Abstract
Bakgrunn
Esophageal plateepitelkarsinom (ESCC) har dårlig prognose. Mens kombinert modalitet av kjemoterapi og strålebehandling øker overlevelse, de fleste pasienter dø innen fem år. Utvikling av agenter der det gis kreftcellespesifikke kjemo- og radiosensitiviteten kan forbedre behandlingen av ESCC. Vi her rapporterte oppdagelsen av berberine som en potent radiosensitizing agent på ESCC celler
hovedfunnene
Berberine ved lave konsentrasjoner. ( 15 mm) vesentlig radiosensitized ESCC celler. X-ray indusert DNA dobbel-tråd pauser (DSB sin) vedvare lenger i ESCC celler forbehandlet med berberine. Berberin forbehandling førte til en betydelig nedregulering av RAD51, en nøkkelspiller i homolog rekombinasjon reparasjon, i ESCC celler, men ikke i ikke-ondartede humane celler. Nedregulering av
RAD51
av RNA-interferens på lignende måte radiosensitized kreftceller, og omvendt, innføring av eksogent RAD51 var i stand til i betydelig grad å motvirke den radiosensitizing effekten av berberin, og dermed etablere RAD51 som en viktig determinant i strålefølsomhet. Vi observerte også at RAD51 ble ofte overuttrykt i menneskelige ESCC vev, noe som tyder på at det er nødvendig å nedregulere RAD51 å oppnå høy radio- eller kjemoterapeutiske effekten av ESCC i klinikken, fordi overekspresjon av RAD51 er kjent for å gi radio- og chemoresistance.
Konklusjon /Betydning
Berberine effektivt kan nedregulere RAD51 i overdragelse Radiosensitivity på esophageal kreftceller. Dens klinisk anvendelse som en adjuvant kjemoterapi og strålebehandling av esophageal kreft bør utforskes
Citation. Liu Q, Jiang H, Liu Z, Wang Y, Zhao M, Hao C, et al. (2011) Berberine Radiosensitizes Menneskelig Esophageal kreftceller ved Downregulating homolog rekombinasjon Repair Protein RAD51. PLoS ONE 6 (8): e23427. doi: 10,1371 /journal.pone.0023427
Redaktør: Qian Tao, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 21 desember 2010; Godkjent: 17 juli 2011; Publisert: 08.08.2011
Copyright: © 2011 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble finansiert av National Natural Science Foundation i Kina; Ministry of Science and Technology i Kina. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Esophageal plateepitelkarsinom (ESCC), som har en spesielt høy forekomst i østasiatiske land, vanligvis har dårlig prognose. Bare en 4% 5-års overlevelse ble registrert med kirurgisk behandling [1]. Strålebehandling hadde et lignende resultat [2]. Overlevelsesraten for pasienter med ESCC kan bli betydelig forbedret med kombinert kjemoterapi og strålebehandling [3], [4]. En økning av stråledosen ikke gir mer tilfredsstillende resultater [5]. Det er fortsatt nødvendigheten av å utvikle midler der det gis kjemoterapi og radiosensitiviteten selektivt på kreftceller og samtidig ha minimal stråling giftighet for normale celler. Selv om forskjellige bestrålingssensibilisatorer er testet, inkludert midler som er rettet mot DNA eller ikke-DNA-mål, forblir den ideelle bestrålingssensibilisator å bli oppdaget [6].
Berberine, hovedkomponenten i alkaloid Huang Lian og andre medisinske urter , er den mest brukte medisin for gastrointestinal ubehag i Kina. Foruten sin vanlige bruk som en daglig medisin, har en rekke laboratorieforsøk vist at berberin har antitumoraktivitet for en lang rekke kreftceller, inkludert glioblastom [7], oral cancer [8], hepatom [9], magekreft [10 ], prostatakreft [11], leukemi [12] og osteosarkom [13]. I de fleste tilfeller ble berberin funnet å inhibere cellesyklusprogresjon og for å indusere apoptose. En ny studie viste at berberin var i stand til å undertrykke konstitutiv aktivering av NF-kB i enkelte kreftceller [14], der det ble funnet å direkte inhibere IKB-kinase (IKK) aktiveringen, som fører til undertrykkelse av fosforylering og nukleær translokasjon av p65 . Berberine ble også rapportert å ha en radiosensitizing effekt på lunge kreftceller ved å fremkalle autofagi [15]. I tillegg kan berberine svekke tumorvekst ved å hemme angiogenese [16].
Vi har tidligere vist at berberine kan hemme kreftcelle spredning ved å indusere DNA dobbel-tråd pauser (DSB sin). Berberin, som avgir et gulaktig fluorescens, ble funnet å være mer intensivt akkumulert i kjernen av osteosarcom-celler enn i de normale osteoblaster, og denne differensial opphopning av berberin korrelerer til sin vekst-inhibitorisk effekt, til induksjon av DNA-skade, og senere til aktivering av p53 og cellesyklus-stans [13]. Derfor er det signaltransduksjonsbane underliggende antitumoreffekt av berberin er sannsynligvis lik de som initieres av andre DNA-skadende midler slik som cisplatin. En fersk rapport viser at kines kan opp-regulere p53 ved å forstyrre de MDM2-DAXX-HAUSP interaksjoner og fremme MDM2 selv ubiquitinering og degradering [17].
Vi her rapporterer at berberine ved lave konsentrasjoner kan betydelig radiosensibilisere ESCC celler. Vi demonstrerte at radiosensitizing effekten av berberin er formidlet ved nedregulering av
RAD51
, som koder for et protein kritisk i homolog rekombinasjon reparasjon. I tillegg observerte vi at
RAD51
ble vanlig over-uttrykt i humane ESCC vev, noe som indikerer at det er nødvendig å nedregulere RAD51 å oppnå høy radio- eller kjemoterapeutiske effekten av ESCC i klinikken, fordi overekspresjon av
RAD51
er kjent for å gi radio- og chemoresistance.
Resultater
Berberine sensitizes esophageal kreft celler til ioniserende stråling
Som tidligere rapportert for andre typer kreftceller, berberin behandling alene hadde en vekst-inhibitorisk effekt på esophageal kreftceller i en dose- og tidsavhengig måte (fig. 1A). Sammenlignet med humane normale fibroblaster (HNF), ESCC celler er mer følsomme for berberine. Ved 72 timer, IC50 for ESCC celler KYSE450 (12,58 mm), var omtrent en fjerdedel av den for HNF (51,28 mm) (Fig. 1B). Ved lave konsentrasjoner ( 15 mm), berberine hadde en relativt lav toksisitet for ESCC celler og indusert noen påviselig apoptose (figur 1C.). Imidlertid ESCC celler som ble forbehandlet med lave konsentrasjoner av berberin oppviste en betydelig økt følsomhet overfor ioniserende bestråling, som reflekteres av bemerkelsesverdig reduksjon i sin evne til å danne kolonier (fig. 2). Berberin forbehandling (15 uM i 24 timer) reduserte SF2 (overlevende fraksjon på 2 Gy) av KYSE30 celler til 48,1 ± 0,6%, fra 77,2 ± 1,2% i celler som ikke var forbehandlet med berberin. En andre ESCC linje KYSE450 viste en lignende respons, med SF2 redusert til 50,2 ± 2,1% når cellene ble forbehandlet med berberin på 15 uM i 48 timer, sammenlignet med 81,2 ± 2,6% for celler som ikke er forbehandlet med berberin. I kontrast, berberine hadde ingen radiosensitizing effekt på humane normale fibroblaster (fig. 2).
(A), Effekt av berberine på levedyktigheten til KYSE30, KYSE450 og HNF celler. Cellelevedyktigheten ble bedømt ved MTT-analyse. Celler ble behandlet med DMSO eller de indikerte konsentrasjoner av berberin i 24 timer, 48 timer og 72 timer. Resultatene ble representert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (B), Cytotoksisitet av berberin mot KYSE30, KYSE450 og HNF celler representert av inhiberende konsentrasjon IC50. (C), Måling av apoptose ved Western blot-analyse av caspase-3. KYSE30 og KYSE450 celler ble behandlet med berberin i henholdsvis 24 timer og 48 timer,. Paclitaxel behandlet HL-60 og HeLa celler som positiv kontroll.
(A), bestrålingssensibilisering av berberine av klonogene celle overlevelse analyse. KYSE30 og KYSE450 celler ble utsatt for berberin (15 uM) eller bærerkontroll (DMSO) for henholdsvis 24 og 48 timer, før de ble bestrålt og belagt. Normalt humant fibroblast-celler ble behandlet med berberin i 24 timer og 48 timer før de ble eksponert for røntgenstråler. Datapunkter er gjennomsnitt av to uavhengige eksperimenter hver belagt i tre eksemplarer; barer, SE. (B), SF2 verdier etter behandling med berberine. Nedgang i SF2 verdier indikerer radiosensitizing effektene av berberine.
Berberine forbehandling forlenger utholdenhet av stråling-indusert DSB sin
Ioniserende stråling dreper celler ved å påføre ulike typer skader genomet . Vi spekulert i at radiosensitizing effekten av berberine på kreftceller kan være forårsaket av verdifall i reparasjon av DNA dobbel-tråd pauser (DSB sin). Vi har fastslått derfor nivåene av DSB ved immunofluoresence farging av γ-H2AX foci i ESCCs ved ulike tidspunkt etter eksponering for røntgenstråler. Som vist på fig. 3A, i KYSE30 celler ikke forbehandlet med berberin, ble mesteparten av y-H2AX foci erte ved 12 timer etter eksponering overfor 0,5 Gy av røntgenstråler, og det gjennomsnittlige antall γ-H2AX foci sunket til i nærheten av basalnivå på 24 timer. I kontrast, mer γ-H2AX foci vedvarte ved disse to tidspunkter i KYSE30 celler som ble forbehandlet med berberin (15 uM). Det gjennomsnittlige antall γ-H2AX foki pr celle i celler som mottar det kombinerte berberin /strålebehandlingen var signifikant høyere sammenlignet med den strålings eneste gruppe ved 12 og 24 timer tidspunkter (fig. 3B) (
P =
0,002 og
P
0,001, henholdsvis). Berberine behandling alene ble ikke observert å indusere åpen DNA-skade i form av γ-H2AX foci induksjon lignet med ubehandlede kontroller (
P
= 0,081).
(A), immunfluorescens farging av γ-H2AX i KYSE30 celler. (B), Oppsummering av γ-H2AX foci i KYSE30 cellene ved ulike tidspunkt etter ulike behandlinger. (C), Oppsummering av γ-H2AX foci i KYSE450 celler ved forskjellige tidspunkt etter forskjellige behandlinger. Kolonner, hjelp av tre uavhengige forsøk. Celler som vokser på dekk i 6-brønners plater ble utsatt for berberine (15 mm) for 24, bestrålt (0,5 Gy), og fikset på de angitte tidspunkter for immunfluorescens analyse.
KYSE450 celler viste også en forsinket avstand av røntgen-indusert γ-H2AX foci når de ble forbehandlet med berberin. Mens mesteparten av y-H2AX foci ble tømt i kontrollcellene ved 24 timer etter eksponering for røntgenstråler, mer enn halvparten av den γ-H2AX foci vedvarte i celler som ble forbehandlet med berberin (Fig. 3C). Disse resultatene tyder på at kines forbehandling svekket reparasjon av røntgen-indusert DSB sin.
Berberine nedregulerer RAD51 i kreftceller, men ikke i ikke-ondartede celler
DSB sin primært reparert av to veier, dvs. non-homolog ende sammenføyning og homolog rekombinasjon [18], [19], [20]. Ku70 og Ku86 er avgjørende for det tidligere, hvor som RAD51 er en sentral aktør i det siste. Vi neste fastslått om nivåene av disse tre proteiner ble endret i esophageal kreft celler forbehandlet med berberine. Vi har observert at mens det var ingen åpenbare endringer i nivåene av Ku70 og Ku86, ble nivået av RAD51 protein bemerkelsesverdig redusert i ESCCs som ble behandlet med berberin i 24 timer eller 48 timer ved 7,5 uM eller 15 uM (fig. 4A). Nivået av
RAD51
mRNA viste en signifikant reduksjon både i kreftcellelinjer etter behandling med berberin (Fig. 4B), som antyder at den nedregulering av RAD51 var sannsynligvis på grunn av redusert transkripsjon av
RAD51
mRNA.
(A), nivåene av DNA reparasjon proteiner i esophageal kreftceller behandlet med berberine. Celler ble behandlet med berberin ved de angitte konsentrasjoner, og for den angitte varighet før celler ble fremstilt for celleekstrakter. (B), Nedgang i
RAD51
mRNA nivåer etter berberine eksponering. Celler ble utsatt for berberin (15 uM) i 24 timer for KYSE30 celler (48 h for KYSE450 celler), og samles for kvantitativ real-time PCR-analyse av den RAD51 /GAPDH-mRNA-forhold. (C),
RAD51
promoter aktivitet ble undertrykt av berberine i KYSE30 og KYSE450 celler. De pGL3-RAD51p luciferase (Firefly) reporter plasmider ble transient transfektert inn i menneskelige esophageal kreftceller. Fire timer senere ble cellene behandlet med berberin i 24 timer, og deretter analysert for luciferase-aktivitet. Ildflue luciferase-verdier ble normalisert til Renilla luciferaseaktivitet fra en ko-transfektert PRL-SV40 kontroll vektor. Hver verdi representerer den gjennomsnittlige SE for tre uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble utført med uparede Student
t-test. *
, P 0,05 sammenlignet med kontrollverdier. (D), mangel på RAD51 nedregulering i ikke-ondartede celler. Celler ble utsatt for berberine (15 mm) for den angitte tidsperioden og samlet for immunoblot analyse. (E), nedregulering av RAD51 i andre typer kreftceller. Celler ble utsatt for den utpekte berberin konsentrasjonen i 48 timer og oppsamlet for immunoblot-analyse. De immunoblot som er vist i A, D, og E er representative for minst to uavhengige forsøk med GAPDH tjener som et protein lastekontroll. C indikerer kulturer eksponert for bærerkontrollen DMSO.
ekspresjon av RAD51 er kjent for å være cellesyklusavhengig og er høyere ved S og G2 /M-fasene enn ved G0 /G1 fase [21] [22]. For å avgjøre om redusert uttrykk for RAD51 var på grunn av endring i cellesyklus distribusjon i berberine-behandlede celler, vi utsatt berberine behandlede celler til flowcytometri analyse. Mens berberin behandling (15 uM i 24 timer) reduserte prosentandelen av KYSE30 celler ved S og G2 /M til 49% fra 60% i kontroll (data ikke vist), slik forandring var ikke nok til å gjøre rede for mange gangers reduksjon i nivået av RAD51 uttrykk. Enda viktigere, berberin behandling (15 uM i 24 timer) ikke vesentlig endre fordelingen av cellesyklusfordelingen av KYSE450 celler (44% og 45% for prosentandelen av celler i S-G2 /M-fasene i kontroll og behandlet gruppe, respektivt ), noe som indikerer at reduksjon av RAD51 ekspresjon som reaksjon på berberin er ikke på grunn av redusert størrelse populasjon av celler ved S og G2 /M-fasene. Dermed blir nedregulering av RAD51 i respons til berberin er sannsynligvis uavhengig av uttrykket endringer som er assosiert med cellesyklusprogresjon.
Overekspresjon av
RAD51
er ofte forbundet med en økning i dets promoter-aktivitet [23]. Vi klonet ved siden av promoteren og den 5’end regionen
RAD51 plakater (-1693 til 487 bp) inn i et luciferase reporter plasmid, pGL3-basisvektor, transfektert dem inn i spiserøret kreftceller, og testet
RAD51
promoter aktivitetsnivået til berberine behandling. Som vist på fig. 4C, promotoren aktiviteten til
RAD51
var signifikant redusert i celler som ble behandlet med berberin når sammenlignet med kontrollen. Sammen utgjør disse resultatene viste at kines var i stand til å nedregulere uttrykket av
RAD5
1 i esophageal kreftceller på transkripsjonsnivå.
Fordi RAD51 er en sentral aktør i homolog rekombinasjon reparasjon, sin downregulation kunne bidrar til Radiosensitivity av ESCC celler forbehandlet med berberin. Siden berberine hadde ingen radiosensitizing effekt på HNF, spekulerte vi at RAD51 nivået ikke kan bli påvirket av berberine behandling i HNF. Vi først undersøkte basale nivåer av RAD51 i flere ikke-ondartede cellelinjer inkludert HNF. Som vist på fig. 4D, nivåene av RAD51 var mye lavere i HNF, HMSC (human stamceller hentet fra navlestreng) og XWXL (fibroblaster avledet fra en godartet fibroadenoma) enn de i ESCC celler. Interessant, menneskelige umbilical vaskulære endotelceller (HUVECs) og HEK-293 celler også uttrykt høye nivåer av RAD51. Men i motsetning til ESCC celler, ingen av de fire typer av ikke-ondartede celler viste en nedregulering i RAD51 uttrykk på berberine behandling (fig. 4D).
For å avgjøre om nedregulering av RAD51 av berberine gjelder for andre typer av kreftceller, vi også utsatt humane brystcancerceller MCF7 humane osteosarkomceller U2OS, mus prostatakreftceller RM-1 og mus lungekreftceller LLC til lave konsentrasjoner av berberin i 48 timer og målte proteinnivået av RAD51. Som vist på fig. 4E, RAD51 ble nedregulert i alle de fire kreftcellelinjer som ble testet, noe som tyder på at nedregulering av RAD51 av berberine er ikke unikt for ESCC celler. Sammen utgjør disse resultatene tyder på at ulike typer celler kan reagere forskjellig på berberine behandling i form av regulering av RAD51 uttrykk.
oppregulering av RAD51 av IR kan dempes ved berberine
Vi observerte at ioniserende stråleindusert en oppregulering av RAD51 i ESCC celler (fig. 5A). I overensstemmelse med økningen av RAD51 på proteinnivå, nivå av
RAD51
mRNA ble øket i ESCC celler som hadde vært utsatt for IR (data ikke vist). Dette funnet er i samsvar med en tidligere rapport av RAD51 induksjon ved IR- i glioma-celler [24]. Fordi IR kan oppregulere uttrykk for
RAD51
, neste testet vi om berberine forbehandling kan motvirke denne effekten av IR. De ESCC Cellene ble først behandlet med berberin, deretter med IR og nivået av RAD51 ekspresjon ble målt. I motsetning til heving av RAD51 i celler som ble behandlet med IR alene, berberin forbehandling effektivt svekkes den oppregulering av RAD51 indusert ved IR (Fig. 5B), som indikerer at berberin var i stand til å overvinne den oppregulering av RAD51 indusert av IR. Ikke bare var det en reduksjon i total proteinnivå, ble dannelsen av RAD51 foci som respons på IR sterkt hemmet av berberin (fig. 5C). Den nedregulering av RAD51 av berberin ble igjen reflektert ved transkripsjon nivå (fig. 5D).
(A), Radiation forbedrer RAD51 ekspresjon i tumorceller. Celler ble utsatt for de angitte doser av stråling og samlet 24 timer senere for immunoblot-analyse. (B), Endring av RAD51 protein nivåer i respons til berberine og stråling. Celler ble forbehandlet med berberin (15 uM) i 24 timer før den ble bestrålt med 6 Gy av røntgenstråler. Celler ble oppsamlet for immunoblotanalyse ved 24 timer etter bestråling. (C) Inhibering av strålings-induserte RAD51 foci dannelse av berberin. Vist er immunfluorescens bilder av KYSE30 og KYSE450 celler farget med anti-RAD51-antistoff etter 24 timer av forbehandling med berberin og ved 24 timer etter bestråling med 6 Gy av røntgenstråler. DAPI kontra viste kjernene. (D),
RAD51
mRNA nivåer etter forbehandling med berberine (15 mm) i 24 timer (KYSE30) eller 48 timer (KYSE450) før bestråling med 6 Gy. Celler ble samlet opp for kvantitativ real-time PCR analyse av RAD51 /GAPDH mRNA-forhold på 24 timer etter eksponering til 6 Gy av røntgenstråler. Immunoblotter og mRNA uttrykk verdier er representative for minst to uavhengige forsøk.
RAD51 downregulation av RNAi radiosensitizes kreftceller
Fordi kines kan påvirke mange cellulære trasé som er involvert i celledeling og overlevelse, kan det ikke utelukkes at andre enn nedregulering av RAD51 trasé var ansvarlig for radiosensitizing effekten av berbeirne. For å demonstrere at det er nedregulering av RAD51 som er ansvarlig for denne effekten av berberine, vi neste utarmet RAD51 i esophageal kreftceller ved RNAi og testet deres Radiosensitivity. Som vist på fig. 6A,
RAD51
uttrykk kan være effektivt brakt til taushet av siRNA spesielt rettet mot
RAD51
i begge cellelinjer. I tillegg ble den spontane dannelse av foci RAD51 sterkt redusert (fig. 6B). Som forventet, uttømming av RAD51 førte til en betydelig reduksjon i den klonogene celleoverlevelse for begge esophageal kreftcellelinjer (Fig. 6C). Den SF2 ble redusert til 33,3 ± 0,4% i RAD51-RNAi KYSE30 celler fra 78,4 ± 1,2% i kontroll. KYSE450 celler viste en tilsvarende reaksjon på RAD51 uttømming. Dermed blir radiosensitizing effekten av berberin på esophageal celler ble først og fremst formidlet ved nedregulering av RAD51.
(A), nedregulering av RAD51 ved siRNA. RAD51 proteinnivåer ble målt ved Western blot. KYSE30 og KYSE450-celler ble transfektert med siRNA duplekser (200 nm) som er spesifikke for
RAD51
eller negativ oligo i serumfritt medium i 4 timer, deretter erstattet med fullstendig medium i 24 timer. Hele celleekstrakter ble samlet for western blot analyser ved anvendelse av RAD51 antistoffer. (B). Redusert dannelse av stråling-indusert RAD51 foci i esophageal kreftceller der
RAD51
ble brakt til taushet av RNAi. Celler ble eksponert for 6 Gy av røntgenstråler ved 28 timer etter transfeksjon med siRNA duplexer. (C) Effekt av RAD51 knockdown på Radiosensitivity av esophageal kreftceller som bestemt ved klonogene overlevelsesanalyse. (D), Western blot-analyse av RAD51 protein i kreftceller som er transfektert med pcDNA3.1 eller pcDNA3.1B-mRAD51. De immunoblotter vises er representative for to uavhengige eksperimenter med GAPDH tjene som et protein lasting kontroll (KYSE30 /KYSE450 forelder cellelinje, KYSE30 /KYSE450 (pcDNA3.1) celler stabilt transfektert med pcDNA3.1, KYSE30 /KYSE450 (mRAD51) celler stabilt transfektert med pcDNA3.1B-mRAD51). (E), Effekt av RAD51 overekspresjon på Radiosensitivity av esophageal kreftceller som bestemmes av klonogene overlevelse analyse. Resultatene for cellene transfektert med mRAD51 eller pcDNA3.1 vektor behandlet med berberine ble sammenlignet (* P 0,01).
Innføring av eksogene RAD51 motvirker radiosensitizing effekten av berberine
for ytterligere å validere rolle RAD51 som en sentral aktør i formidling av radiosensitizing effekten av berberine, gjorde vi en konstruksjon som uttrykker murine RAD51 under CMV arrangøren, pcDNA3.1B-mRAD51, og hadde ESCC celler stabilt transfektert. Ekspresjon av eksogene RAD51 var tydelig i celler transfektert med mRAD51, som vist ved Western blot (Fig. 6D). Viktigere, den radiosensitizing effekten av berberine ble betydelig svekket i både KYSE30 og KYSE450 cellelinjer som ble transfektert med mRAD51 (Fig. 6E). Disse resultatene, sammen med de som oppnås med RAD51-RNAi, viste at RAD51 er en kritisk faktor for radioresistance i ESCC celler.
RAD51 overekspresjon er vanlig i esophageal kreft vev
oppregulering av
RAD51
uttrykk som er vanlig i tumorcellelinjer [25] og i en rekke humane ondartede sykdommer [26], [27], [28]. Vi evaluerte neste
RAD51
uttrykk nivå i et panel av 86 humane primære esophageal plateepitelkarsinom vev ved immunhistokjemisk farging. Nuclear og /eller cytoplasma farging av RAD51 ble påvist i 81 av 86 prøver. I prøvene som utviser positiv farging av RAD51 ble subcellulære fordeling og intensitet varieres. Intensitet ble scoret som en i 29, to i 43, og tre i 9. Seks prøver viste dominerende nukleær farging, 30 prøver viste dominerende cytoplasma flekker, og 45 prøver viste både cytoplasma og nukleær farging (Fig. 7A-E). I kontrast,
RAD51
uttrykk var lav eller fraværende i normalt vev rundt karsinom (Fig.7F). Men vi fant ingen sammenheng mellom RAD51 uttrykk nivåer og clinicopathological parametre i ESCCs (tabell 1). Likevel, våre resultater viste at RAD51 er ofte overuttrykt i ESCC prøver. På grunn overekspresjon av RAD51 overfører vanligvis resistens mot midler som skader DNA [29], [30], [31], våre resultater krever tiltak som nedregulere RAD51 for å oppnå høy radio- eller kjemoterapeutisk effekt av ESCCs i kliniske omgivelser. Interessant, berberin behandling også nedregulert RAD51 i ytterligere tre spiserørskreft cellelinjer (KYSE410, EC109, og TE-1), som i KYSE30 og KYSE450 celler (data ikke vist), noe som tyder på at berberin kan gjengi radiosensitizing effekt til en bred rekke esophageal kreftceller.
Bilder av viser forskjellige uttrykk nivå og cellefordeling vises. (A), fravær av RAD51-spesifikk farging (blå kjerner på grunn av Mayer Hemalum kontra). (B), lave nivåer av RAD51 i cytoplasma, men ikke i kjerner, av invasive karsinomceller. (C), med en middels RAD51 både i cytoplasma og kjerner av invasive karsinomceller. (D), høye nivåer av RAD51 i cytoplasma, men ikke i kjerner, av invasive karsinomceller. (E), høye nivåer av atom RAD51 i kjernen av invasive karsinomceller. Ingen farging cytoplasma er tydelig. (F), fravær av farging RAD51 i normal esophageal vev. Immunhistokjemi ble gjort som i materialer og metoder. Alle originale bildene ble tatt ved × 400 forstørrelse.
Diskusjoner
Vi demonstrerte for første gang at berberine kan effektivt downregulate RAD51 uttrykk i kreftceller i overdragelse Radiosensitivity. Berberine behandling førte til en reduksjon i
RAD51
transkripsjon og en hemming av
RAD51
promoter aktivitet. Det kan også overvinne oppregulering av RAD51 som er indusert av ioniserende stråling (IR). Den radiosensitizing effekten av berberine ble svekket i kreftceller som overuttrykker eksogene RAD51. Nedregulering av RAD51, som er avgjørende for homolog rekombinasjon reparasjon, i stor grad svekket reparasjon av DSB sin indusert ved IR- og førte til dårlig overlevelse av IR-behandlede celler. Viktigere, observerte vi at RAD51 ble ofte oppregulert i menneskelige ESCC vev, noe som kan gjengi motstand mot terapi som er rettet mot DNA. Derfor kan administrering av berberin som en radio- og chemosensitizer tjene som en strategi ved behandling av ESCC pasienter.
Oppregulering av RAD51 i kreftceller ble vist å være assosiert med økt chemoresistance [29], [30] . Flere tidligere studier har også vist at noen anti-kreft narkotika gjengi kreftceller radiosensitive og kjemosensitiv av downregulating RAD51 og dermed svekke homolog rekombinasjon reparasjon i kreftceller. For eksempel, imatinib (Glivec), som hemmer c-Abl tyrosin kinase, effektivt kan redusere ekspresjonen av RAD51 i kreftceller og gi Radiosensitivity [24], [32]. Gefitinib, en selektiv epidermal vekstfaktor-reseptor-tyrosinkinase-inhibitor, ble funnet å nedregulere RAD51 i lungekreftceller og sensibilisere dem til mitomycin C [33] og gemcitabin [34]. Fenyl hydroksamsyre PCI-24781, et histon deacetylase-inhibitor som har en radiosensitizing virkning på kreftceller, virker også ved downregulating RAD51 [35]. Foruten å ha en rekke bivirkninger, disse stoffene har en tendens til å være svært kostbare.
Mange naturprodukter har bemerkelsesverdige medisinske verdier. Foruten å være mer overkommelige, naturlegemidler har vanligvis en lav toksisitet. Flere naturlige forbindelser er blitt funnet å gi Radiosensitivity og kjemosensitivitet på kreftceller. En studie viste at curcumin, en komponent i gurkemeie (
Curcuma longa
), kan radiosensibilisere prostata kreft celler via hemming av NFkB funksjon, noe som førte til en nedregulering av anti-apoptotiske genet
BCL-2 product: [36]. Behandling av livmorhalskreftceller med curcumin førte til økt produksjon av IR-indusert reaktive oksygenforbindelser (ROS), som fører til vedvarende ERK1 /2-MAPK aktivisering [37]. I motsetning til dette ble emodin, et stoff som finnes i visse planter, inkludert rabarbra, rapportert å hemme aktiveringen av ERK1 /2 i lungekreftceller, som i sin tur fører til en nedregulering av RAD51 og overfører kjemosensitivitet [38], [39].
Huang Lian er en av de mest brukte urter i Kina. Det er en av de 12 mest brukte urter i USA [40]. I tillegg til sin vanlige bruk som et medikament for gastrointestinalt ubehag, og berberin er testet i kliniske forsøk for type 2-diabetes mellitus [41], [42] og på hyperkolesterolemi [43]. Viktigere, pasienter som tar berberine erfaring relativt milde bivirkninger. Mens tidligere studier viste at berberin besitter direkte anti-tumoreffekter ved å fremkalle produksjon av reaktive oksygenarter i kreftceller, noe som antagelig ville gi bestrålingssensibilisering [44], [45], [46], [47], er den første vår studie å vise at berberine kan konferere Radiosensitivity av downregulating en sentral aktør i reparasjon av DSB sin. Det skal bemerkes at styrken av berberin i downregulating RAD51 i ESCC celler er sammenlignbar med Glivec i glioma-celler [24]. Ved høyere konsentrasjoner, er kines forventes å spille en dobbel rolle i å fremme død av cellene der det er beholdt, ved samtidig å påføre DNA skade og svekke en sti som er ansvarlig for reparasjon av skaden. Viktigere, ved konsentrasjoner der det gis Radiosensitivity til esophageal kreftceller, berberine hadde ingen radiosensitizing effekt på normale humane fibroblaster. Tilsvarende berberine ble ikke observert å nedregulere RAD51 i ikke-ondartede celler. Disse resultatene tyder på at radiosensitizing effekten av berberine kan være spesifikke for kreftceller.
I sammendraget, viste vi at kines ved lave konsentrasjoner betydelig radiosensitized esophageal plateepitelkarsinom celler. Det virker ved downregulating RAD51, en sentral aktør i homolog rekombinasjon reparasjon, noe som fører til verdifall i reparasjon av dobbel-strand pauser. Våre funn avdekket således en hittil ikke gjenkjent biologisk aktivitet av et vanlig brukt og billig stoff og indikerte at berberin, med sin relativt lave toksisitet, kan anvendes som en adjuvans i cancerstrålebehandling.
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
Alle prosedyrer som involverer kliniske prøver ble godkjent av etikkomiteen av Shandong University School of Medicine.
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP
Alle celler ble dyrket ved 37 ° C i fuktet inkubator inneholdende 5% CO
2. Den menneskelige esophageal plateepitelkarsinom (ESCC) linjer KYSE30, KYSE450, KYSE410, EC109 og TE-en ble oppnådd fra Cancer Institute Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing) og dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 enheter /ml penicillin og 100 mikrogram /ml streptomycin. KYSE30, KYSE450 og KYSE410 ble opprinnelig generert av Dr. Yutaka Shimada, ble normale menneskelige fibroblast (NHF) celler hentet fra Institutt for medisinske basalfag, Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing), og ble opprettholdt i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 enheter /ml penicillin-streptomycin og 4 ug /ml bFGF. HUVECs ble oppnådd fra ATCC. Stamceller avledet fra humant navlestrengen var en gave fra Dr. Dong Li, Qilu Hospital, Shandong University. Fibroblaster (XWXL) ble etablert fra en kirurgisk fjernet fibroadenoma, med informert samtykke fra pasienten og godkjent av etikkomiteen av Shandong University School of Medicine.
