske analyser ble utført med vevssnitt fra nyrer, milt, lever, lunger så vel som prostata-drenerende lymfeknuter. Etter farging med haematoxylin og eosin, ble metastaser søkt etter fra ulike vevsprøver, men spesielt fra lymfeknuter og lunger. Forbløffende, mens mer enn halvparten av mock-transfekterte og de fleste Pim-1 eller Pim-3 xenografter hadde vært i stand til å metastasere til prostata-drenering lymfeknuter, hadde bare Pim-overekspresjon celler invadert så langt ned i lungene (fig 3a 3C, S3 tabell). Enda mer interessant, DHPCC-ni behandling hadde effektivt hemmet dannelsen av metastaser i begge organer. Begge metastatiske og nekrotiske områder ble målt, men det var ingen klar sammenheng til Pim aktivitet (S6 figur), noe som tyder på at når en metastatisk svulst er dannet, kan kreftceller erverve andre egenskaper i tillegg til Pim aktivitet for å støtte deres vekst.
Forskjellige organer ble tatt fra mus med ortotopisk prostata tumorxenografter dannet av PC-3-celler som stabilt overuttrykker en tom vektor (C), Pim-1 (P1) eller Pim-3 (P3). Parafininnstøpte vevssnitt ble farget med hematoksylin og eosin og analysert for tilstedeværelse av metastaser. Vist er representative bilder (A) fra lymfeknute og lunge seksjoner (kreftceller angitt med piler). De metastatiske egenskaper xenograft fra mus behandlet med DHPCC-9, BA-1a eller deres løsningsmidler ble også analysert. Vist er prosenter av mus positive for enten lymfeknutemetastaser (B) eller lungemetastaser (C) i hver gruppe.
For å visualisere blodkar av ortotopiske svulster, blodårer og lymfekar ble farget. Etter kvantitative analyser, ble en signifikant økning oppdaget at i de områder av blodårer pr tumor i xenotransplantater dannet av Pim-overekspresjon celler sammenlignet med kontrollcellene (fig 4a). Litt mindre forskjeller ble funnet også i de områder av lymfekar (figur 4B). Men etter behandling med Pim inhibitor DHPCC-9, de områdene av både blod samt lymfekar ble betydelig redusert (figur 4A-4D).
Angiogene egenskapene til ortotopiske prostata xenografter (Mock = C, Pim-1 = P1, Pim-3 = P3) ble analysert ved immunhistokjemisk farging av parafininnstøpte vevssnitt med anti-CD34 (blodkar) og anti-m-LYVE-1 (lymfekar) antistoffer. Vist er gjennomsnitts områder av alle analyserte blodet (A) og lymfekar (B) sammen med representative bilder (skip i brun) (CD) fra fullt avbildes svulst vevssnitt.
Pim-en og Pim -3 forbedre fosforylering og celleoverflaten uttrykk for CXCR4
CXCR4 chemokin reseptor protein har tidligere vært innblandet i PC-3 cellemigrasjon og samhandling med endotelceller [20-23]. Videre, i hematopoetiske celler Pim-1 har blitt vist å fosforylere CXCR4 ved Ser339, og derved fremme celleoverflate-ekspresjon av CXCR4 og dets interaksjon med CXCL12 kjemokin liganden [4]. I tillegg har vi tidligere har vist Pim hemming eller lyddemping for å effektivt redusere invasjon av PC-3-celler overfor MG-63 osteosarcom celle kondisjonert medium, hvor hoved kjemotiltrekkende er CXCL12 [6, 23]. For å finne ut om Pim /CXCR4 interaksjon spiller en rolle også i vår prostatakreft xenograft modell, må vi først vurdert om det var forskjeller i fosforylering status for CXCR4 mellom våre stabile cellelinjer. Ved Western blotting, ble det observert en markert økning i Ser339-fosforylerte CXCR4-nivåer i både Pim-overekspresjon stabile cellelinjer sammenlignet med kontrollcellelinje (figur 5A). I tillegg ble en reduksjon i fosforylerte CXCR4 nivåer observert etter behandling av foreldre PC-3-celler med PIM-inhibitoren DHPCC-9 (figur 5B).
Fosforylering av CXCR4 ved S339, så vel som Pim nivåene ble analysert ved hjelp western blotting i stallen Pim-1 (P1), Pim-3 (P3) eller kontroll vektor (C) overekspresjon PC-3 celler eller foreldre PC-tre cellelinje behandlet med 0,1% DMSO eller 10 mm DHPCC-9. Vist er resultater fra en representant eksperiment med lasting kontroller og molekylvekt (KDA) markører (A-B). Evnen til Pim familiemedlemmer til å fosforylere CXCR4
in vitro
ble analysert ved inkubasjon GST-merket Pim-1 (P1), Pim-2 (P2) eller Pim-3 (P3) proteiner med GST-merket fragmenter av villtype (WT) eller Ser339 Ala (SA) mutant human CXCR4. Fosforylert CXCR4 ble oppdaget av fosfor (Ser339) -CXCR4 antistoff og protein lasting av Ponceau S farging. Vist er resultater fra en representant eksperiment (C). Lokalisering og signalintensitet av fosforylert versus totale CXCR4-ekspresjon ble analysert ved immunofluorescent (IF) farging av stabilt transfekterte celler behandlet med enten 0,1% DMSO eller 10 uM DHPCC-9. Forsøket ble kontrollert av parallelle prøver farget bare med det sekundære antistoff (-ab). Stainings ble gjentatt to ganger og stabler av bildene ble tatt av konfokalmikroskopi fra minst 30 celler per prøve per eksperiment. Vist er signalet intensiteter av fosfor-CXCR4 stainings forhold til overordnede CXCR4 nivåer sammen med representative bilder fra fosfor-CXCR4 og CXCR4 stainings (D-E). Fosforylering og lokalisering av CXCR4 ble også analysert ved immunhistokjemisk farging av parafininnstøpte vevssnitt fra orthopic prostatakreft. Vist er den relative økning i mengden av fosfo-CXCR4-positive celler versus totale CXCR4 ekspresjon, målt ved hel tumor skanning. PBS i stedet for det primære antistoff ble anvendt som en negativ kontroll. Representative bildene ble tatt for å visualisere forskjellene i fosfor-CXCR4 (mørk brun) stainings (F).
Siden stabil overekspresjon av enten Pim-en eller Pim-tre tydelig forbedret CXCR4 fosforylering, vi ønsket å sammenligne
in vitro
aktiviteter av alle tre Pim familiemedlemmer mot CXCR4. Derfor inkubert vi GST-merket Pim-proteiner sammen med GST-merket C-terminale 46 aa-fragmenter av CXCR4 (WT) eller dens muterte S339A form (SA), hvor det serinrest hadde blitt erstattet med en alaninrest. Når
in vitro
fosforylerte fragmenter ble oppdaget med anti-fosfor (Ser339) -CXCR4 antistoff, ble det klart at både Pim-en og Pim-3, men ikke Pim-2 kan fosforylere CXCR4 på Ser339 ( fig 5C). Tilsvarende forskjeller ble også påvist i PC-3 celler etter forbigående Pim overekspresjon, mens Pim inhibitor DHPCC-9 effektivt hemmet CXCR4 fosforylering der (S8 figur).
Deretter gjennomførte vi immunofluorescence stainings å visualisere lokalisering av CXCR4 protein i de stabile PC-3 cellelinjer som hadde blitt behandlet i 24 timer med DMSO eller DHPCC-9. Mens CXCR4 ble allestedsnærværende uttrykt, sin fosforylert skjema kjennes av anti-fosfor (Ser339) -CXCR4 antistoff vises mer membran-assosiert uttrykk i DMSO-behandlede prøver, men heller spredt og svakere cytoplasmisk uttrykk i DHPCC-9-behandlede prøver (Fig 5D og 5E). Mens både Pim-en og Pim-3 forbedret phospho-CXCR4 signaler i forhold til overordnede CXCR4 nivåer, Pim hemming effektivt redusert dem, noe som resulterer også i litt sterkere kjernefysisk uttrykk for CXCR4 (Fig 5D og 5E).
for å analysere rollen til CXCR4 fosforylering i våre
in vivo
eksperimenter brukte vi immunhistokjemi for å måle de relative mengder av ortotopiske prostata tumor celler som var positive for fosforylert CXCR4. Sammenligning av fosfo-CXCR4 signaler til de gjennomsnittlige CXCR4 signalene i hver tumor viste at både Pim-1 og Pim-3 hadde signifikant økt de relative mengder av fosfo-CXCR4, mens Pim hemming av DHPCC-9 hadde sunket det til og med under nivået observert i mock-transfekterte prøver (figur 5F). Til sammen både
in vitro Hotell og
in vivo
data tyder på at svulster overekspresjon Pim-en eller Pim-3 kan dra nytte av CXCL12 /CXCR4 chemokin vei til å spre til andre organer som lungene.
Diskusjoner
Her viser vi at PC-tre prostatakreftceller overekspresjon enten Pim-1 eller Pim-3-kinaser danne større xenografttumorer enn foreldre PC-3 celler. Disse resultatene er godt i tråd med tidligere observasjoner på evnen av Pim-en og Pim-2 for å forbedre veksten av PC-3 celle-stammer subkutane prostatakreft xenografter [18], mens her vi vise at Pim-3 er også like effektive . Mer intriguingly, når orthotopically inokulert i mus prostata,-celler overuttrykkende Pim-1 eller Pim-3 har en øket kapasitet til å metastasere fra prostata-tumorer basert på andre organer slik som lungene. I tillegg er en av de testede Pim-inhiberende forbindelser, DHPCC-9, er i stand til å redusere Pim avhengig tumorvekst, så vel som dannelsen av metastaser uten alvorlige bivirkninger, noe som tyder på at det er i stand til å penetrere inn i tumorceller for å inaktivere Pim kinaser det.
Mens vi tidligere har vist at Pim kinaser er i stand til å fremme motilitet av prostatakreftceller [6], er denne studien den første til å demonstrere lignende effekter også under
in vivo
forhold . Dette er av interesse, siden orthotopically inokulert PC-3 celler har tidligere vist seg å migrere fra prostata til de lokale prostata-drenering sakrale og bekken lymfeknuter, men sjelden noe annet [24-26]. Disse funnene ble bekreftet i våre studier, hvor metastatisk vekst ble observert i prostata-drenering lymfeknuter på de fleste tumorbærende mus. Men bare de Pim-overekspresjon xenografter var i stand til å metastasere til lungene, mens ingen metastaser påvist i andre innsamlede vev.
For å møte de tumorigene mekanismer drevet av Pim kinaser og motarbeidet av Pim hemming, vevsprøver fra de primære xenografttumorer ble analysert ved immunhistokjemi for markører for mitotisk aktivitet, angiogenicity og invasivitet. Svake økninger Pim-avhengige ble observert i andelen av mitotiske celler og i de områder av lymfekar, mens mer betydelig oppregulering ble detektert i dannelsen av tumorvaskulaturen og i fosforylering og celleoverflate-ekspresjon av CXCR4. Til sammenligning ble alle disse parametrene sterkt redusert ved Pim-selektiv hemmer DHPCC-9. Dermed kan disse observasjonene forklare ikke bare økt vekst av svulster overekspresjon Pim kinaser, men også deres metastatiske egenskaper.
CXCL12 /CXCR4 chemokin veien er viktig for lymfocytt menneskehandel og spesielt for homing av blodkreft stamceller inn i benmarg [19, 27]. I tillegg er CXCL12 kjemokin konstitutivt uttrykt i flere andre organer, inkludert lymfeknuter og lunger, og kan derved tiltrekke seg ikke bare hematopoetiske celler, men også migrerende kreftceller som ofte viser høye ekspresjonsnivåer av CXCR4-reseptoren på sin celleoverflate. Videre kan CXCR4 støtte svulst overlevelse f.eks ved å fremme svulst vascularization.
Pim-en overekspresjon har vært forbundet med oppregulert celleoverflaten uttrykk for CXCR4 i blodkreft maligniteter som akutt myelogen leukemi [4], diffuse store B-celle lymfom [28] og kronisk lymfatisk leukemi [29]. Den intracellulære hale av CXCR4 kan fosforyleres
in vitro
Ser339 fra Pim-en kinase [4] og fra Pim-3, som vist her, men ikke av Pim-2. Interessant er Ser339 blant flere serinrester målrettet av G-protein-reseptor-kinaser (GRKs), noe som resulterer i reseptor endocytose [30]. I motsetning til dette har Pim-avhengig fosforylering av CXCR4 blitt rapportert å føre til økt eksternalisering av reseptoren, slik at celler til å migrere mot en CXCL12 gradient [4]. I PC-3 celler, CXCR4 overflatenivået er forholdsvis lavt, med mindre cellene blir behandlet med CXCL12 liganden, noe som også øker klart invasiv egenskapene til disse celler [20-23]. Således, mens ytterligere studier på effekten av Pim kinaser på CXCR4 i PC-3 celler dyrket i fravær eller nærvær av CXCL12 ville være av interesse, kan man allerede spekulerer i at Pim-CXCR4 interaksjon har hjulpet våre Pim-overekspresjon ortotopiske tumorceller å danne metastaser i prostata-drenering lymfeknuter og lungene, mens svulsten mikromiljøet rundt subkutane svulster ikke kan ha vært ettergivende nok til å fremme invasjonen.
Siden CXCL12 /CXCR4 veien er en attraktiv terapeutisk mål flere lavmolekylære forbindelser er blitt utviklet som enten blokkerer interaksjonen av kjemokin med dets reseptor eller inhibere signalisering nedstrøms for reseptoren [19, 27]. Lovende resultater har allerede blitt hentet fra kliniske forsøk som har som mål å øke kjemosensitivitet av blodkreft maligniteter, men CXCL12 /CXCR4 hemmere kan også bidra til å redusere metastatisk potensial av solide kreftformer. Ett problem med disse inhibitorer er at de induserer en kontraregulatoriske oppregulering av CXCR4 på celleoverflaten, noe som resulterer i bare kortvarige responser. Derfor kan det være mer effektivt å blokkere eksternalisering av CXCR4 reseptoren fra Pim-hemmere som også kan ha mindre skadelige bivirkninger.
Her har vi vist foreløpig
in vivo
sikkerhet og effekt data for en Pim-selektiv hemmer den pyrrolocarbazole DHPCC-9, mens benzo [
cd
] azulene BA-1a viste seg å være for uløselig. DHPCC-9 viste ingen cytotoksiske effekter i mus, selv om enkelte misdannelser ble oppdaget i tidlig stadium sebrafisk embryoer. Disse resultater antyder at i det minste en kortvarig inhibering av Pim aktivitet være godt tolerert hos voksne organismer, og at det kan til og med være mulig å bruke høyere doser av denne inhibitor for å forstørre de observerte effekter. Det kan også være fordelaktig å kombinere Pim inhibering med andre behandlinger som påvirker celleoverlevelse eller motilitet.
data fra cellebaserte sårheling forsøk tyder på at DHPCC-9 er i stand til å blokkere motilitet av PC-3 prostata kreftceller [ ,,,0],6]. Som vist også i denne studien, er dette ikke bare på grunn av redusert proliferasjon, siden cellenes levedyktighet ikke ble betydelig redusert i løpet av 24 timer såret gjenvinning av oppfølgingsperioden.
