Abstract
Canine kreft cellelinjer har gradvis blitt utviklet, men er fortsatt lite brukt ressurser for stråling biologi forskning. Måling av celle iboende Radiosensitivity er viktig fordi forstå forskjellen kan gi et rammeverk for videre belyse profiler for prediksjon av strålebehandling respons. Våre studier har fokusert på å karakterisere ulike hjørnetann kreft cellelinjer
in vitro Hotell og forstå parametere som kan bidra til indre Radiosensitivity. Først ble iboende Radiosensitivity av 27 hjørnetann cancercellelinjer avledet fra ti tumortyper bestemt ved å bruke en klonogene assay. De 27 cellelinjer hadde varierende radiosensitivities uansett tumortype (overlevelse fraksjon på 2 Gy, SF2 = 0,19 til 0,93). For å forstå parametere som kan bidra til indre Radiosensitivity, evaluerte vi forbindelsene til cellulære radiosensitiviteten med basiske cellulære egenskapene til de cellelinjer. Det var ingen signifikant korrelasjon på SF2 med S-fase brøkdel, dobling tid, kromosom nummer, ploidiresultat, eller antall metasenter kromosomer, mens det var en statistisk signifikant sammenheng mellom SF2 og plating effektivitet. Deretter valgte vi de fem mest radiosensitive cellelinjer som radiosensitive gruppen og de fem mest radioresistant cellelinjer som radioresistant gruppen. Deretter, evaluerte vi kjente parametre for celledreping ved ioniserende stråling, herunder strålings-induserte DNA-dobbel tråd pause (DSB) reparasjon og apoptose, i den radiosensitive gruppen sammenlignet med gruppen radioresistant. Høye nivåer av rest γ-H2AX foci på nettstedene til DSB sin var tilstede i fire av de fem radiosensitive canine kreft cellelinjer. Våre studier antydet at betydelige forskjeller i indre Radiosensitivity eksisterer i hjørnetann kreft cellelinjer, og stråling-indusert DSB reparasjon var relatert til Radiosensitivity, som er konsistent med tidligere studier på mennesker. Disse dataene kan hjelpe videre undersøkelser med fokus på påvisning av DSB for å forutsi individuelle respons på strålebehandling for hunder, uansett tumortype
Citation. Maeda J, Froning CE, Brents CA, Rose BJ, Thamm DH, Kato TA (2016) Intrinsic Radiosensitivity og Cellular Karakterisering av 27 Canine Cancer Cell Lines. PLoS ONE 11 (6): e0156689. doi: 10,1371 /journal.pone.0156689
Redaktør: Ying-Jan Wang, National Cheng Kung University, TAIWAN
mottatt: 14 januar 2016; Godkjent: 18 mai 2016; Publisert: 03.06.2016
Copyright: © 2016 Maeda et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. det ble gitt av Dr. Akiko Ueno Strålebiologi Fund (TAK). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en hovedårsak til død hos hunder, samt hos mennesker. Menneskelige og hjørnetann kreft har lignende egenskaper, ikke bare i anatomiske og histopatologiske utseende, men også biologisk atferd, tumor genetikk og respons på konvensjonell terapi [1, 2]. Canine kreft modeller har dukket opp som verdifulle ressurser i studiet av menneskelig kreft [2]. I human kreftforskning, mange godt karakteriserte humane kreftcellelinjer er tilgjengelige for kreftforskning. Kreft cellelinjer har vært mye brukt som
in vitro
eksperimentelle modellsystemer og har vist seg å være nyttig for å utforske den underliggende biologi av kreft [3]. Canine kreftcellelinjene er gradvis blitt utviklet og benyttet, men er ikke så fullstendig karakterisert som humane cellelinjer. Gransking av cellebiologi gjennom karakterisering av hjørnetann kreft cellelinjer kan gi ytterligere informasjon om kreft biologi, noen spesifikke for hunder, og noen potensielt supplere de som er rapportert for kreft hos mennesker.
Svulster selv med samme histopatologiske opprinnelse kan vise en bredt spekter av følsomhet for strålebehandling [4, 5]. Måling av celle iboende Radiosensitivity er viktig fordi forstå forskjellen kan gi et rammeverk for videre belyse profiler for prediksjon av strålebehandling (RT) respons. Indre radiosensitivities målt ved
in vitro
kolonidannelse assays er uttrykt som SF2, fraksjonen av celler som overlevde en enkelt 2 Gy dose av ioniserende stråling (IR). Dosen av 2 Gy er også et vanlig dose per fraksjon i klinisk RT i mennesker. Den SF2 i mennesker er vist å forutsi tumorrespons
in vivo
i tidligere studier [6, 7]. Slike studier har antydet at forskjeller i indre Radiosensitivity eksisterer og forstå mekanismene kan ha betydelig innvirkning praksis for personlig RT [4, 5].
De mekanismene bak forskjellene i indre Radiosensitivity av tumorceller er sannsynlig multifaktoriell [5] . Reparasjon av DNA-dobbeltstrengbrudd (DSB) er kjent som en av de viktigste elementene som bestemmer indre Radiosensitivity fordi disse lesjoner, hvis reparasjon, fører til celledød [8]. Tidligere fordelingen av cellene i fasene av cellesyklusen og DNA /kromosominnhold er blitt foreslått som faktorer som kan påvirke iboende Radiosensitivity av tumorceller [9, 10]. Videre kan en del av forskjellene kunne tilskrives en tendens til å gjennomgå apoptose i respons til stråling som det fremgår av lymfoide tumorer [11]. Imidlertid har inkonsistente korrelasjon med radiosensitiviteten av humane tumorceller blitt rapportert ved måling av disse parametre, og etablering av en nyttig analyse som forutsier iboende Radiosensitivity er fremdeles under undersøkelse [4].
Våre studier har fokusert på å karakterisere ulike hjørnetann kreft cellelinjer
in vitro Hotell og forstå parametere som kan bidra til indre Radiosensitivity. Denne grunnleggende karakteriseringen kan gi informasjon av disse cellelinjer for videre forskning i prediksjon av strålebehandling respons. Vi undersøkte den iboende Radiosensitivity av 27 hjørnetann kreft cellelinjer avledet fra ti krefttyper. Hver cellelinje ble karakterisert ved en kombinasjon av data som representerer cellesyklusfordeling, cellulær fordoblingstid, kromosomantall, DNA-ploiditet mønster og Plating effektivitet. De kjente parametere inkludert DNA DSB reparasjon effektivitet og apoptose følgende ioniserende stråling ble evaluert mellom utvalgte radiosensitive og radioresistant cellelinjer.
Materialer og metoder
Cell Culture
27 canine tumorcellelinjer ble vennlig levert av Flint Animal Cancer Center of Colorado State University (Fort Collins, CO, USA) (tabell 1) [12]. Adhesive tumorcellelinjer ble dyrket i Minimum Essential Medium (MEM /EBSS, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Sigma-Aldrich, St Louis, MO), 1% MEM vitaminer, ikke- essensielle aminosyrer, natriumpyruvat, penicillin, streptomycin og Fungizone. Suspensjonstumorceller ble dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco Life Technologies) supplert med det samme som MEM. Cellelinjene ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 95% luft og 5% CO
2.
Cell Proliferation
For å bestemme doblingstider cellelinjene, ble cellene sådd ut i forskjellige konsentrasjoner i 35 mm kulturskåler. Celler ble inkubert ved 37 ° C. Antall celler ble tellet hver 24. time, ved anvendelse av en Coulter-teller Z1 (Beckman Coulter, La Brea, CA). Cellular doblingstidene ble beregnet ved hjelp av Prism 5-programvaren (Graph Pad Software, La Jolla, CA). Minst tre uavhengige eksperimenter ble utført.
kromosomantall
Cellene ble dyrket med 0,1 ug /mL colcemid (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 6 timer for å høste metafase-kromosomer. Prøvene ble behandlet i hypotonisk 75 mM KCl-oppløsning i 20 minutter ved 37 ° C og fiksert i 3: 1 (metanol: eddiksyre) fikseringsløsning tre ganger. Metafase sprer ble farget med Giemsa løsning, og ble observert kromosom nummer under en Axioplan mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland). Et minimum av 100 metafaseceller var analysert for å telle kromosomer per celle. Minst 50 metafase celler ble analysert for å telle metasenter kromosomer per celle.
Cell Cycle Analysis
Cellekulturer på 60% til 70% samløpet ble fiksert i 70% etanol ved -20 ° C over natten eller lengre. Cellene ble så sentrifugert ved 1500 rpm i 5 minutter og vasket en gang med PBS. Cellene ble deretter resuspendert i 1 ml av fargeløsning (20 ug /ml propidiumjodid, 0,1% TritonX-100, 500 pg /ml RNase A) og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Analysen er gjort ved hjelp av en FACSCalibur flowcytometer med Cell quest Pro (BD Biovitenskap, Franklin Lakes, NJ) og ModFit LT programvare (Verity, Topsham, ME). Tre uavhengige eksperimenter med hver cellelinje ble utført. Ploidiundersøkelse ble estimert som den DNA-innhold av G1-celler i tumorcellene normalisert til diploide ovarieceller fra kinesisk hamster.
Bestråling
log-fase-kulturer ble bestrålt med forskjellige doser av
137Cs gamma- stråler ved hjelp av en JL Shepherd Model Mark i-68 nominell 6000 Ci
137Cs irradiator (JL Shepard, Carlsbad, California), levert på ca 2,5 Gy /min ved romtemperatur.
klonogene Survival analysen
Radiosensitivity ble målt ved hjelp av klonogene assay for nonsuspension cellelinjer. Tilfeldig delende celler i T-12.5 kolber ble bestrålt, trypsinisert og sådd ut i triplikat på 100 mm eller 60 mm kulturskåler ved passende celletetthet. Etter inkubering i 1-2 uker for å tillate kolonidannelse, ble retter skyllet med 0,9% NaCl, fiksert med 100% etanol og farget med 0,1% krystallfiolett. Hver koloni består av mer enn 50 celler ble scoret som en overlevende. Minst tre uavhengige eksperimenter ble utført, deretter overlevelseskurver ble trukket ved hjelp av lineære-kvadratisk regresjon ligninger med Prism 5-programvaren. Overlevelsen fraksjon på 2 Gy stråling (SF2) og overlevelse fraksjonen ved 5 Gy stråling (SF5) ble oppnådd ved interpolering av celleoverlevelse som estimater av den iboende Radiosensitivity av hver cellelinje.
For suspensjonskulturer, en begrensende fortynningsanalyse ble anvendt som tidligere er benyttet i humane kreftcellelinjer [13, 14]. Celler ble sådd ut i 96-brønners mikrotiterplater med en tetthet på 1-200 celler per brønn i to eller tre celletettheter pr dose punkt. Etter bestråling ble platene inkubert ved 37 ° C i 2-3 uker før å utføre som negativ eller positiv for vekst basert på mikroskopisk undersøkelse (dvs. brønner hvori cellevekst hadde funnet sted er positive). Basert på Poissonfordelingen, ble overlevelsesfraksjonene beregnet som beskrevet tidligere [15].
γ-H2AX Foci i G1 bestrålte celler
Induksjon av, og rest DNA DSB sin ved IR ble vurdert ved hjelp av den γ-H2AX analysen. Vi har utført analysen med celler synkroniserte og opprettholdt i G1 under bestrålingen ved hjelp av isoleucin berøvelse metoden [16]. Dette ble gjort fordi ikke-bestrålte celler i S-fase har mye høyere nivåer av γ-H2AX brennpunkter, og også fordi antall brennpunkter per celle er avhengig av DNA-innhold [17]. Celler ble dyrket i 24 timer på plast kammers objektglass til omtrent 50% konfluens og vasket med PBS en gang. Den normale vekstmediet ble skiftet ut to ganger i 1,5 doblingstidene med isoleucin-manglende MEM inneholdende 5% 3 x dialysert FBS for å synkronisere cellene i G1 fase. Etter G1 synkronisering og eksponering til 0 Gy eller en Gy av gammastråler, ble celler inkubert med 5-etynyl-2′-deoksyuridin (EDU) i 30 minutter (enten umiddelbart eller etter 5,5 timers inkubasjon for reparasjon). EDU-merking ble brukt til å dømme G1 synkronisering [18]. Cellene ble deretter vasket i PBS og fiksert i 4% paraformaldehyd fulgt av permeabiliseringen med 0,5% Triton-X-100 og 0,1% SDS. Edu ble først farget som produsentens instruksjoner. Objektglassene ble vasket tre ganger i PBS, fiksert i 4% paraformaldehyd og blokkert i PBS med 10% geiteserum over natten ved 4 ° C. Etter inkubering over natten, ble cellene inkubert med et fosforylert histon H2AX antistoff (Ser139) (γ-H2AX) (Millipore, Billerica, Massachusetts) og etterfulgt av Alexa 594 Fluor-konjugert geit-anti-mus-antistoff (Molecular Probes, Eugene, OR) . Cellene ble montert i en oppløsning med DAPI inneholdende langsom fade (Invitrogen). Digitale bilder ble tatt med en Axioskop motorisert Z-trinns mikroskop (Carl Zeiss) med CoolSnapHQ2 (fotometriske, Tucson, Arizona) og Metamorph programvare (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Bildene ble brukt til å telle γ-H2AX brennpunkter per celle. Tre uavhengige eksperimenter ble utført og tallene i γ-H2AX ble tellet i minimum 50 EDU farging negative celler for hver prøve i hvert eksperiment.
Analyse av apoptose
apoptose-induksjon ved IR- ble vurdert ved hjelp av caspase 3/7 aktivisering, Annexin V flekker, og terminal deoksynukleotidyltransferase (TdT) -mediert deoxyuridine trifosfat nick end-merking (TUNEL) analyse. Log-fase voksende celler ble bestrålt med 0 eller 5 Gy Gy gammastråler. Etter 16 timers inkubasjon ble tidlig apoptose målt med aktiveringen av caspase 3/7 av Caspase-Glo 3/7 kit (Promega, Madison, WI). Glow luminesce på 10.000 celler ble målt ved Lumat LB9507 (Berthold teknologier, Oak Ridge, TN). Etter 24 timers inkubering ble tidlig /sen apoptose målt med Annexin V farging av FITC Annexin V apoptose deteksjon kit med 7-AAD (Biolegend, San Diego, California). Annnexin V positiv, men 7-AAD negativ (begynnelsen av apoptotiske celler) og Annexin V positiv og 7-AAD positive (sent stadium apoptose) ble bestemt ved Guava-PCA strømningscytometer. Etter 48 timers inkubasjon ble sen apoptose målt med TUNEL assay og fragmentert atom morfologi. De cytogentrifuged celler ble fiksert med 4% paraformaldehyde og iskald 70% etanol. Cellene ble inkubert i reaksjonsblandingen inneholdende 1,5 mM CoCl
2, 12,5 U TdT, 1 mM 5-brom-2′-deoksyuridin-5′-trifosfat i TdT buffer (Br-dUTP, Sigma-Aldrich: de øvrige , Roche, Indianapolis, IN) i 4 timer ved 37 ° C i mørket. Glassene ble inkubert med et muse-monoklonalt antistoff BrdU og Alexa 488 Fluor-konjugert geit-anti-mus-antistoff. Til slutt ble cellene motfarget med DAPI. Omtrent 1000 kjerner fra hvert bilde ble talt opp, og tunel positive frekvensene ble beregnet. Apoptose forhold ble også bestemt av ledelsen DAPI flekker celler med fragmentert kjernemorfologi.
Western blotting
Celler ble lysert med M-PER pattedyr Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific) og proteasehemmere. Proteinekstrakter (20 ug per prøve) ble størrelses-fraksjonert på NuPage 4-12% Bis-Tris-geler (Invitrogen), elektro-overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad) i buffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, 20% (v /v) metanol og 0,01% SDS) ved en strømtetthet på 3,0 mA /cm
2 til 16 timer ved 4 ° C. Filtrene ble blokkert med Tris-bufret saltvann med 0,05% Tween 20 inneholdende 2% (vekt /volum) skummet melk, og omsatt med et primært antistoff i 2 timer ved romtemperatur, etterfulgt av en inkubasjon med et sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. De immunoreaktive signaler ble påvist ved anvendelse av SuperSignal Western blotting Detection Kit (Thermo Fisher Scientific) og en ChemiDoc XRS + system (Bio-Rad). Proteinekspresjon fra båndet Styrken ble analysert ved hjelp av bilde Lab programvare (Bio-Rad). De primære antistoffene anvendt i denne studien var til mus anti-DNA-PKCS monoklonalt antistoff (Ab-4; Neomarkers, Fremont, CA), kanin anti-Rad51 polyklonalt antistoff (H-92; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), kanin anti-FANCD2 polyklonalt antistoff (NB100-182; Novus Biologicals, Littleton, CO) og muse-monoklonalt beta-aktin-antistoff (Abram 8226; Abcam, Cambridge, MA). De sekundære antistoffer ble geit-anti-mus IgG HRP-konjugert antistoff (1: 10000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) og geite-anti-kanin-IgG-HRP-konjugert antistoff (1: 10000) (cellesignalisering, Boston MA ). Hver uttrykket bandet ble estimert fra molekylvekt på hvert protein og bandet oppdaget i menneskelig kreft cellelinje A549.
Statistical Analysis
For statistisk analyse, GraphPad Prism 5 programmet ble brukt. D’Agostino-Pearson test ble benyttet for å bestemme om de verdiene ble normalfordelt. Forskjeller med en P-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Korrelasjoner av SF2 og andre parametere ble bestemt av Pearson test. Statistiske sammenligninger mellom gjennomsnittsverdier i γ-H2AX assay (kontroll vs. 6 timer etter en Gy) ble utført ved anvendelse av Kruskal-Wallis test, etterfulgt av Dunn multiple sammenligningstest. Statistisk sammenligning av gjennomsnittsverdier i SF2 /SF5 (radioresistant gruppe vs radiosensitive gruppen) og i apoptose analysen (0 Gy vs 5 Gy) ble utført ved hjelp av uparet to halet t-test.
Resultater
Basic Karakterisering av Canine Cancer Cell Lines
Hver cellelinje ble preget av en kombinasjon av data som representerer celle dobling tid, cellesyklus distribusjon, ploidiresultat mønster og kromosom nummer, med data oppsummert i tabell 1. doblingstidene for hver cellelinje varierte fra 15 timer (CML-6M, CTAC) til 40 timer (STSA-1), som viser store variasjoner. Vi målte cellesyklusfordelingen av hver cellelinje ved strømningscytometri. Prosentandelen av celler i hver fase av cellesyklusen varierte fra 39,3% (CLBL1) til 69,6% (BR) for G1 fase, fra 17,3% (Parker) til 50,1% (CLBL1) i S-fasen, og fra 1,52% (BR ) til 29,9% (Parker og STSA-1) for G2 /M fase. Disse cellelinjene vises variable gjennomsnittlig antall kromosomer, som strekker seg fra 57 (1771) til 155 (17CM98). Canine cancercellelinjer viste økt antall av metasenter kromosomer (X-formet kromosomer) som følge av Robertsonske trans arrangementer [19], med unntak av to cellelinjer (Jones og OSW) (tabell 1). Frekvenser av metasenter kromosomer varierte mellom cellelinjer fra mindre enn to, den normale karyotype, 43,2 (D17) per celle. Alle cellelinjer med unntak av BR hadde større enn den diploide mengde DNA. Vi fant overordnede avtaler mellom unormal ploidiresultat og økte kromosomtall, men ikke alltid. Nike, for eksempel, hadde et mindre antall kromosom per celle med 64,4, men ploiditeten mønsteret var mellom diploidy og triploidy.
klonogene Survival etter eksponering for gammastråling
Vi bestrålt hver av de 27 canine cancercellelinjer med 0, 1, 2, 3 eller 5 Gy av gammastråler og målte kolonidannelse. Deres overlevelseskurver er vist i figur 1. SF2 og SF5 verdiene som ble beregnet fra den lineære regresjon overlevelse kvadratisk kurve, samt pletteringseffektiviteten, er rapportert i tabell 1. Disse data representerer området fra hjørnetann tumorcelle radiosensitivities på tvers av forskjellige tumortyper . Den SF2 varierte 0,19 til 0,93, og den SF5 varierte 0,01 til 0,60. Pletterings effektivitet av disse cellelinjene viste også en bred variasjon og varierte fra 4% til 65%. Pletterings effektivitet av BR (4%) var for lav til å oppnå pålitelige overlevelses fraksjoner; derfor sin Radiosensitivity ble ikke brukt for videre analyser. Den Radiosensitivity av de fire hjørnetann OSA cellelinjer (D17, Moresco, Gracie og MacKinley) målt ved klonogene analysen var konsistente med de som tidligere har blitt publisert [20]. Derfor blir data for de grunnleggende cellulære egenskaper (f.eks dobling tid, kromosomanalyse) som vises i rapporten ble også benyttes for analysen i denne studien. Vi evaluerte sammenhenger mellom de variable cellulære egenskaper og radiosensitiviteten. I disse cellelinjer, var det ingen signifikant korrelasjon av SF2 med S-fasefraksjon, doblingstiden, kromosomantall, eller antallet metasenter kromosomer, mens det var en beskjeden, men statistisk signifikant sammenheng mellom SF2 og plating effektivitet (R «sup> 2 = 0,34, p = 0,002, Pearson test) (fig 2). Evaluering mot SF5 viste lignende resultater til disse hentet fra SF2 (R
2 = 0,24, p = 0,01, Pearson test).
Forsøkene ble utført minst tre ganger og feil linjene viser standardavviket av midlene. Vi valgte de mest radiosensitive cellelinjer (røde kurver) og de radioresistant cellelinjer (blå kurver) for følgende analyse.
Hver prikk representerer en cellelinje. Korrelasjonene ble vurdert ved hjelp av Pearson test. Linjene ble utstyrt med en minste kvadraters metode.
Valg av radiosensitive og Radioresistant Grupper
De 27 canine kreft cellelinjer ble rangert av de Radiosensitivity parametre, SF2 og SF5, og de fem mest følsomme eller resistente linjer for hver parameter ble definert som de følsomme og resistente grupper (figur 3A og 3B). Den valgte radioresistant gruppen vises SF2 verdier 0,19 til 0,44 (Nike, CML-C2, Bliley, MacKinley, STSA-1). Den radiosensitive gruppen viste SF2-verdier over 0,86 (CMT-12, K9TCC, DEN-HSA, CMT-27, Abrams). Forskjellene i tumorcelle Radiosensitivity var bedre diskriminert når Radiosensitivity av tumorceller ble uttrykt som overlevelses fraksjoner ved høy dose (SF5). Cellelinjene i de to grupper basert på SF5 sammenligningen var litt forskjellig fra de som er basert på den SF2 sammenligning. Overlevelses fraksjoner mellom to grupper av cellelinjer basert på enten SF2 eller SF5 sammenligning var statistisk forskjellige (p 0,001). (Fig 3C og 3D)
27 cellelinjer rangeres basert på SF2 (A) og SF5 (B). Rød sirkel: radiosensitive gruppe, blå sirkel: radioresistant gruppe. (C, D) Sammenligning mellom gjennomsnittsverdiene av to grupper basert på SF2 (C) eller SF5 (D). Feilfelt angir standardavvik. * P. 0,001 versus følsomme og resistente gruppe (uparet t-test)
Forholdet mellom egen Radiosensitivity og DNA DSB sin i G1-Irradiatied Cells
For å undersøke om responsen av celler DNA DSB sin korrelerer med Radiosensitivity i kaninkreftcellelinjer, brukte vi γ-H2AX analysen i de fem mest radioresistant og fem mest radiosensitive cellelinjer valgt fra SF2 rangering. Nuclear foci av fosforylert histon H2AX (γ-H2AX) som følge av DNA-skader er sensitive markører for DNA DSB sin [21]. Vi målte antall γ-H2AX foci etter en Gy gammabestråling i G1-fase synkroniserte celler etter 30-min eller seks-timers reparasjonstiden (figur 4). I isoleucin mangelfulle media for å synkronisere cellene i G1, de fleste DEN-HSA-celler døde etter en 24 timers inkubering, og CMT-12 cellelinjen ble ikke synkronisert i media. Derfor er disse to cellelinjer ble ikke anvendt for denne analysen. De andre cellelinjer viste G1 synkroniseringen med mindre enn 16% i S-fasen i isoleucin manglende media i 1,5 doblingstidene. I noen celler som ikke er i S-fasen med 0 Gy behandling, ble store mengder endogene y-H2AX foci observeres i alle de canine kreftceller. Vi utelatt celler med høye nivåer av foci utenfor IR-indusert fordeling fra analysen for å påvise nivåene av foci indusert ved IR. På bakgrunn av analysen uten celler med høye nivåer av endogene γ-H2AX foci tall, en Gy av gammastråler indusert betydelig høyere nivåer av γ-H2AX foci etter 30 min bestråling i alle cellelinjer som benyttes i denne analysen (p 0,05 vs 0 gy, ikke vist i figuren) (figur 4B). På 30 minutter etter bestråling, median antall γ-H2AX foki var avhengig av DNA-innholdet i hver cellelinje. Videre radiosensitive CML-10C2, Nike, STSA-en og MacKinley hadde høyere antall γ-H2AX foci etter seks timer etter en Gy bestråling i forhold til sine kontrollnivåer (p 0,05 vs 0 Gy). På den annen side er alle tre av de radioresistant cellelinjer og en radiosensitive cellelinje, Bliley, ikke viste signifikante forskjeller mellom kontroll-celler og celler med 6 timer etter bestråling.
Celler ble synkronisert i G1 ved hjelp av isoleucin mangelfulle media og deretter bestrålt med en Gy av gammastråler. Etter 30 min eller 6 timers inkubasjon ble cellene farget med γ-H2AX. (A) Eksempler på γ-H2AX foci (grønn) i kjernefysisk DAPI (blå) flekker i kontroll, 1Gy etterfulgt av 30 min inkubasjon og en Gy etterfulgt av seks timers inkubasjon i Edu negative celler. (B) Kvantitativ analyse av gamma-H2AX brennpunkter per celle. De sammenslåtte data fra tre uavhengige eksperimenter scoret 50 celler i hvert forsøk er vist. Baren viser gjennomsnittet. Statistiske betydninger er vist for bare kontroll versus seks timer etter en Gy (parametrisk Kruskal-Wallis test).
Forholdet mellom egen Radiosensitivity og apoptose Frequency in bestrålte cellen
De fem radioresistant celle linjer og de fem radiosensitive cellelinjene ble også vurdert for apoptose ved 18, 24 og 48 timer etter bestråling (0 Gy og 5 Gy) (figur 5). Caspase 3/7 Aktiveringen ble analysert 18 timer etter bestråling (figur 5A). Annexin V-ekspresjon ble analysert ved 24 timer etter bestråling (figur 5B). Aktiviteten av caspase 3/7 økt i mer enn to ganger ble observert i CMT-12, Abrams, CMT-27, CML-10C2, Bliley, MacKinly, og STSA-en. Prosentandelen av apoptotiske celler økte signifikant med 5 Gy bestråling i CMT-12, Abrams, CMT-27, CML-10C2, Bliley, og MacKinley av Annexin V analyse. Apoptotiske celler ble talt ved TUNEL farging (Fig 5C) og DAPI sier (Fig 5D) og rapporteres separat. Selv om apoptose ble observert i alle kontrollkulturer som strekker seg 0,1 til 3,4% ved TUNEL-farging og 0,37 til 3,3 vekt-% DAPI farging av cellene, avhengig av cellelinjen, var det ingen signifikant forskjell mellom de cellelinjer. Prosentandelen av apoptotiske celler økte signifikant med 5 Gy bestråling i Abrams, Nike, og CML-10C2 ved DAPI farging forhold til 0 Gy prøver (p 0,05, uparede t-tester) (figur 5C). Ved hjelp av målingen av apoptotiske celler ved TUNEL-analysen, ble lignende resultater disse etter DAPI farging observert. En betydelig økning i apoptose frekvens ved IR ble observert i en (Abrams) ut av de fem radioresistant cellelinjer og i tre (Nike, CML-10C2 og MacKinley) ut av de fem radiosensitive cellelinjer (figur 5D).
(A) Caspase 3/7 aktivitet målt ved luminomator ved 16 timer etter bestråling. (B) Annexin V og 7AAD farging målt ved flow-cytometer ved 24 timer etter bestråling. (C) TUNEL-farging og (D) DAPI farging målt ved hjelp av fluorescerende mikroskop. Celler bestrålt med 0 Gy og 5 Gy av gammastråler. *, P 0,05 versus 0 Gy og 5 Gy for hver cellelinje (uparet t-test)
Protein Expression of DNA Repair veien i radiosensitive og Radioresistant Grupper
Siden DNA. DSB-reparasjonsbaner er nært knyttet til celledreping ved hjelp av IR, studerte vi proteinet status av de store baner i canine kreftceller. Vi fokuserte på de to store ikke homolog ende bli (NHEJ) og homolog rekombinasjon (HR) i DSB reparasjon og Fanconi Anemi (FA) sti, som muligens bidrar til DNA-skade reparasjon for bestråling. Protein uttrykk for store aktører i hver vei, DNA-PKCS i NHEJ, RAD51 i HR og FANCD2 i FA veien ble oppdaget av western blotting i radioresistant og radiosensitive grupper (figur 6). Ekspresjon av DNA-PKCS, FANCD2 og RAD51 var ikke ensartet blant de cellelinjer, og det var ingen klar tendens mellom uttrykket nivåer i de to gruppene som er vist på fig 6B. Ekspresjonen av de tre proteinene i canine kreftcellene var generelt høyere enn de hos normale hunde fibroblaster. Vi observerte mindre ekspresjon av DNA-PKCS proteiner i Nike (1,4 ganger fra normal) og høyest ekspresjon i STSA-en (5,4 ganger fra normal). For FANCD2 protein, den laveste uttrykket var i DEN-HSA (0,8 ganger av normal) og høyest uttrykk var i CMT-27 (7,2 ganger av normal). For RAD51 protein, den laveste uttrykk i DEN-HSA (0,4 ganger av normal) og høyest uttrykk var i MacKinley (3,0 ganger av normal). Ved sammenligning mellom hjørnetann og den humane kreftcellelinje (A549), uttrykket nivåer av DNA-PKCS i STSA-1, som viste den høyeste ekspresjon av canine cellelinjer, var 10 ganger mindre enn for A549.
(A) Western blot-analyse av DNA-PKCS (460 kDa), FANCD2 (165 kDa) og RAD51 (37 kDa). β-aktin (42 kDa) ekspresjon ble anvendt som en kontroll. Hver uttrykket bandet ble estimert fra molekylvekt. (B) Band intensiteten av western blot. (C, D) Representative bilder for RAD51 foci (C) og FANCD2 foci (D) samlokalisert med gamma-H2AX i Moresco celler.
Vi har også observert foci av RAD51 og FANCD2 som funksjonelt samlokalisert med γ-H2AX på replikering stresset uten bestråling i alle 27 cellelinjer (fig 6C og 6D). En annen fordel for testing RAD51 og FANCD2 var at disse protein foci formasjonene kreve andre oppstrøms proteiner, for eksempel fem RAD51 paralog proteiner og åtte fanconi anemi proteiner [22-24]. Derfor, oppdage foci formasjon gjorde oss i stand til å screene for tilstedeværelsen av disse oppstrøms proteiner i alle de 27 hjørnetann kreft cellelinjer. Vi observerte funksjonelle områder med RAD51 og FANCD2 i alle cellelinjene.
Diskusjon
De 27 canine kreft cellelinjer avledet fra ti forskjellige krefttyper som benyttes i denne studien hadde varierende radiosensitivities uansett svulst skriver med SF2 verdier på 0,17 til 0,94 (figur 1 og tabell 1). Fra tidligere Radiosensitivity data ved hjelp av et bredt spekter av humane tumorer, SF2 varierte 0,038 til 0,95 [13]. Den nedre del av SF2 rapportert i det humane studiet var for det meste på grunn av lymfoide tumorer, som ikke var sterkt radiosensitive i vårt tann resultat hvor SF2 ble målt ved anvendelse av den samme assay. Lymfoide tumorer er kjent for å være følsomme for strålebehandling i human- og veterinær onkologi [2]. Denne uoverensstemmelse kan skyldes variasjonen mellom lymfoide tumorcellelinjer som rapportert tidligere [25], siden bare fire cellelinjer ble undersøkt i vårt studium.
For å forstå parametere som kan bidra til indre Radiosensitivity, vi undersøkt relasjoner av mobilnettet Radiosensitivity med grunnleggende cellulære egenskaper i de 27 hjørnetann kreft cellelinjer. En bred variasjon ble også observert i cellulære egenskaper når det gjelder kromosomantall, S-fasefraksjon, doblingstiden og plating effektivitet i disse cellelinjer (tabell 1). I vår studie fant vi ikke en sammenheng mellom Radiosensitivity og de cellulære karakteristika inkludert kromosom nummer, S-fase brøkdel, og dobling tid (figur 2).
