Abstract
En stor utfordring i behandling av pasienter med prostatakreft er å identifisere de personer i risikosonen for å utvikle metastatisk sykdom, som i de fleste tilfeller av sykdommen vil være lat. Vi analyserte samlet serumprøver fra 4 grupper av pasienter (n = 5 prøver /gruppe), samlet inn prospektivt og aktivt overvåkes i minst 5 år. Pasientgrupper var (i) histologiske diagnosen benign prostatahyperplasi uten tegn til kreft «BPH», (ii) lokalisert kreft uten tegn til progresjon, «non-utvikler «(iii) lokalisert kreft med bevis for biokjemisk progresjon,» framdrift «, og (iv) benmetastase ved presentasjon» metastatisk «. Samleprøver var immuno-utarmet av de 14 mest tallrike proteiner og analysert ved hjelp av en 4-plex iTRAQ tilnærming. Totalt 122 proteiner ble identifisert og relativt kvantifisert. Sammenligninger av framdrift
versus
ikke-progresjon grupper identifisert betydelige differensial uttrykk for 25 proteiner (p 0,001). Sammenligninger av metastatisk
versus
progresjon grupper identifisert betydelige differensial uttrykk for 23 proteiner. Kartlegging av differensielt uttrykte proteiner på prostatakreft progresjon pathway avslørte den feilregulert ekspresjon av individuelle proteiner, par av proteiner og «paneler» av proteiner for å være assosiert med bestemte faser av sykdomsutviklingen og progresjon. Median farging intensiteten av eukaryote oversettelse elongeringsfaktor 1 a 1 (eEF1A1), en av kandidatene identifisert, var signifikant høyere i osteoblaster i umiddelbar nærhet av metastatiske tumorceller sammenlignet med osteoblaster i kontroll ben (p = 0,0353, Mann-Whitney U). Vår proteomikk tilnærmingen har identifisert potensielle kunder for potensielt nyttige serum biomarkører knyttet til metastatisk progresjon av prostatakreft. Panelene identifisert, inkludert eEF1A1 garanterer videre etterforskning og validering
Citation. Rehman jeg, Evans CA, Glen A, Cross SS, Eaton CL, Ned J et al. (2012) iTRAQ Identifikasjon av Kandidat Serum Biomarkører Associated med metastatisk progresjon av menneskelige prostata kreft. PLoS ONE 7 (2): e30885. doi: 10,1371 /journal.pone.0030885
Redaktør: Karl X. Chai, University of Central Florida, USA
mottatt: 26 august 2011; Godkjent: 27 desember 2011; Publisert: 15 februar 2012
Copyright: © 2012 Rehman et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra PROMET (prosjekt nr. FP6-LSH-5-2004-018858), og P-MARK (kontrakt nr. LSHC-CT-2004-503011), under sjette EUs rammeprogram og NCRI ledeteksten (prostata kreft Mekanismer av progresjon og behandling) samarbeidende tilskudd til Dr. Hamdy, og tilskudd fra Engineering og Fysisk Sciences Research (EPSRC) til Dr. Wright: EP /E036252 /1 og GR /S84347 /01. Vi er takknemlige for Dr. Nicholas Hoyle på Roche Diagnostics, Penzberg, Tyskland for sin støtte til forbruksvarer og reagenser for prosjektet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Vi er takknemlige til Dr. Nicholas Hoyle på Roche Diagnostics, Penzberg, Tyskland for hans støtte mot forbruksvarer og reagenser for prosjektet. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
I Europa og USA er prostatakreft den nest vanligste kreftdiagnose og tredje vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall hos menn [1], [2]. Dessuten har forekomsten økt siden omfattende innføring av prostata spesifikt antigen (PSA) testing [3]. De fleste pasienter med prostatakreft er diagnostisert på et tidlig stadium, men selv med screening over 7% av tilfellene utvikle metastatisk sykdom [4]. Hos menn med fjernmetastaser prognosen er dårlig, med en gjennomsnittlig overlevelse på 24 til 48 måneder. Ben er den mest vanlige stedet for prostata cancer metastase og er forbundet med skjelettsmerter, ryggmargskompresjon og marg svikt [4]. For tiden er beinmetastatiske lesjoner bestemt ved avbildning slik som isotop beinskanning, men identifisering av et serum basert biomarkør (e) for å forutsi følsomheten av pasienter for å utvikle benmetastase kunne muliggjøre en mer nøyaktig klinisk vurdering av sykdommen og hjelpe guide terapi.
diagnosen prostatakreft er oftest laget av en triade av serum prostata spesifikt antigen (PSA) målinger, digital endetarms eksamen (DRE), og histologisk vurdering av transrectal ultralyd (TRUS) veiledet biopsimateriale [ ,,,0],5]. Selv om PSA er et FDA-godkjent biomarkør for prostatakreft deteksjon, er dens nytte kontroversielt som det har vist seg å være upålitelige for sykdom diagnose, og spesielt for å skille lat fra aggressive former av sykdommen [6], [7]. I tillegg er PSA forbundet med en høy grad av falske positive og falske negative testresultater, som nivåer kan være forhøyet i ikke-cancer forhold av prostata, deriblant godartet prostatahyperplasi (BPH). Således er flere biomarkører sterkt behov for noe som kan forbedre den diagnostiske spesifisiteten av PSA og forutsi sannsynligheten for sykdomsprogresjon.
i blod og dets produkter, slik som plasma og serum er ideelle fluider for identifikasjon av kreft biomarkører siden de inneholder proteiner både utskilt og kaster fra kreftceller, kombinert med enkel prøvetaking. Imidlertid er variabel sammensetning og stort dynamisk område av proteiner tilstede i plasma (anslått til å være 10
10 størrelsesordener eller mer), utgjør store utfordringer med å identifisere klinisk relevante biomarkører blant bakgrunn av rikelige proteiner, slik som albumin, immunglobulin og transferrin [8]. Av de 22 eller så mest tallrike proteiner i plasma, disse utgjør mer enn 99% av massen av det totale plasmaproteiner, mens de resterende 1% er antatt å være sammensatt av de mellom /lav overflod proteinene og omfatter de biomarkør bassenget [9 ]. De store størrelsesordener i proteinkonsentrasjonen har hemmet tidligere massespektrometri basert innsats rettet mot å identifisere klinisk relevante biomarkører, hovedsakelig på grunn av en undertrykkelse av ionisering av lav overflod proteiner ved de høyere overflod proteiner [10]. Imidlertid har tidligere fjerning av noen av de mest rikelige proteiner er vist å forbedre deteksjonen av relativt lavere tallrike proteiner [11], [12]. Selv om det er mange forskjellige proteinfraksjonerings metoder basert på forskjeller i molekylvekt, form, ladning, pI, hydrofobisitet og affinitet gjennom spesifikke biomolekylære vekselvirkninger, har det blitt rapportert at høy overflod proteinseparasjon ved hjelp av antistoffbaserte IgY-12 immunodepletion system er svært reproduserbare [13].
Blant proteomikk teknologier som brukes for biomarkør identifikasjon, «isobariske tagger for relative og absolutte kvantitering» (iTRAQ) har fordeler av å være relativt høy gjennomstrømming, og kan samtidig gi informasjon om peptid kvantifisering og identifikasjon som tidligere rapportert av oss og andre [14] – [16]. I korthet, i en typisk arbeidsflyt prøvene er redusert, alkylert og proteolytisk spaltet for å generere peptider. Peptidene er merket med et sett av iTRAQ reagenser (i en 4 eller 8-plex-format), slått sammen og fraksjonert ved sterk kationbytter (SCX). Fraksjonene blir deretter analysert ved væskekromatografi tandem massespektrometri (LC-MS /MS), med de resulterende massespektra, ved å gi sekvensinformasjon (fra peptid-fragmenter), og relativ kvantifisering (fra rapportørgruppen ioner).
i et forsøk på å identifisere nye proteinene forbundet med metastatisk progresjon av human prostatakreft, har vi utført en 4-plex iTRAQ analyse ved hjelp sammenslåtte serumprøver samlet fremadrettet fra 4 godt definerte grupper av pasienter som aktivt ble overvåket i minst 5 år og valgt til å representere spekteret for prostatasykdom. Etter dataanalyse, ble et antall kandidater funnet å være signifikant forskjellig uttrykt i cancerprøver, sammenlignet med benigne prøver. En av kandidatene identifisert som signifikant oppregulert i kreftgruppene var eukaryote oversettelse forlengelse faktor 1 alfa 1 (eEF1A1), og ble ytterligere undersøkt ved immunhistokjemi hjelp prostata vevsprøver fra lokaliserte og metastaserende saker. Den biomarkør fører identifisert i vår «oppdagelse» fase studien, inkludert eEF1A1 drøftes i forhold til deres betydning for prostatakreft progresjon.
Materialer og metoder
Pasienter og serum samling
tilleggs~~POS=TRUNC blod ble samlet prospektivt fra pasienter som deltar på Urologi klinikken ved Royal Hallamshire Hospital på tidspunktet for deres første besøk, etter skriftlig informert samtykke. Blodprøvetakning ble godkjent av etikkomiteen ved University of Sheffield. Serum ble samlet opp ved å la blodet koagulere i 30 minutter, sentrifugert ved 1200 x g i 10 minutter ved 4 ° C og deretter lagret ved -80 ° C i 100 ul aliquoter. Alle blodprøver ble oppsamlet før administrering av en hvilken som helst behandling. Tjue serumprøver ble nøye utvalgt for å representere de ulike stadier og grader av prostata sykdom og sammenslått (n = 5 pasienter /gruppe), for å danne 4 pasientgrupper. Alle pasientene ble aktivt overvåket i minst 5 år fra det tidspunkt de første blodprøvetaking. De 4 pasientgrupper var: Gruppe 1: histologisk diagnose av benign prostatahyperplasi «BPH «, med ingen bevis for kreft ved minst 2 uavhengige sett med prostata- biopsier, og en PSA nivå under 10 ng /ml (gjennomsnittsalder 61 år) . Gruppe 2: histologisk diagnose av prostatakreft med en PSA nivå under 10 ng /ml, og ingen bevis for en stigende PSA etter fem år aktiv overvåking – «non-utvikler» gruppe, (gjennomsnittsalder 67 år); Gruppe 3: histologisk diagnose av klinisk lokalisert kreft med en initiell PSA nivå under 13 ng /ml, etterfulgt av 3 påfølgende økning i PSA-nivå i løpet av 5 år med aktiv overvåking -«progressing «gruppe, (gjennomsnittsalder på 69 år); Gruppe 4: pasienter med PSA 19 ng /ml og bevis på beinmetastaser fra en positiv radionukleotid bein skanning – «metastatisk» gruppe, (gjennomsnittsalder på 73 år). Forskjellene i median alder på pasientene ble funnet ikke å være statistisk signifikant mellom de 4 gruppene (p = 0,146, Kruskal-Wallis test). Sykdommen kjennetegner de 20 pasientene som omfatter de 4 gruppene er vist i tabell S1.
Pasient vevet materiale
microarray (TMA), som består av 56 tilfeller av prostata adenokarsinom varierer i enkelt Gleason karakterer (dvs. klasse 2, n = 5, grad 3, n = 32; klasse 4, n = 9, klasse 5, n = 10), og 40 tilfeller av tilstøtende ikke-ondartet vev, og ble konstruert som tidligere beskrevet [17] , [18]. Ytterligere 23 tilfeller av benbiopsier fra pasienter både med og uten prostatakreft skjelettmetastaser ble oppnådd med 8 mm trephine biopsi utføres under generell anestesi. Informert pasienten samtykke og etikkomiteen godkjenning ble innhentet før studien (Sør Sheffield forskningsetiske komité, SSREC /02/155 og 00/172).
Cellelinjer
Menneskelig prostata kreft cellelinjer LNCaP, PC-3, DU145 og Vcap ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC), (https://www.lgcstandards-atcc.org/). DuCaP celler ble innhentet via PRIMA prosjektet konsortium (https://www.primaproject.org/participants.php). Den LNCaP-Pro5, LNCaP-LN3, PC-3M og PC-3M-LN4 celler var en slags gave fra Dr. Curtis Pettaway (University of Texas, M.D. Anderson Cancer Center), [19]. De LNCaP-c4-2 og LNCaP-C4-2B cellelinjer ble oppnådd fra Prof. George Thalmann [20]. De TE-85 osteosarkom celler var en slags gave fra Prof. J.A. Gallagher, University of Liverpool. Alle prostatakreftcellelinjer ble dyrket som tidligere beskrevet og bekreftet å være fri fra Mycoplasma [15].
IgY-14 affinitet uttømming av serumprøver
Sammenslåtte serumprøver ble tømt av de 14 mest vanlige plasmaproteiner ved hjelp av Seppro IgY-14 uttømming system [21]. Tidligere studier har vist at serum pooling fulgt av uttømming av de mest rikelige proteiner er en effektiv strategi for å redusere det dynamiske området av proteiner, og således øke identifikasjon av serum biomarkører, som demonstrert ved hjelp av den kvantitative proteomikk fremgangsmåte for iTRAQ (R) [ ,,,0],22]. Serumprøver fra 5 pasienter som representerer hver av de 4 pasientgrupper ble samlet i like volumer for å gi et totalt volum på 200 ul i hver gruppe (40 ul av hver prøve). De samlede serumprøver ble sendt på tørris til Genway (Digilabs Biovision, Tyskland), for immun-uttømming bruker Seppro Ig-Y14 system. Gjennomstrømningsfraksjon (utarmet av albumin, immunoglobulin IgG, fibrinogen, transferrin, IgA, IgM, haptoglobin, alfa2-macroglobin, alfa-1-syre-glykoprotein, alfa-1-antitrypsin, Apo AI-HDL, apo A-II HDL, komplement C3 og LDL (ApoB)), ble anvendt for etterfølgende analyse iTRAQ.
iTRAQ prøven merking og SCX fraksjone
Før iTRAQ analyse ble prøver konsentrert og bufferbyttet ved anvendelse av 5 kDa molekylvekt cut-off sentrifuge konsentratorer (Millipore). Prøvene ble bufferen byttet tre ganger mot 500 ul 1 M triethylammoniumbicarbonate (TEAB) buffer og konsentrert til et volum på ca. 80 ul. Prøvene ble merket med iTRAQ reagenser ifølge produsentens instruksjoner, og som tidligere beskrevet [14], [15]. Hver prøve ble merket med en av de fire iTRAQ reagenser (iTRAQ rapportør ioner av 114,1, 115,1, 116,1, 117,1 masse /ladning-forhold). Koden merking ordren var BPH- 117; lokalisert non-utvikler kreft-116; utvikler kreft-115; metastatisk sykdom-114). Merkede Prøvene ble slått sammen og fraksjonert ved sterk kationbytter (SCX), ved anvendelse av en BioLC HPLC-kolonne (Dionex, Surrey, UK), og analysert ved LC-MS /MS som tidligere beskrevet [14], [15].
tandem massespektrometri analyse
massespektrometri (MS) ble utført ved hjelp av en QStar XL hybrid ESI kvadrupol time-of-flight tandem massespektrometer, ESI-QQ-TOF-MS /MS (Applied Biosystems, Framingham, MA, MDS-Sciex, Concord, Ontario, Canada), kombinert med en online kapillær væskekromatografi system (Famos, Switchos og Ultimate fra Dionex /LC emballasje, Amsterdam, Nederland). De tørkede prøver ble resuspendert i 60 liter 3% acetonitril og 0,1% maursyre klar for MS, og 10-15 l (avhengig av peptidkonsentrasjonen som sett i toppintensiteten av SCX kromatogrammet) ble injisert i nano- LC-ESI-MS /MS systemet for hver analyse. Innledende separering fant sted på en PepMap C
18 RP-kapillærkolonne (LC emballasje) med en konstant strømningshastighet på 0,3 l /min. LC buffere A og B ble fremstilt som 3% acetonitril, 0,1% maursyre og 97% acetonitril, 0,1% maursyre, respektivt. Gradienten ble startet som 97% buffer A og 3% buffer B i 3 minutter, etterfulgt av 3 til 25% buffer B i 120 minutter, 90% buffer B i 7 minutter, og til slutt 97% buffer A i 7 minutter. Datainnsamling i massespektrometeret ble satt til den positive ion-modus, med en utvalgt masse området 350-1800 m /z. Tandem massespektrometri ble utført på peptider med 2+, 3+ +4 lade stater over en skanning rekke 65-2000 m /z.
Protein identifikasjon og relativ kvantifisering
Protein identifikasjon og relativ kvantifisering ble utført som tidligere beskrevet [23], [24]. Identifikasjon av peptid forløper og fragmenter ble utført av databasesøk mot Swiss-Prot og Trembl
Homo sapiens
protein database (henholdsvis 41070, 71449 ORF, ned fra Uniprot, mai 2010). Parametere for søk ble satt opp som følger: MS toleranse var 0,4 og MS /MS toleranse ble satt til: peptid toleranse 0.4 Da, lade 2, 3 og 4, min peptid lengde, z-score, max p-verdi og AC poengsum var 6, 6, 10
-6 og 6 hhv. Phenyx standard «turbo» scoring ble aktivert med masse toleranse begrensning på 0,1 Da for MS og MS /MS og den minimale prosentandel av peptidsekvensen dekningen av b
+ (b), b
2 + (b ++), y
+ (y) eller y
2 + (y ++) fragment serien ble satt til standardverdien på 20%. Target databasesøk plass var begrenset til tryptiske peptider med en maksimal av en miscleavage. Modifikasjoner ble satt som: 4-plex iTRAQ masse skift (144 Da, K og N-term), methylthiol (46 Da) og oksidasjon av metionin (16 Da). Falske funnrate (FDR) ble estimert ved hjelp av et sammensatt mål-lokkedue database som beskrevet av Elias og Gygi [25]. Protein endringer ble kvalifisert hjelp av en t-test algoritme utviklet i huset [23].
Immunhistokjemi for eEF1A1
Immunohistochemistry ble utført vesentlig som tidligere beskrevet [18]. Deler av bein og prostata vev ble kuttet (4 m) og montert på Superfrost lysbilder (VWR International, Tyskland). Lysbilder ble inkubert med monoklonalt anti-eEF1A1 antistoff (i Santa-Cruz Biotechnology, CA, USA Cat. N
o sc21758), 0.4 mikrogram /ml i 2% hesteserum over natten ved 4 ° C. Snittene ble vasket to ganger i PBS-Tween 20 (PBST), og inkubert i 30 minutter med anti-mus IgG ImmPRESS HRP (Vector Laboratories, kat. N
o MP-7402). Etter ytterligere vasking i PBST ble lokalisering av antistoff /antigen kompleks visualisert ved hjelp av ImmPACT DAB-systemet (Vector Laboratories, kat. N
o SK-4105). Kontrollsnitt ble inkubert med anti-mus IgG-isotype-kontroll (Vector Laboratories I-2000), fortynnet til 0,4 ug /ml i 2% normalt hesteserum. eEF1A1 farging ble vurdert for både intensitet og cellulær lokalisering av en erfaren histopathologist (Dr. Simon Cross), som ble blindet til studiet. Hvert tilfelle ble tilordnet en fargeintensitet, som strekker seg fra 0-3, hvor 0 = fraværende; 1 = svak; 2 = moderat og 3 = Intens flekker som tidligere beskrevet [18].
Western blotting
Western blotting ble utført vesentlig som tidligere beskrevet [26]. Anti-EF-Tu geit polyklonalt IgG primært antistoff ble anvendt i en konsentrasjon på 1:1000 (Santa Cruz, Cat. N
o. Sc12990). Sekundært antistoff ble HRP-konjugert kanin-anti-geit (Abcam), og ble anvendt i en konsentrasjon på 1:1400 (Abcam). Dual farge presisjon pluss molekylvekt markører ble brukt for størrelse estimering (Bio-Rad, Hertfordshire, UK).
omvendt transkripsjon PCR og sekvense
Total RNA ble ekstrahert fra prostatakreftcellelinjer ved hjelp TRI-reagens (Sigma-Aldrich, UK) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA ble kvantifisert spektrofotometrisk og 2 mikrogram ble revers transkribert til cDNA ved hjelp av Super III revers transkriptase kit med 250 ng av tilfeldige primere, i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen, UK). PCR primere spesifikke for eEF1A1 isoform ble utformet manuelt ved hjelp av Ensembl cDNA sekvens: ENST00000316292 (https://www.ensembl.org/index.html). Den eEF1A1 forover primer-sekvensen var (5′-3 «): TCCTTCAAGTATGCCTGGGTCT (eEF1A1-F1), svarende til nukleotid posisjonene 157-178. Den eEF1A1-revers primer sekvens var: TGGCACAAATGCTACTGTGTCG (eEF1A2-R1), svarer til nukleotidposisjoner 555-576, for å gi en forventet PCR produktstørrelse på 420 bp. Tilsvar PCR primere spesifikke for eEF1A2 isoform ble utformet med Ensembl cDNA sekvens: ENST00000298049. Den eEF1A2-forward primer sekvens var: AGGAGGCTGCTCAGTTCACCT (eEF1A2-F3), tilsvarende nukleotid posisjoner 1004-1024; og den eEF1A2- revers primer sekvens var: CCGCTCTTCTTCTCCACGTTC (eEF1A2-R3), svarende til nukleotid posisjonene 1317-1336, med en forventet PCR produktstørrelse av 334 bp. Primere ble syntetisert ved anvendelse av det kommersielle anlegget på Eurofins MWG Operon (https://www.eurofinsdna.com/products-services/oligonucleotides0.html).
Revers transkripsjon PCR ble utført ved å bruke 1 pl av cDNA fra hver enkelt av cellelinjene, 10 pmol av hver forover /revers-primer og 0,5 ul av AccuPrime Taq DNA-polymerase (Invitrogen, UK), i 20 ul volumer. Termocykling ble utført under følgende betingelser: Innledende denaturering ved 94 ° C i 5 minutter; 30 PCR-sykluser ved 94 ° C i 1 min, 58 ° C i 1 min, og 72 ° C i 1 minutt, og en endelig forlengelse på 72 ° C i 7 minutter. Amplified PCR produktene (10 ul) ble separert på en 2,5% agarosegel inneholdende etidiumbromid, og fotografert ved å bruke GelDoc XR
+ Molecular Imager (Bio-Rad). Band intensiteter ble målt ved hjelp av Antall Én programvare (Bio-Rad).
PCR produktene ble sekvensert ved Genetics kjernefasiliteten, University of Sheffield (https://www.shef.ac.uk/medicine/research /corefacilities/genetics.html). DNA-sekvenser ble visualisert ved hjelp av Chromas Lite versjon 2.01 programvare, fritt lastes ned fra https://www.technelysium.com.au/chromas_lite.html.
Resultater
hierarkisk klyngeanalyse av proteinprofiler
Analyse av 4 sammenslåtte grupper av pasienter identifisert 122 proteiner med tilhørende informasjon om deres relative uttrykk nivåer (tabell S2). Den falske funnrate var 1,4%, som er innenfor det akseptable grensen på 5% [25]. For iTRAQ datasettet, ble 75 unike proteiner identifisert og relativt kvantifisert med ≥2 unike peptider, og disse dataene ble brukt for statistiske analyser for å avgjøre endringer i proteinnivået mellom gruppene. Hierarkisk clustering ble utført for å gruppere dataene basert på graden av likhet mellom de BPH og kreft grupper. Agglomerative clustering bruker squared euklidske avstanden mellom log
10 Verdien av iTRAQ forholdstall og minste intercluster ulikhet sammenhengen prosedyren ble utført (Mathematica 7.0.0 for Mac), for å generere dendrogram vist i figur 1. Et viktig trekk ved dendrogram er separasjon av pasientgrupper i henhold til stadium av sykdommen. Pasienter med metastasering separeres den lengst, og er således ansett å være den mest forskjellig fra pasienter med BPH. Pasientene med BPH gruppert tettere med pasienter i den ikke-utvikler gruppen sammenlignet med framdrift og metastatiske grupper.
Prøver ble gruppert basert på likhet i sine protein uttrykk profiler observert i loggen
10 av iTRAQ-forhold og et dendrogram som genereres for å indikere forholdet mellom prøvene. Squared Euklidsk avstand mellom klynger (single kobling) er vist. Varierende lengder av forgreningspunktene indikerer graden av likhet; jo kortere gren jo høyere grad av likhet.
Gene ontologi merknad
For å vurdere omfanget av proteiner identifisert, genet ontologi (GO) merknader for biologiske prosesser ble tildelt bruker protein analyse gjennom evolusjonære relasjoner (PANTHER) programvare, som forbinder protein tiltredelses koder til de tilsvarende oppføringene i genet ontologi databasen [14], [27]. PANTHER- analyse viste tilstedeværelse av mange vanlige plasmaproteiner slik som de er knyttet til komplementformidlet immunitet (14%), immunitet og forsvar (27%), proteolyse (21%), blodpropp (7%), og proteinmetabolisme og modifisering (22%).
for den biologiske analysen nettverk, den Metacore plattformen (GeneGo, Inc., St. Joseph, MI) ble anvendt som tidligere beskrevet [14], noe som viste at mange av de differensielt uttrykte proteiner som C4, C4a, C5, C5b, C9 og C6 kartlagt til den klassiske immunrespons pathway (figur S1).
diagnose~~POS=TRUNC biomarkør fører
Forskjeller i protein nivåer er rapportert etter en t -test-analyse som tidligere beskrevet [23]. P-verdiene ble beregnet på grunnlag av antallet peptider som benyttes for kvantifisering og variansen til iTRAQ rapportør prosenter avledet fra disse peptidene. En p-value≤0.01 ble brukt for å bestemme signifikante forandringer i proteinnivåer mellom prøvesettene. Viktigere, protein endringene rapportert som betydelig differensial uttrykk ble valgt basert på statistisk signifikans fremfor ganger endring [28]. Noen av disse forskjellene er forventet å være potensielt større på grunn av det som er kjent under anslag forbundet med iTRAQ basert kvantifisering [24].
I vår analyse var vi er interessert i proteiner som viser både økt og redusert uttrykk nivåer, som tidligere studier har rapportert at både betydelig opp- og ned-regulerte proteiner kan være av klinisk betydning [15], [29].
identifisering av proteiner forskjellig uttrykt i ikke-framdrift, framdrift og metastatisk pasientgrupper i forhold til BPH gruppe var av interesse da disse kan gi fører til potensielt nyttige diagnostiske og prognostiske biomarkører (Tabell S3). Således, en sammenligning mellom det ikke utvikler kreft gruppe versus BPH gruppen viste en signifikant differensial ekspresjon av 22 proteiner; 7 av disse ble oppregulert og 15 nedregulert (tabell S3a). Tilsvarende vil en sammenligning mellom framdrift pasientgruppen versus BPH gruppen identifisert differensial uttrykk for 19 proteiner; 11 av disse viste signifikant over-uttrykk og 8 viste nedregulering (tabell S3b). Sammenligninger av metastatisk pasientgruppen versus BPH gruppen identifisert differensial uttrykk for 35 proteiner, med 19 proteiner som viser betydelig over-uttrykk og 16 viser betydelig nedregulering (tabell S3c). I tillegg ble C-reaktivt protein (CRP) funnet å være forhøyet 41,1 fold i serum hos pasienter med metastatisk sykdom sammenlignet med pasienter med BPH (tabell S2).
Prognostic biomarkør fører
Når en diagnose av kreft har blitt gjort av de neste trinn er å bestemme utstrekning (stadium) av sykdom, i et forsøk på å forutsi de pasienter hvor sykdommen sannsynligvis vil utvikle seg fra pasienter der sykdommen sannsynligvis vil forbli lokalisert, og å skaffe prognostisk informasjon. Foreløpig er før behandling PSA nivåer, biopsi Gleason grade og klinisk staging brukes til å gi prognostisk informasjon; imidlertid er disse parameterne assosiert med en rekke begrensninger. Således, en sammenligning av pasienter med framdrift versus ikke-utvikler sykdom identifisert betydelig differensial ekspresjon av 25 proteiner; 13 oppregulert og 12 nedregulert (tabell S4).
Differensial protein nivåer forbundet med sykdomsprogresjon
I tillegg til sammenligninger ovenfor, protein forskjeller ble kartlagt i henhold til det stadiet av prostata kreftutvikling og progresjon dvs. som kreften utviklet seg fra ikke-ondartet epitel og kommet til lokalavansert eller metastatisk sykdom (figur 2). Listene over forskjellene er basert på sammenligninger mellom den ikke-progresjon versus BPH gruppe; framdrift versus ikke-framdrift gruppe; og metastatisk versus utvikler kreftgrupper. Fra figur 2, er det tydelig at de enkelte proteiner, «parene «av proteiner og» paneler «av proteiner (definert som ≥3 proteiner), ble sett å bli uttrykt forskjellig på visse sykdomsstadier utvikling og progresjon. For eksempel, ble individuelle proteiner som alfa-2-makroglobulin, lumican og serum amyloid P-komponent sett å bli uttrykt forskjellig mellom de ikke-progresjon versus BPH gruppe. Andre proteiner som beta-2-glykoprotein 1 og somatomedin-B (blå skrift), ble begge sett til å være forholdsvis redusert som en «par» i framdrift versus ikke-utvikler prøvene, mens både Apolipoprotein A-1V og Komp komponent 4B var sett å bli relativt økt i uttrykk i metastatisk prøver versus framdrift prøver (oransje skrift). I tillegg to «paneler», ble sett endres som sykdommen utviklet seg og kommet. Den første panel bestående av 3-proteiner: afamin, alfa-2-HS-glykoprotein kjeden B og fibronektin 1 (vist i rød skrift), og ble sett til å være forholdsvis øket i ekspresjon i den ikke-progresjon versus BPH-gruppen, men redusert som kreft kommet og holdt seg relativt lavt som kreft spredning. Det andre panel bestående av 7-proteiner: alfa-1-antichymotrypsin; cDNA FLJ55673, svært lik utfylle faktor B; cDNA FLJ54228, sterkt ligner på leucin-rik alfa-2-glykoprotein; cDNA FLJ58564, svært lik plasma protease C1-hemmer; Ceruloplasmin, Komp C5 og Komp komponent C9b (grønn skrift), og ble sett på som relativt redusert i uttrykk i den ikke-utvikler gruppen sammenlignet med BPH gruppe, og relativt økt i uttrykk som kreft kommet dvs. ble relativt økte i framdrift gruppe og forble forhøyet i metastatisk gruppen
listen over differensielt uttrykte proteiner som vises er basert på sammenligninger mellom ikke-framdrift versus BPH.; framdrift versus ikke-framdrift og metastatisk versus framdrift grupper. Merk differensial uttrykk av proteiner enten individuelt (svart skrift), som par (blå, oransje og lilla skrifter), eller som et panel (≥3 proteiner, grønn og rød fonter). (*) = Identifisert som en enkelt høy tillit peptid.
Interessant, eukaryote oversettelse forlengelse faktor 1 alfa 1 (eEF1A1), (aka EF-Tu), ble sett å vise betydelig økt uttrykk i ikke -progressing kreft i forhold til BPH, og dens ekspresjon ble ytterligere øket med sykdomsprogresjon, og ble opprettholdt i løpet av metastaser (tabell S2 og figur 2). eEF1A1 var toppen hit etter blastp søk på VETGVLKPGMVVTFAPVNVTTEVK peptid identifisert i serumprøver. Sammenligning av den fulle lengde aminosyresekvensen av eEF1A1 med sin isoform eEF1A2, indikerte at peptidsekvensen var unik for eEF1A1. Den tilsvarende peptid i eEF1A2 avviker med en enkelt aminosyre, hvor valin er substituert med isoleucin. Siden disse aminosyrer har en 14 Da forskjell i molekylvekt kunne vi trygt tildele identifisert peptid å tilsvare eEF1A1 isoform.
Bekreftelse av kandidatene identifisert av iTRAQ
For å bekrefte differensial uttrykk for kandidat proteiner identifisert av iTRAQ, vi senere utførte en 1D-gel elektroforese ved hjelp av sammenslått serum fra de 4 pasientgrupper. Etter farging med Coomassie-blått, ble et svakt bånd visuelt sees å være til stede på et litt høyere intensitet i prøver fra pasienter med metastatisk sykdom i forhold til de andre 3 grupper av pasienter (data ikke vist). Dette bånd ble skåret ut fra gelen, spaltet med trypsin, og de resulterende peptidene ble analysert ved LC-MS /MS. De massespektrometri data identifisert 7 peptider matchende til CRP med en sekvens dekning på 27,6%, og bekreftet iTRAQ data.
