Abstract
En stor utfordring for onkologer og pharmacologists er å utvikle mindre giftige stoffer som vil forbedre overlevelse av lungekreftpasienter. Frondoside A er en triterpenoid glykosid isolert fra sjøpølse,
Cucumaria frondosa Hotell og viste seg å være en svært trygg forbindelse. Vi undersøkte effekten av Frondoside A på overlevelse, migrasjon og invasjon
in vitro
, og på tumorvekst, metastase og angiogenese
in vivo
alene og i kombinasjon med cisplatin. Frondoside A forårsaket konsentrasjonsavhengig reduksjon i levedyktigheten for LNM35, A549, NCI-H460-Luc2, MDA-MB-435, MCF-7, og HepG2 over 24 timer gjennom et caspase 3/7-avhengig celledød pathway. IC50-konsentrasjoner (som produserer halv-maksimal inhibering) ved 24 timer var mellom 1,7 og 2,5 uM av Frondoside A. I tillegg Frondoside A induserte en tids- og konsentrasjonsavhengig inhibering av cellemigrering, invasjon og angiogenese
in vitro
. Frondoside A (0,01 og 1 mg /kg /dag i.p. i 25 dager) signifikant redusert vekst, angiogenese og lymfeknutemetastase av LNM35 tumorxenografter i atymiske mus, uten åpenbare toksiske bivirkninger. Frondoside A (0,1-0,5 mm) også signifikant forhindret basal og bFGF-indusert angiogenese i CAM-angiogenese-analysen. Videre Frondoside En forbedret inhibering av lungetumorvekst indusert av det kjemoterapeutiske middel cisplatin. Disse funnene identifisere Frondoside A som en lovende ny terapeutisk middel for lungekreft
Citation. Attoub S, Arafat K, Gélaude A, Al Sultan MA, Bracke M, Collin P, et al. (2013) Frondoside en undertrykkende Påvirkning av Lung Cancer overlevelse, tumorvekst, angiogenese, invasjon og metastasering. PLoS ONE 8 (1): e53087. doi: 10,1371 /journal.pone.0053087
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 13. juni 2012; Godkjent: 27 november 2012; Publisert: 08.01.2013
Copyright: © 2013 Attoub et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansielt støttet av FMHS tilskuddet antallet NP /08/27 (SA), UAE Universitetet stipend under en kontrakt nei. 01-04-8-11 /09 (SA), Terry Fox Fund for Cancer Research (SA og TA), den UAEU-NRF 09/10 stipend nummer 21MO72 (SA), og Maine Technology Institute, Gardiner, Maine, USA, og National Cancer Institute, RAPID Program (PC). Virkemiddelapparatet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Peter Collin er regissør, laboratoriesjef, ansattes og lager-innehaver av Coast Bio Resources, en Maine, USA Corporation. Thomas Adrian og Peter Collin er co-oppfinnerne av et amerikansk patent beskriver Frondoside A og andre sjøpølse glykosider som mulige anti-kreft agenter, og kan få økonomisk fordel hvis Frondoside A blir et medikament for kreft hos mennesker. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Lungekreft er den vanligste formen for kreft med en av de høyest dødelighet i verden. Målrettet behandling for utvalgte undergrupper av pasienter utgjør en bemerkelsesverdig fremgang i behandlingen av lungekreft. Men til tross for disse fremskrittene, kontroverser forbli, pasienter dør, og en kur forblir unnvikende [1]. Naturlige forbindelser er fremstår som en ny generasjon av cytostatika med begrenset toksisitet hos kreftpasienter [2], [3]. De kan ha høy verdi i tumorer resistente mot klassiske kjemoterapi eller resistente overfor tyrosin kinase hemmere som gefitinib
Sjøpølser er verdsatt i hundrevis av år i den kinesiske kostholdet som mat delikatesse, så vel som en medisin for en lang rekke sykdommer. I USA og Canada er sjøpølse vev tørket, pulverisert og innkapslet som kosttilskudd i over-the-counter kosttilskudd kosttilskudd, primært rettet mot inflammatoriske tilstander hos mennesker og selskapsdyr [4]. Frondoside A er en triterpenoid glykosid isolert fra Atlanterhavet agurk,
Cucumaria frondosa
. (Se [5] for kjemiske struktur). Nyere studier viser at lave konsentrasjoner av Frondoside A hemme vekst og induserte apoptose av humane pankreatiske, leukemi og brystkreftceller via caspaseaktivering [6] – [8]
kjemoterapeutiske midler som er i bruk for lungekreft. er fortsatt ikke tilfredsstillende på grunn av forbundet co-lateral giftighet og legemiddelindusert motstand [9] – [11] som motiverer vår undersøkelse av virkningen av Frondoside A på human ikke-småcellet lungekreft overlevelse, migrasjon og invasjon
in vitro
, og på tumorvekst, metastase og angiogenese
in vivo
alene og i kombinasjon med cisplatin.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
humane lungekreftceller LNM35 (NSCLC) [12], A549 og NCI-H460-Luc2 (Caliper Lifesciences, USA) ble holdt i RPMI 1640 (Invitrogen, Paisley, UK), human melanom MDA-MB-435, human bryst adenokarsinomceller MCF-7, og humane hepatomceller HepG2 ble holdt i DMEM (Invitrogen, Paisley, UK). Alle media ble supplert med antibiotika (penicillin 50 U /ml, streptomycin 50 ug /ml) (Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrike) og med 10% føtalt bovint serum (FBS, BioWest, Nouaille, Frankrike). EndoGRO ™ Menneskelig navleveneendotel Cells (HUVECs) (Millipore, Temecula, CA) ble opprettholdt i EndoGRO ™
-MV-VEGF Komplett Media Kit (Millipore, Temecula, CA). Cisplatin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Frankrike). Frondoside A ble renset fra
Cucumaria frondosa
, høstes nær Stonington, Maine og renhet (99,9%) bekreftet ved NMR som tidligere beskrevet [13], [14].
Cellular levedyktighet
celler ble sådd ut ved en tetthet på 5000 celler /brønn i 96-brønners plater. Etter 24 timer ble cellene behandlet i ytterligere 24 timer med forskjellige konsentrasjoner av Frondoside A (0,01-5 mm), in triplo. Kontrollkulturer ble behandlet med 0,1% DMSO. Effekten av Frondoside A på cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av en CellTiter-Glo Luminescent celleviabilitet assay (Promega Corporation, Madison, USA), basert på kvantifisering av ATP, som signaliserer tilstedeværelsen av metabolsk aktive celler. Den luminescerende signalet ble målt ved anvendelse av GLOMAX luminometer system. Resultatene ble presentert som proporsjonal levedyktighet (%) ved sammenligning av den behandlede gruppe med de ubehandlede celler, levedyktigheten av disse er antatt å være 100%.
caspase 3/7 aktivitet
LNM35 cellene sådd med en tetthet på 5000 celler /brønn i 96-brønners plate og behandlet med Frondoside A (1-2,5 mm) på 2 og 24 timer, i tre eksemplarer. Caspase-3/7 aktivitet ble målt ved hjelp av en selvlysende caspase-Glo 3/7 analysesett følge produsentens instruksjoner (Promega Corporation, Madison, USA). Caspase-reagens ble tilsatt og platen ble blandet ved hjelp av en orbital-rystemaskin og det ble inkubert i 2,5 timer ved romtemperatur. Luminescens ble målt ved hjelp av en GLOMAX luminometer system.
Sårtilheling motilitet analyse
LNM35 celler ble dyrket i seks-brønns vevskulturstudier retter til samløpet. Kulturer ble inkubert i 10 minutter med Moscona buffer. En skrape ble gjort gjennom konfluent monolag med en plastpipette spiss med en diameter på 1 mm. Etterpå ble de retter vasket to ganger og inkubert ved 37 ° C i friskt RPMI inneholdende 10% føtalt bovint serum i nærvær eller fravær av de ikke-toksiske konsentrasjoner av Frondoside A (0,1-0,5 mm). På undersiden av hver tallerken, ble to vilkårlige steder merkes hvor bredden av såret ble målt med et invertert mikroskop (objektiv x 4) (Olympus 1X71, Japan). Motilitet ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av differansen mellom målingene ved tiden null og 6, 24 og 30 timers periode i betraktning.
Matrigel invasjon assay
invasivitet av lungekreft celler LNM35 behandlet med Frondoside A (0,1-1 mm) ble testet ved hjelp av BD Matrigel invasjonen Chamber (8-mikrometer porestørrelse, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Frankrike) i henhold til produsentens protokoll. Den PI3 kinase inhibitor LY294002 (20 uM) ble anvendt som en positiv inhibitor av cellulær invasjon. I korte trekk Celler (1 x 10
5-celler i 0,5 ml av mediet og den indikerte konsentrasjon av Frondoside A) ble podet inn i de øvre kamrene i systemet, de nederste brønner i systemet var fylt med RPMI supplert med 10% føtalt bovint serum som en chemo-lokkemiddel og deretter inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Ikke-inntrengende celler ble fjernet fra den øvre overflaten av filteret med en bomullspinne. Celler som har migrert gjennom Matrigel ble fiksert med 4% formaldehyd, farvet med DAPI og tellet i 25 tilfeldig feltene under et mikroskop. Analysen ble utført i duplikat, og gjentatt tre ganger for kvantitativ analyse.
Chorioallantoic membran (CAM) assay angiogenese
Denne analysen ble utført som beskrevet tidligere [15], med noen modifikasjoner. Kort sagt ble befruktede egg inkubert i 3 dager ved 37, 8 ° C med en fuktighet på 48%. På dag fire, ble albumen fjernet for å løsne skallet fra utviklings CAM og et vindu ble gjort i eggeskallet, utsette CAM, og dekket med et pust film (suprasorb F®). Eggene ble returnert til inkubatoren inntil dag 10, før påføringen av testforbindelsene. Testforbindelsen og kontrollforbindelsen (DMEM uten 10% FBS) ble oppløst i DMEM uten 10% FBS ble helt over i separate sterile plater (12 mm diameter), som ble tillatt å tørke under sterile betingelser. En oppløsning av kortison-acetat (125 ug /plate) ble helt på alle plater for å forhindre en inflammatorisk respons. Test plater probet med rekombinant human bFGF (Peprotech) fungerte som kontrollgruppe for angiogenese stimulering. På hver CAM, ble platen inneholdende kontrollforbindelse, og platen inneholdende testforbindelsen plassert i en avstand på 1 cm. Vinduene var dekket og eggene ble inkubert inntil dag 14, før vurdering av angiogenese. Derfor ble eggene oversvømmet med 10% bufret formalin, og eggene ble holdt ved romtemperatur i minst 20 minutter. CAM, arealet av skivene som er inkludert, ble plassert i en petriskål med 10% bufret formalin. Plastskivene ble fjernet og fase-kontrast bilder av det området av plastskivene ble tatt. Den vaskulære Indeksen ble målt som tidligere beskrevet [16]. Vaskulære kryss på et rutenett med tre konsentriske sirkler (6, 8 og 10 mm diameter med som senter midt på platen) ble talt. Den angiogene index =
(tc) /c
, med
t
antall kryss i området som dekkes av testen platen og
c
antall kryss i området som dekkes av styreskiven i den samme egg. Mann-Whitney U-test ble brukt for statistisk analyse (p 0,05).
Vaskulær tube-analysen
Vurdering av
in vitro
kapillær dannelse brukes Matrigel (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Frankrike). Matrigel er en plateepitelkarsinom basalmembran matrix består hovedsakelig av kollagen IV, laminin, entactin, og heparansulfat proteoglykaner. Den Matrigel matrise ble tint, forsiktig blandet til homogenitet ved hjelp avkjølt pipetter, og utvannet v /v med EndoGRO ™
-MV-VEGF Komplett Media Kit medium (Millipore, Temecula, CA, USA). Matrigel, 50 ul /brønn, supplert med angiogene peptider og andre effektorer ble brukt til å belegge brønnene i 96-brønners plater. Platen ble deretter inkubert i en time ved 37 ° C for å tillate at matriseoppløsningen for å størkne før behandling. HUVECs (med en tetthet på omtrent 4 x 10
4 celler /brønn og den indikerte konsentrasjon av Frondoside A) ble sådd ut i hver brønn og inkubert i 8 timer ved 37 ° C i 0,1 ml EndoGRO ™
-MV -VEGF Komplett Media Kit medium (Millipore, Temecula, CA, USA). Da celler ble fotografert ved hjelp av et invertert fasekontrast photomicroscope. Den rørformede nettverk vekstområdet ble sammenlignet i kontroll og inhibitor-behandlet Matrigel matrise. Rør Dannelse ble kvantifisert ved å telle antall rør-lignende strukturer som dannes i hver brønn. Effekten av Frondoside A på levedyktigheten av HUVEC ble bestemt ved anvendelse av en CellTiter-Glo Luminescent celleviabilitet assay (Promega Corporation, Madison, USA), som tidligere beskrevet for kreftcellene.
tumorvekst og metastase assay
de dyreforsøk ble utført i henhold til protokoll godkjent av dyreetiske komité og Institutional Animal Care ved det medisinske fakultet Helsefag /UAE University. Seks uker gamle atymiske NMRI kvinnelige naken mus (nu /nu, Charles River, Tyskland) ble plassert i filtrert utendørs laminær skap og håndteres under aseptiske forhold. Prosedyrer som involverer dyr og deres omsorg ble gjennomført i samsvar med institusjonelle retningslinjer som er i samsvar med Det medisinske fakultet Helsefag, nasjonale og internasjonale lover og retningslinjer (EØF Rådsdirektiv 86/609, OJ L 358, 1, 12 desember 1987, og Guide NIH for Pleie og bruk av forsøksdyr, NIH publikasjon nr 85-23, 1985). LNM35-celler (1 x 10
6-celler i 200 ul PBS) ble injisert subkutant inn i den laterale flanke av de nakne mus. En uke etter inokulasjon, når tumorene hadde nådd volum på omtrent 150 mm
3, dyr (seks i hver gruppe) ble behandlet i den første protokoll i 25 dager med Frondoside A (0,01 og 1 mg /kg /dag, ip ) eller bærer oppløsning (kontroll), for å bestemme effekten av Frondoside A alene på tumorvekst og metastase. I den andre protokollen ble dyrene behandlet i bare 10 dager med den laveste dose av Frondoside A (0,01 mg /kg /dag, ip), cisplatin (1 mg /kg /dag, ip), eller med kombinert Frondoside A og cisplatinbehandling . Kontrolldyrene ble behandlet med bærerløsning. Tumor dimensjoner og dyrevekt ble målt hver 3. dag. Tumorvolum (V) ble beregnet ved anvendelse av formelen: V = 0,4 x en x b
2, med «a» er lengden og «b» bredden av svulsten. Etter ofring ble tumorene og aksillære lymfeknuter skåret ut og veiet.
Immuno-histokjemisk bestemmelse av CD31 /blodplate-endotelcelle-adhesjonsmolekyl 1 (PECAM-1) for microvessel Tetthet
Effekten av Frondoside A på angiogenese ble evaluert med CD31 immunofarging. De tumorvev ble raskt frosset i isopentan ved -130 ° C og lagret ved -70 ° C inntil videre behandling. Åtte-um frosne snitt ble løst i aceton, og inkubert over natten med en CD31 antistoff (klone MEC13.3, 1:100) (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA). Objektglassene ble deretter vasket tre ganger i PBS og inkubert med sekundært antistoff merket med rhodamin (geit anti-rotte 1:100) i en time ved romtemperatur. Det areal som opptas av CD31-positive mikrokar og samlet vev område angitt i del ble sammenlignet mellom behandlede og kontrollmus. Alle analyser ble utført i en blind mote.
Resultatene ble uttrykt som betyr ± SEM av det antall eksperimenter. Forskjellen mellom forsøks- og kontroll-verdier ble bestemt ved ANOVA etterfulgt av Dunnetfs post-hoc multiple sammenligningstest. Tumorvekst og metastasestudier ble analysert ved anvendelse av uparede Students t-test. P 0,05 indikerer en betydelig forskjell
Resultater
Effekt av Frondoside A på mobilnettet levedyktighet
Som vist i fig.. 1, Frondoside A konsentrasjoner (0,01-5 mm) forårsaket en konsentrasjonsavhengig reduksjon i cellelevedyktighet LNM35, A549, NCI-H460-Luc2, MDA-MB-435, MCF-7, og HepG2-celler i løpet av 24 timer. IC50-konsentrasjoner (som produserer halv-maksimal inhibering) ved 24 timer var i størrelsesorden 1,7 og 2,5 uM Frondoside A for alle cellelinjer.
Eksponensielt voksende LNM35 (A), A549 (B), NCI-H460 -Luc2 (C), MDA-MB-435 (D), MCF-7 (E), og HepG2 (F) celler ble behandlet med bærer (0,1% DMSO), og de indikerte konsentrasjoner av Frondoside A. Levedyktige celler ble analysert som beskrevet i materialer og metoder. Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger.
Kolonner
, mener;
barer
, S.E.M. ** Signifikant forskjellig på P 0,01, *** Signifikant forskjellig på P . 0.001
Frondoside A induserer caspase-3/7 aktivering
Caspase-3/7 aktivitet er essensielt i apoptotiske celledød veier. Den relative aktivitet av caspaser 3/7 ble analysert i LNM35 celler behandlet i 2 og 24 timer med Frondoside A (1-2,5 mm), og normalisert til antall celler per brønn. Som vist på fig. 2, caspase 3/7 aktiviteten økt med 2,5 og 10,8 ganger i LNM35 celler behandlet i 24 timer med Frondoside A 1 og 2,5 mikrometer henholdsvis. Lignende effekt ble observert etter behandling med Frondoside A (1-2,5 mm) i 2 timer (data ikke vist).
ble analysert i LNM35 celler behandlet i 24 timer med Frondoside A (1-2,5 mm), normalisert til antallet levedyktige celler pr brønn og uttrykt som gangers induksjon sammenlignet med kontrollgruppen. * Signifikant forskjellig på P . 0,05
Impact of Frondoside A på LNM35 xenografter
For å bekrefte den farmakologiske relevansen av våre
in vitro
data, anticancer aktivitet av Frondoside A ble undersøkt
in vivo
i atymiske mus inokulert med LNM35 lunge kreftceller. Veksten av LNM35 menneskelig tumorxenotransplantater ble overvåket hver tredje eller fjerde dag i 25 påfølgende dager etter daglig i.p. injeksjon av 0,01 mg og 1 mg /kg av Frondoside A. Behandling med den laveste dose av Frondoside A (0,01 mg /kg /dag) reduserte volumet av LNM35 xenotransplantater med 41% (fig. 3A). En tilsvarende forskjell ble også funnet i tumorvekt ved slutten av eksperimentet (2,1 +/- 0,3 g versus 4,5 +/- 0,8 g;
P 0,05
Fig. 3C). Behandling med den høyeste dosen (100 ganger) av Frondoside A (1 mg /kg /dag) reduserer omtrent 43,9% tumorvolum av de LNM35 xenotransplantater (Fig. 3B). Nesten lik forskjell ble funnet i tumorvekt ved slutten av eksperimentet (3 +/- 0,5 g versus 4,5 +/- 0,8 g, Fig. 3D). Dette forsøk viste tydelig at den laveste dosen av Frondoside A (0,01 mg /kg /dag) er optimal for inhibering av tumorvekst. Det var ingen manifest bivirkninger av Frondoside en behandling på dyrs atferd eller kroppsvekt i enten eksperiment (Fig. 3E og 3F). I tillegg var det ingen synlige misdannelser ved obduksjon, eller andre åpenbare tegn på toksisitet som tidligere beskrevet av vårt team [7]
A) B) Tumor volum av LNM35 xenografter inokulert subkutant i nakne mus og behandlet med Frondoside A (0,01 og 1 mg /kg, intra-peritoneal injeksjon, henholdsvis) eller kontroll bærerløsning alene, for en total av 25 dager. Datapunkter representerer gjennomsnittet ± S.E.M. av 6 mus per gruppe. C) D) Tumorvekt oppnådd fra den samme kontroll og behandlede nakne mus. Datapunkter representerer gjennomsnittet ± S.E.M. av 6 mus per gruppe.
Kolonner
, mener;
barer
, S.E.M. E) F) Kroppsvekt av disse mus. Datapunkter representerer gjennomsnittet ± S.E.M. av 6 mus per gruppe. * Signifikant forskjellig på P . 0,05
Hemming av angiogenese ved Frondoside A i xenopodet svulster og CAM-testen
in vivo Hotell og i kapillær-lignende strukturer
i vitro
Angiogenese er et attraktivt mål i kreftterapi, ikke bare fordi den leverer oksygen og næringsstoffer for overlevelsen av tumorceller, men gir også ruten for metastatisk spredning av disse kreftceller. Først, viser vi at de prolifererende områder på omkretsen av svulsten, ble microvessel tetthet (målt ved hjelp av CD31-farging) signifikant redusert med Frondoside A (0,01 mg /kg /dag) (Fig. 4, høyre panel) i sammenligning med styrebehandlet svulster (fig. 4, venstre panel). Deretter brukte vi CAM-testen involverer koordinering og integrering av flercellede responser under utviklingen av kylling embryo for å bekrefte denne potensielle anti-angiogene virkning av Frondoside A. Som vist på fig. 5 og 6, bFGF (2 ug /ml), stimulert 15% nydannelse kar med angiogene indeks statistisk forskjellig sammenlignet med kontrollen DMEM-medium. Frondoside A (100 og 500 nM) hemmet basal angiogenese i en konsentrasjonsavhengig måte med henholdsvis 7% og 12% hemning av angiogen indeks sammenlignet med kontrollen (Fig. 5 og 6). Dannelsen av nye blodkar som induseres av bFGF ble også fullstendig undertrykket ved Frondoside A (500 nM) (fig. 5 og 6). Til slutt, for å vurdere om den anti-angiogene effekten av Frondoside A innebærer direkte interaksjon av forbindelsen med endotelceller, gjennomførte vi sammenlignende studier på dannelsen av kapillær-lignende strukturer
in vitro
, ved hjelp HUVECs belagt på Matrigel -belagte plater. Som vist på fig. 7A, humane endoteliale celler har evnen til å danne kapillarstrukturer når utsådd og dyrket på toppen av Matrigel substrat. Kontrollceller bevege seg fra deres første ensartet mønster av dispergerte cellelag og knytte til å danne et nettverk av cellegruppene som er forbundet med lange, flercellede prosesser som fører til dannelse av rør-lignende strukturer. Tilsetning av ikke-toksiske konsentrasjoner av Frondoside A (0,01-1 mm) resulterte i en markert hemming av denne spontane angiogen fenotype (Fig. 7A, 7B og). Frondoside En indusert hemming av denne spontane angiogen fenotype skjedd uten betydelig reduksjon av cellenes levedyktighet (fig. 7C). Samlet utgjør disse dataene bekrefter en sterk anti-angiogenic potensialet i Frondoside A.
Immuno-histokjemisk farging av lunge xenografttumorer for CD31 (microvessel tetthet).
CAM ble behandlet med kontroll (serumfritt medium), 100 nM Frondoside A, 500 nM Frondoside A, 2 ug /ml bFGF, 2 ug /ml bFGF + 500 nM Frondoside A og vaskularisering av testplater ble fotografert.
Barer
indikerer angiogene indekser (%) av CAM er undersøkt med to mikrogram /ml bFGF, 100 nM Frondoside A, 500 nM Frondoside A, 2 mikrogram /ml bFGF + 500 nM Frondoside A. data representerer gjennomsnitt ± SD (Mann-Whitney U-test, *: p 0,05, ***: p 0,01). I hvert forsøk ble seks egg testet per tilstand.
A) Mønstre angiogenese indusert av menneskelige umbilical vein endotelceller (HUVEC) dyrket på Matrigel matrise i 96-brønners plater i fravær eller nærvær av den Frondoside A. B) Kvantifisering av rørformede morfogenese indusert i HUVEC-celler dyrket i fravær eller nærvær av Frondoside A. grunnsdannelsen ble bestemt ved lengden av rør-lignende strukturer som inneholder tilkoblede celler. Data er gjennomsnitts ± SEM fra tre separate forsøk. Stjernene indikerer at signifikant forskjellige verdier ble erholdt i nærvær av de angitte inhibitorer sammenlignet med den tilsvarende kontroll stimulering. *** Signifikant forskjellig på P 0,001. C) HUVEC-celler ble behandlet med bærer (0,1% DMSO), og de indikerte konsentrasjoner av Frondoside A. Levedyktige celler ble analysert som beskrevet i Materialer og Metoder. Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger.
Kolonner
, mener;
barer
, SEM
Frondoside En svekker også lungekreft celle migrasjon og invasjon
in vitro Hotell og metastase
in vivo
Cancer progresjon er forbundet med oppheving av normale kontroller som begrenser cellemigrering og invasjon, til slutt fører til metastase. Lungekreftpasienter har høy risiko for tilbakefall i form av metastatisk sykdom. Metastasering starter med celle migrasjon i primærtumor, som fører til lokale vev invasjon og oppføring i lymfe eller blodkar. Evnen til Frondoside A for å redusere cellemigrasjon ble undersøkt ved hjelp av en klassisk
in vitro
sårtilheling modell. Frondoside En redusert cellulær migrasjon av LNM35 celler i en treringstrinnet og tidsavhengig måte (fig. 8A). Tilsvarende Frondoside A svekket invasjonen av LNM35 celler i matrigel invasjon assay (fig. 8B). Frondoside En indusert hemming av cellulær migrering og invasjon matrigel skjedd uten betydelig reduksjon av cellenes levedyktighet (fig. 1A).
A) Sårene ble innført i LNM35 konfluente monosjikt dyrket i nærvær eller fravær (kontroll) av Frondoside A (0,1-0,5 mm). Den midlere avstand at cellene reist fra kanten av skrapet området på 6, 24 og 30 timer ved 37 ° C ble målt på en blindet måte, ved hjelp av et invertert mikroskop (4 x forstørrelse). Dataene er midler ± SEM av to uavhengige eksperimenter. B) LNM35 cellene ble inkubert i 24 timer i nærvær eller fravær av Frondoside A (0,01-1 mm) og LY294002 (20 uM). Celler som invaderte inn Matrigel ble scoret som beskrevet i materialer og metoder.
Kolonner
, mener; barer, S.E.M. Lymfeknuter metastase vekt av etablerte humane lungekreft xenotransplantater ble behandlet med Frondoside A 0,01 mg /kg (C) og 1 mg /kg (D) hver dag i 25 dager.
Kolonner
, mener;
barer
, S.E.M. * Signifikant forskjellig på P 0,05, ** Signifikant forskjellig på P 0,01, *** Signifikant forskjellig på P . 0.001
Deretter vurderte vi de metastatisk oppførsel av den menneskelige lungecellelinje LNM35 ved å undersøke axillaris lymfeknuter. Histologisk undersøkelse av lymfeknuter i LNM35-bærende mus avslørte tilstedeværelsen av LNM35 celler i alle lymfeknuter fra både kontroll- og Frondoside A-behandlede mus (data ikke vist). I kontrollgruppen-behandlede gruppe, var gjennomsnittlig lymfeknutene vekt var 548.5 +/- 112,8 mg, sammenlignet med 256 +/- 43,3 og 268,8 +/- 55,7 mg i gruppene behandlet med Frondoside A 0,01 mg og 1 mg /kg /dag, henholdsvis (fig. 8C og 8D).
Frondoside En forsterker antikreft-aktiviteten til cisplatin
Som vist i fig. 9A, daglig administrering av Frondoside A til nakne mus reduserte veksten av LNM35 humane tumorxenografter med 40,3% ved dag 10. Inhibering av LNM35 tumor xenograft vekst ved Frondoside A ble sammenlignes med det som produseres av den DNA-skadende anticancermiddelet cisplatin (46,9% ). Kombinert behandling av Frondoside A med cisplatin resulterte i en bemerkelsesverdig potensering (67,6%;
P 0,05
) av cisplatin terapeutisk effekt (Fig. 9A). Det var ingen manifest bivirkninger av den kombinerte behandlingen på dyrs atferd eller kroppsvekt (Fig. 9B).
A) Frondoside En forsterker cisplatin effekt mot NSCLC LNM35 celler som vokser som xenografter. B) Effekt av Frondoside A og cisplatin alene eller i kombinasjon med kroppsvekt. * Signifikant forskjellig på P . 0,05
Diskusjoner
Til tross for fremskritt innen molekylærbiologi for lungekreft, forbedret diagnostikk, og selv optimale målet terapi, gjeldende protokoller for behandling av lunge kreft er fortsatt utilstrekkelig for å produsere slående klinisk nytte og helbredelse av lungekreft pasienter forblir mislykket. De nåværende målrettede terapi narkotika utvikle resistens, og de er svært kostbart og ikke tilgjengelig for de fleste lungekreftpasienter i verden. Mange legemidler har relativt lav aktivitet; Noen pasienter er herdet, med en kort, om noen, økning i overlevelse [17]. Historien om anti-kreftmidler, slik som paclitaxel, viser at virkningsmekanismen er identifisert flere år etter at den kliniske effekt ble demonstrert. Til tross for ikke å vite stoffets virkningsmekanisme, tror vi at
in vitro
samt den sterke
in vivo
anti-kreft effekt av Frondoside En bør oversette i klinikken til en ny potent anti lungekreft agent.
i denne studien undersøkte vi effekten av Frondoside A på lungekreft celler progresjon. Vi viste at Frondoside A forårsaket konsentrasjon-responsive (0,01-5 mm) nedgang i levedyktigheten til LNM35, A549, og NCI-H460-Luc2 celler over 24 timer gjennom caspase 3/7 avhengig celledød veien. IC50-konsentrasjoner (som produserer halv-maksimal inhibering) ved 24 timer var mellom 1,7 og 2,5 pM Frondoside A. Disse resultatene er i overensstemmelse med tidligere publiserte resultater som lav konsentrasjon av Frondoside A hemmer veksten av humane kreft i bukspyttkjertelen celler og indusert apoptose gjennom caspase 9 /3/7, øket Bax, redusert bcl-2 og MCL-1, og arrestert cellesyklus og opp-regulert p21 [8], indusert apoptose i humane leukemiceller via caspaseaktivering [6], og i betydelig grad reduserer levedyktigheten av østrogenreseptor (ER) -negative MDA-MB-231 brystcancerceller ved å indusere apoptose via Caspase9-Caspase3 /7 indre vei [7]. Det er også blitt vist at Frondanol A5, en uren ekstrakt fra
Cucumaria frondosa
huden hvorfra Frondoside A er opprinnelig stammer, indusert vekstinhibisjon ved S og G2-M-fase med en reduksjon i Cdc25c og en økning i p21
WAF1 /CIP1 med betydelig apoptose assosiert med H2AX fosforylering og caspase-2 spalting i tykktarm kreft-avledet HCT116-celler [4]. En andre papir også vist at Frondanol-A5P, en polar bunnfall under brøkdel av Frondanol-A5, hemmet spredning og induserte G2 /M fase cellesyklus arrest i to kreft i bukspyttkjertelen celler med redusert uttrykk for cyclin A, cyclin B, og cdc25c [ ,,,0],18]. Dette anticancer virkning av Frondoside A ikke er vevsspesifikk, og i denne sammenheng vi demonstrert at Frondoside A induserte en konsentrasjonsavhengig reduksjon i celleviabilitet av melanom MDA-MB-435, bryst MCF-7, og de hepatom HepG2 celler.
for å vurdere virkningene av Frondoside A på lungetumorutvikling
in vivo
, LNM35 xenografter ble gjort i immunundertrykt mus. Vi har vist at intraperitoneal administrering av Frondoside A forårsaket en sterk regresjon av etablerte tumorer. Maksimal inhibering ble oppnådd med en lav dose på 0,01 mg /kg /dag i 25 dager. En 100 ganger høyere dose, gir lignende effekter som indikerer at økning av dosen vil ikke forbedre anti-kreft effekt av Frondoside A. kreft inhiberende virkning av Frondoside A er blitt observert tidligere i ASPC-1 bukspyttkjertelen og MDA-MB-231-xenografter i atymiske mus [7], [8]. Denne anti-tumoreffekten til Frondoside A kan være delvis på grunn av sin immuno-stimulerende effekt [13] og /eller anti-angiogen effekt. I denne studien demonstrerte vi for første gang, at Frondoside A er en sterk anti-angiogent middel. Det reduserer microvessel tetthet (målt ved hjelp av CD31-farging) i xenopodet tumoren behandlet med Frondoside A og også i betydelig grad reversere basal og bFGF-indusert angiogenese i CAM-angiogenese-analysen. Tilsvarende Frondoside En fullstendig undertrykt kapillarstruktur dannelse på substratet av Matrigel humane endotelceller.
Angiogenese er et attraktivt mål i kreftterapi, ikke bare fordi den leverer oksygen og næringsstoffer for overlevelsen av tumorceller, men gir også ruten for metastatisk spredning av disse kreftceller. Kreft progresjon er assosiert med oppheving av de vanlige kontrollene som begrenser celle migrasjon og invasjon, som fører til slutt til metastasering.
