Abstract
Vi viste tidligere at DNA-fragmentering faktor, som består av en caspase-3-aktivert DNase ( CAD) og dens inhibitor (ICAD), kan påvirke frekvensen av celledød ved å generere PARP-1-aktiverende DNA pauser. Her testet vi hypotesen om at ICAD-mangel kolon epitelceller utviser motstand mot døds stimuli kan samle flere genetiske modifikasjoner, som fører til tumorigent fenotype. Vi viser at ICAD mangel kan være forbundet med kolon kreft hos mennesker. Faktisk, en undersøkelse av ICAD uttrykk ved hjelp av immunhistokjemi i en rekke både tykktarmskreft og normalt vev avdekket at Icad uttrykk nivåer ble alvorlig kompromittert i kreftvevet. Ved DNA-skader forårsaket av en lav dose av bestråling, Icad celler skaffe tumorigent fenotype. Tykktarm epitelceller utledet fra ICAD mus viste en betydelig motstand mot død indusert av kolon kreftfremkallende dimetylhydrazin in vitro og hos mus. En slik motstand var assosiert med en reduksjon i PARP-1-aktivering. I en dyremodell for dimetylhydrazin-indusert colon tumorigenesis, ICAD
– /- mus utviklet betydelig høyere antall svulster med markert større størrelser enn villtype kolleger. Interessant, fenotypen av ICAD
– /- mus var ikke assosiert med en signifikant økning i den avvikende forstadier krypten foci som tyder på en mulig kobling til tumorprogresjon i stedet for initiering. Enda viktigere, ble ICAD mangel assosiert med alvorlig genomisk ustabilitet som vurderes av utvalg komparativ genomisk hybridisering. Slike genomisk ustabilitet besto mest fremtredende av presiseringer, men med betydelig slettinger i forhold til villtype kolleger som berører flere kreftrelaterte gener inkludert
RAF-en
,
GSN
,
LMO3
og
Fzd6
uavhengig av
p53
. Til sammen våre resultater presentere et levedyktig sak for involvering av ICAD mangel på kolon kreftutvikling og viser at apoptose og genomisk ustabilitet kan omfatte de midler som for eksempel mangel kan bidra til prosessen med å øke mottakelighet for kreftfremkallende-indusert tumordannelse.
Citation: Errami Y, Brim H, Oumouna-Benachour K, Oumouna M, Naura AS, Kim H, et al. (2013) ICAD mangel i Human tykktarmskreft og Predisposition til Colon tumorigenesis: Kobling til apoptoseresistens og Genomisk ustabilitet. PLoS ONE 8 (2): e57871. doi: 10,1371 /journal.pone.0057871
Redaktør: Vincenzo Coppola, Ohio State University Comprehensive Cancer Center, USA
mottatt: 10. august 2012; Godkjent: 29 januar 2013; Publisert: 22 februar 2013
Copyright: © 2013 Errami et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet, delvis ved tilskudd RSG-116608 fra American Cancer Society (https://www.cancer.org/) og tilskudd HL072889 fra National Institutes of Health (https://www.nhlbi.nih.gov/) til AHB. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne ønsker å oppgi at HB og HA er PLoS ONE redaksjonelle styremedlemmer. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Colon kreftutvikling er en flertrinns prosess som krever mange år å utvikle, og er assosiert med flere nylig karakterisert genetiske endringer [1], [2], [3]. Forekomsten av inaktivere mutasjoner i begge alleler av
adenomatøs polypose coli
genet (
APC
) [2], en tumor suppressor gen, anses å være en av de første hendelsene i kolorektal kreftutvikling . Mutasjon og påfølgende feilregulering av
K-RAS
proto-onkogen er også antatt å være et tidlig medvirkende faktor til tykktarmskreft [4]. Omsetningen av epitelceller er relativt raske og genetiske endringer som gjør disse cellene er resistente mot apoptose eller mer proliferativ er kritiske hendelsene som starter i tykktarm tumorigenesis [4]. Den påfølgende opphopning av mutante epitelceller bidrar til dannelse av strukturer som kalles avvikende krypten foci (ACF) [5].
Fragmentering av DNA er tenkt å være et viktig skritt i disponering av genomet av apoptotiske celler. Samtidig med spaltning av atom lamin, blir DNA først brytes ned til store fragmenter på 50 til 300 kb, som deretter bearbeides til internucleosomal gjentar [6], [7]. DNA-fragmentering faktor (DFF) har blitt foreslått for å bidra til denne fremgangsmåten [8]. DFF er sammensatt av to subenheter, et 40-kDa caspase-aktivert DNase (CAD) eller DFF40 og dets 45-kDa inhibitor ICAD (DFF45) [8], [9], [10]. Den endonuklease-aktiviteten av dette enzym, som er iboende for CAD, er indusert på spaltning av ICAD av caspase-3. Icad fungerer både som en inhibitor av CAD-aktivitet og som en anstand for denne underenheten [10], [11], [12]. Faktisk er ICAD kreves for CAD ekspresjon og overflod av endonukleasen i ICAD
– /- celler som er sterkt redusert sammenlignet med den i villtypeceller [8], [9], [10], [13]. Vi og andre [13], [14], [15], [16], [17] rapportert at en rekke celletyper, inkludert immunceller, fibroblaster, og kortikale neuroner avledet fra ICAD
– /- mus, vise motstand mot apoptose indusert av ulike stimuli. Vi demonstrerte også viktigheten av DFF i fragmentering av DNA inn i 50-kb stykkene under apoptose [13], [14], [15], [16], [17]. Genereringen av disse DNA-strengbrudd resulterer i tidlig og forbigående aktivering av PARP-1. PARP-1-mediert poly (ADP-ribosyl) asjon resulterer i en markant nedgang i de intracellulære konsentrasjoner av NAD og ATP, og skaper en cellulær energi mangel som er tenkt å bidra til akselerasjon av dødsprosessen [13], [16], [18], [19]. Vi har vist at svikt i ICAD
– /–fibroblaster for å generere 50-kb DNA-fragmenter som respons på TNF-α beskyttet cellene fra overdreven aktivering av PARP-1 og derved hindret utarming av intracellulære NAD [13], [16] . Forsinkelsen i PARP-1-aktivering observert i disse cellene korrelerte med forsinkelser både i kaspase-3 aktivering og i pro-apoptotiske mitokondrielle hendelser, inkludert tap av mitokondriemembranpotensialet og frigjøring av cytokrom c [13], [16]. Basert på disse forskjellige observasjoner foreslår vi at dannelsen av 50-kb DNA-fragmenter ved DFF er ikke bare en passiv trinn i DNA degradering, men snarere at den bidrar, sammen med PARP-1, mitokondrier og caspase-3, til et forsterker fase av apoptose [13], [16].
ICAD ekspresjon og mutasjoner i
ICAD
-genet ble nylig forbundet med en rekke humane ondartede sykdommer, så vel som med en dyremodell av hudkreft [20], [21]. I tillegg Konishi et al. rapportert at ICAD mRNA uttrykk var lavere i spiserøret plateepitelkarsinom svulster med høyere patologisk grad sammen med lymfeknutemetastase [20]. Omvendt, ble ICAD proteinekspresjon rapportert å være hyppig oppregulert i eggstokkene serøse karsinomer og kan tjene som en markør for aggressiv oppførsel med prognostisk verdi [22]. Gitt betydningen av apoptose i vedlikehold av tarmvevet og dens feilregulering i kolon kreftutvikling, vi ment i denne studien å undersøke om mulig sammenheng mellom involvering av ICAD i apoptose og genomisk stabilitet kan være avgjørende for å forebygge tykktarms tumorigenesis. I tillegg, søkte vi å bestemme hvorvidt svikten av colonic epithelial celler til å uttrykke ICAD gjort dem mottakelige for å akkumulere genetiske avvik i tillegg til en potensiell evne til å motstå induksjon av apoptose, og øker følsomheten av disse dyrene til karsinogen (dimetylhydrazin; DMH) -indusert kolon tumorigenesis. For disse studiene, brukte vi en integrerende tilnærming gre en rekke menneskelige tykktarmskreft og normalt vev, en nyutviklet metode for å isolere primær kolon epitelceller, og en veletablert DMH-indusert musemodell for tykktarmskreftutvikling.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
den aktuelle studien ble gjennomført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Vedlikehold (IACUC protokollen: BC0015) og eksperimentell protokoll (IACUC protokollen: 2227) ble godkjent av LSUHSC Animal Care og bruk komité. Den tykktarmskreft mid-density vev array (kjøpt fra USA Biomaks Inc. Rockville, MD, USA) og de 23 menneskelige eksemplarer av tykktarmskreft og normalt vev (LSUHSC patologi kjerne) faller inn under IRB fritak type 4.
dyr og behandling
WT og ICAD
– /- mus, både opprettholdt på et C57BL /6 × 129 /sv bakgrunn, ble oppdrettet i et bestemt patogen fri anlegget på LSUHSC, New Orleans, LA, og tillot ubegrenset tilgang til sterilisert chow og vann
ad libitum Hotell og vedlikeholdt på en 12-timers lys-12-timers mørk planen. Ved 5 uker gamle mus (12 dyr per gruppe) mottok en
ip
injeksjon av 20 mg /kg DMH (Sigma, St. Louis, MO) i saltløsning inneholdende 1 mM EDTA gang i uken i åtte uker . Dyrene ble deretter avlivet av CO
2 kvelning 12 eller 24 uker senere. For akutte eksponeringer, mus fikk en enkelt
i.p..
Injeksjon av 20 mg /kg av stoffet og ofret enten 24 eller 48 timer senere. Kolon ble fjernet og fiksert med formalin. Noen mus ble anvendt for å isolere primær CECs som beskrevet nedenfor.
Isolering av primær kolon epitelceller, immunfluorescens, behandlinger, måling av cellenes levedyktighet og klonogene assay
Kolon ble åpnet i lengderetningen og vasket grundig med kalsium- og magnesium-free HBSS supplert med antibiotika. Tissue segmenter ble inkubert i 90 min ved 37 ° C i fullstendig DMEM-medium inneholdende 20% FBS, 2% Luria næringsmedium, glutamin, 10 mg dispase, og 0,2% kollagenase I (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ) med konstant forsiktig omrøring. Digestionen ble vasket med HBSS ved sentrifugering og deretter resuspendert i fullstendig medium uten enzymer. Isolerte kolon krypter ble deretter sådd ut og inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2 i 24 timer, hvoretter flytende kryptene ble overført til en ny plate i fullstendig medium. Effektiviteten av celleisolasjon ble bedømt ved graden av renhet av krypter og det lave antall døde celler. Epithelial naturen av cellene ble vurdert ved immunofluorescens med antistoffer mot pan-cytokeratin (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA) som beskrevet tidligere [23]. For celledød analysen ble CECs fremstilt i 24-brønners plater og behandlet med en kombinasjon av 2,5 ng /ml TNF-α, 5 ug /ml cykloheksamid, og 3 mM smørsyre (TNF + CHX + BA) eller med 1 mM DMH i 24 timer som beskrevet tidligere. Cellelevedyktigheten ble analysert i kvadruplikat prøvene, ved hjelp av kalsein-AM-farging som tidligere beskrevet [23]. For den klonogene analysen, WT og ICAD
– /- musefibroblaster (beskrevet [13]) ble utsatt for IR (2 Gy), hvoretter cellene ble sådd ut i 35-mm skåler i 0,5% lavt smeltepunkt agarose på en seng av 1% edel agar i fullstendig DMEM-medium. Kolonier ble scoret med en automatisert teller og resultatene er uttrykt som fold-økning sammenlignet med verdien for humbug-bestrålt WT celler.
Histopatologi og Immunohistochemistry (IHC).
Serial seksjoner fra parafin -embedded colonic vev ble fremstilt ved å bruke standardmetoder. Hver femte delen ble utsatt for H E farging for rutinemessig histologisk evaluering. Pycnotic /apoptotiske celler ble bestemt ved kjernekondensering, cellefragmentering, krymping, og /eller løsrivelse fra mucosa, hjulpet med TUNEL assay (Millipore, Billerica, Massachusetts). Tunel analysen ble ikke brukt som et hovedvirkemiddel for å avgjøre pycnosis /apoptose gitt at ICAD
– /- celler mislyktes, generelt, for å vise åpenbare positive signaler på merking. Den tykktarmskreft mid-density vev array (103 tilfeller /208 kjerner) ble kjøpt fra USA Biomaks Inc. (Rockville, MD, USA). Tjue tre eksemplarer av tykktarmskreft og tilstøtende normalt vev ble kjøpt fra LSUHSC patologi kjernen. Vevssnitt ble utsatt for IHC med primære antistoffer mot ICAD (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), poly (ADP-ribose) (BD Pharmingen, San Diego, CA), PCNA (Novusbio, Littleton, CO), MCP-en (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), COX-2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) som beskrevet tidligere [24]. Vurdering av immunoreaktivitets og sammenligninger mellom grupper ble utført blindt av en sertifisert patolog (L. Del Valle). For vev rekke analyse, ble ICAD immunoreaktivitets klassifisert som høy (≥4 +), moderat /høy (3+), moderat /lav (2+), lav (1+), eller negativ (-). Resultatene er uttrykt som prosent positivitet av totalt prøver (kreft eller normal)
Identifisering og telling av ACF og svulster
ACF ble identifisert i H .. E-farget seriesnitt på grunnlag av nærværet av atypiske kjerner, størrelse, økt pericryptal område, og fortykket lag av epitelceller hjulpet ved hjelp av en patolog (
K. Fallon
). ACF med 2 eller flere kjertler ble inkludert i vurderingen. Diameter av svulster ble vurdert ved hjelp av en stereomikroskop.
Profilering av kromosomavvik av aCGH.
Profilen kromosomavvik i tarmvevet (isolert fra parafininnstøpte vev) fra DMH-behandlede WT eller ICAD
– /- mus ble vurdert ved hjelp av en oligo microarray-baserte CGH med en chip som inneholder 105.000 mus genomiske sonder (Agilent, Santa Clara, CA, www.agilent.com). Referanse kontroller var DNA isolert fra tykktarm vev av samme alder naive WT eller ICAD
– /- mus. Referanse- og test DNA ble spaltet med
Alu
I og
Rsa
I (Promega, Madison, WI), og renset med QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen, Germantown, MD). Test-DNA (1 pg) og referanse-DNA (1 pg) ble merket ved tilfeldig priming med henholdsvis Cy5-dUTP og Cy3-dUTP, ved hjelp av Agilent Genomisk DNA Labeling Kit Plus. De individuelt merket test- og referanseprøver ble konsentrert ved hjelp Microcon YM-30 filtre (Millipore, Bille, MA) og deretter kombinert. Etter sonde denaturering og pre-annealing med mus Cot-1 DNA, ble hybridisering utført ved 65 ° C med rotasjon i 40 timer ved 20 rpm. Fire trinnene ble utført med Agilent Oligo CGH vaskinger: Vaskebuffer 1 ved romtemperatur i 5 min, vaskebuffer 2 ved 37 ° C i 1 minutt, en acetonitril skylle ved romtemperatur i 1 min og 30 sek vask ved romtemperatur i Agilent stabilisering og Tørking Solution. Alle lysbildene ble skannet på en Agilent DNA microarray scanner. Data, inkludert kopiantall Variasjoner ble oppnådd ved Agilent Feature Extraction programvare 9 og analysert med Agilent Genomisk Workbench programvare 5.0, ved hjelp av statistiske algoritmer z rille og ADM-2 ifølge sensitivitetsterskelen henholdsvis 2,5 og 6,0 og en glidende gjennomsnitt vindu på 0,2 Mb.
data~~POS=TRUNC analyse~~POS=HEADCOMP
Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av verdier fra minst seks mus per gruppe, eller fra 4 til 6 replikater av den samme behandling av de dyrkede celler. PRISM software (GraphPad, San Diego, CA) ble benyttet for å analysere forskjellene mellom forsøksgruppene av enveis ANOVA etterfulgt av Dunnetfs multiple sammenligningstest. Analysen av aCGH data ble beskrevet ovenfor.
Resultater
Sammenhengen mellom ICAD mangel og tykktarm kreft hos mennesker
Vi initiert våre studier ved å gjennomføre en direkte undersøkelse av ICAD uttrykk ved hjelp av immunhistokjemi i en rekke både tykktarmskreft og normalt vev. Ekspresjonen av ICAD syntes å være mer fremtredende i epitelceller i normal tykktarmsslimhinne med en primær kjerne subcellulære lokalisering (Fig. 1A). Icad ekspresjonsnivåer ble imidlertid svekket i cancervev (Fig. 1A). Det er viktig å merke seg at kronisk betennelse, og de antatte stressresponser assosiert med en slik inflammasjon synes ikke å påvirke uttrykket nivåer eller subcellulære lokalisering av ICAD i tykktarmen (fig. 1B). Figur 1C gir en kvantitativ vurdering av Icad ekspresjonsnivåer i vevet matrise: mer enn 40% av kreftvev ble ansett å være vesentlig tømt for ICAD. Det vil forstås at styrken av data oppnådd ved bruk av vev matriser kan bli begrenset gitt det faktum at de ikke kan inneholde normale tilstøtende colonic vev som interne kontroller. For å omgå denne begrensningen vi undersøkte uttrykk for ICAD i 23 humane prøver av tykktarmskreft i forbindelse med normalt vev hentet fra de samme pasientene. Analyse av vev indikerte at Icad ekspresjonsnivåer var infiltrert i cancervev som vist i figur 1D (nedre panel) sammenlignet med det som registreres i normal tarmvev fra den samme pasient; 17 ut 23 prøvestykker viste en reduksjon i nivået av ICAD sammenlignet med nivåer som detekteres i tilstøtende normale vev. De resterende prøvene viste moderat til liten endring i ICAD immunoreaktivitets. Til sammen disse resultatene etablere en potensiell sammenheng mellom ICAD mangel og tykktarm kreft. Men en mer detaljert undersøkelse var nødvendig for å forstå og etablere forholdet mellom ICAD mangel og tykktarm kreft, spesielt de som er knyttet til undersøkelse av involvering av protein i cellen skjebne og genetisk endring som fører til tumorigenesis.
(A ) Tissue matriser inneholdende seksjoner fra normal tykktarm (n = 60) eller cancer (n = 131) vev ble utsatt for immunhistokjemisk farging med antistoffer mot humant ICAD. (B) Expression nivåer av ICAD i kronisk betent tykktarm. (C) Omfanget av ICAD immunoreaktivitets ble vurdert og klassifisert som høy (≥4 +), moderat /høy (3+), moderat /lav (2+), lav (1+), eller negativ (-); Resultatene er uttrykt som prosent positivitet av totalprøver (kreft eller normal). (D) Normale og cancervev ble fiksert i formalin, innebygd (både normale og syke vev fra hver pasient ble innleiret sammen), seksjonert, og deretter underkastet IHC med antistoffer mot humant ICAD. Svarte bokser i (A, B og D) angir de forstørrede regioner.
Fremme av tumorigent fenotype ved ICAD mangel ved eksponering for DNA-skader indusert av lavdose ioniserende stråling (IR)
Vi viste tidligere at ICAD mangel reduserer følsomheten til (TNF-α) -indusert celledød [13], [25]. For å avgjøre om apoptose-resistent fenotype av ICAD
– /- fibroblaster forfremmet sin transformasjon etter induksjon av DNA-skader, vi undersøkte evnen til disse cellene til å danne kolonier i myk agar. Villtype (WT) og ICAD
– /- celler ble først utsatt for en lav-dose (2 Gy) IR, hvoretter de ble suspendert i agar med fullstendig medium, og kolonier ble tellet etter inkubering i 3 uker. Figur 2A viser at ICAD mangel resulterte i en signifikant (på 6,5 ganger) økning i evnen til cellene til å danne kolonier i bløt agar etter eksponering for IR; Det er bemerkelsesverdig at koloniene er utviklet av villtypeceller var liten i antall og størrelse. Disse resultatene tyder på en avgjørende rolle for ICAD i celle homeostase og at ICAD mangel kan bidra til tumorigent fenotype ved DNA-skader
(A) ICAD
-. /- Og WT mus fibroblaster ble enten utsatt for IR (2 Gy) eller sham-bestrålt, hvoretter de ble dyrket i myk agar med komplett medium i 3 uker. Kolonier ble deretter tellet med en automatisert teller. Data er uttrykt som en prosentandel av verdien for sham-bestrålte WT celler og er middelverdier ± SD fra tre paralleller fra et representativt eksperiment. *, Forskjellen fra humbug-bestrålt WT celler, p 0,05; #, Forskjellen fra WT celler eksponert for IR (2 Gy), p 0,05. (B) CECs ble fremstilt fra WT mus og lov til å forplante seg i 4 dager. Cellene ble deretter fast og utsatt for immunfluorescens med antistoffer mot pan-cytokeratin (rød) eller flekker med DAPI (blå); toppanelet er et eksempel på CECs visualisert ved lyse felt mikroskopi. Gule piler indikerer colonic krypter. (C) CECs, isolert fra WT eller ICAD
– /- mus, ble behandlet med 2,5 ng /ml TNF i kombinasjon med 5 ug /ml cykloheksamid og 3 mM smørsyre (betegnet som TNF + CHX + BA) eller 1 mM DMH. Celler ble inkubert i 48 timer i fravær eller nærvær av TNF + CHX + BA eller DMH, hvoretter, hvoretter cellelevedyktigheten ble bedømt ved måling av kalsein-AM fluorescens. Data er uttrykt som en prosent av levedyktigheten til ubehandlede celler, og er middel ± S.D. av verdier fra fire brønner fra et representativt eksperiment. *, Forskjellen fra respektive kontroll, p 0,05. #, Forskjellen fra respektive behandlede celler, p 0,05. (D) Mus fikk en IP-injeksjon av 20 mg /kg DMH eller saltvann (kontroll). Mus ble avlivet etter 48 timer, og deres distale kolon ble fjernet og formalinfiksert. Vevssnitt ble deretter fremstilt og underkastet H E farging eller TUNEL-farging. Pycnotic /apoptotiske celler ble bestemt ved kjernekondensering, cellefragmentering, krymping, og /eller løsgjøring fra mucosa, hjulpet med TUNEL assay. I gjennomsnitt ble 40 krypter pr seksjon telles. Resultatene er uttrykt som antall pycnotic /apoptotiske celler pr mm
2. Dataene er middelverdier ± SD av verdier fra minst seks mus pr gruppe. *, Forskjell fra de respektive ubehandlede mus;
p
0,01; #, Forskjellen fra WT mus eksponert for DMH,
p
0,01. (E) Mus ble behandlet som i (D) med unntagelse av at de ble avlivet etter 24 timer. Distale kolon ble fjernet og formalinfiksert. Vevssnitt ble deretter fremstilt og underkastet IHC med antistoffer til poly (ADP-ribose). Røde bokser indikerer forstørrede regioner; gule piler viser poly (ADP-ribose) -immunoreactive kjerner. (F) En kvantifisering av poly (ADP-ribose) -immunoreactive kjerner av CECs i kolon mukosa av de ulike forsøksgrupper.
foreningen mellom ICAD-genet delesjon og en reduksjon i følsomheten av kolon epitelceller til døden stimuli
Gitt den potensielle tumorigent effekten av ICAD mangel på DNA-skade, undersøkte vi denne muligheten i tykktarmen innstilling
in vitro Hotell og
in vivo
. Til å begynne å teste vår hypotese, undersøkte vi effekten av
ICAD
gen knockout på responsen av primær kolon epitelceller (CECs) til induserer celledød, for eksempel, TNF-α, cykloheksimid, og smørsyre ( TNF + CHX + BA) eller til kolon kreftfremkallende DMH. Vi har tidligere vist at TNF + CHX + BA kombinasjonen er effektiv i å fremme celledreping i CECs [26]. I tillegg er flere rapporter av oss og andre viste at cykloheksamid eller butyrat sensitizes en rekke humane tykktarm epiteliale cellelinjer til TNF-α-indusert celledød [26], [27], [28], [29], [30]. Vi har nylig etablert en metode for å isolere primær kolon epitelceller [26]. Figur 2B viser de typiske karakteristikkene av epitelceller som stammer fra en isolert kolon krypten; epiteliale arten av de isolerte cellene ble bekreftet ved immunofluorescens med antistoffer mot cytokeratin. Behandling av CECs med TNF + CHX + BA induserte dødsfall som var moderat, men signifikant redusert med ICAD mangel (Fig. 2C). Interessant, ICAD mangel tildeles en bedre motstand mot celledreping i respons til DMH. Vi neste undersøkt om ICAD mangel også konferert motstand mot DMH
in vivo
ved en akutt eksponering. Mus ble behandlet med en enkelt dose (20 mg /kg) av DMH i 24 eller 48 timer. Figur 2D viser at ICAD mangel betydelig redusert antall pycnotic /apoptotiske celler i tarmslimhinnen vurdert 48 timer etter eksponering DMH. Gitt vår tidligere rapportert forbindelse mellom ICAD uttrykk og PARP aktivering [13], [16], vi undersøkt om motstanden ICAD
– /- CECs til DMH-indusert død var assosiert med en reduksjon i PARP aktivering. Figur 2E viser at DMH behandling induserte en sterk aktivering av PARP som gjenspeiles av poly (ADP-ribose) immunreaktivitet i kjerner av CECs i kolon mukosa hos behandlede mus. Dette PARP aktivering var i stor grad fraværende i colonic epitelceller i slimhinnene i DMH-behandlede ICAD
– /- mus. En kvantifisering av disse resultatene er vist i figur 2F. Disse resultater antyder at DMH-indusert celledød er assosiert med PARP-aktivering, og at ICAD ekspresjon er nødvendig for effektiv induksjon av slik celledød. Enda viktigere, disse resultatene tyder på at motstanden mot døden gitt av ICAD mangel kan delta i hele prosessen med tumordannelse i tykktarmen.
Forbedring av mottakelighet for DMH-indusert colon tumorigenesis av ICAD mangel potensielt post-ACF formasjon
for ytterligere å teste vår nevnte hypotese, vi undersøkt effekten av ICAD genet sletting i en modell av kolon tumorigenesis. WT og ICAD
– /- mus ble injisert intraperitonealt en gang i uken i 8 uker med 20 mg /kg DMH eller kjøretøy (1 mM EDTA i saltvann). Musene ble deretter avlivet 12 eller 24 uker etter den siste injeksjonen. Figur 1A viser at 25% av DMH-behandlede WT mus utviklet svulster viser en moderat til markert motstand mot DMH-indusert tumorgenese, et trekk som er konsistent med den rapporterte motstand av C57BL /6 og 129 /Sv stammer til tykktarm tumorigenesis indusert av DMH eller dets biprodukt azoxymethane [31]. Men 58,3% av DMH utsatte ICAD
– /- mus utviklet svulster, bekrefter karsinogent potensial observert
in vitro
. Mens den gjennomsnittlige tumor per mus i WT mus var ~0.5, gjennomsnittet av svulster i ICAD
– /- mus var ~3.5 om syv ganger høyere, noe som tyder på at ICAD mangelen ikke bare økt mottakelighet for mus å DMH men også økt tumor mangfold. Tumorene detektert i DMH-behandlede ICAD
– /- mus varierte i størrelse, men nådde størrelser så stort som 1 cm som vist i figur 3A-B. Hematoxylin og eosin-farging viste typiske colontumorer med markert hyperplasi og dysplasi og utvikling av store ACF (Fig. 3C). Disse svulstene viste høy PCNA positivitet indikerer høy forekomst av spredning (Fig. 3D). Interessant, disse svulstene utstilt store nekrotiske områder og vist betydelig betennelse som gjenspeiles av det høye antallet av betennelsesceller i nærområdet av svulster (Fig. 3E), som korrelert med høy MCP-en immunoreaktivitets, en stor chemokine i inflammatorisk celle rekruttering, som samt uttrykk for COX-2 (fig 3F.)
WT og ICAD
-. /- mus fikk DMH injeksjoner en gang i uken i 8 uker. Mus ble avlivet 24 uker senere. (A) Diameter av tumorer ble vurdert i de forskjellige forsøksgrupper; n = 12. *, forskjellen fra DMH-behandlede WT mus, p 0,01. (B) En grov undersøkelse av en stor tumor påvises i DMH-behandlede ICAD
– /- mus. (C) H E-beiset colonic vev med en stor svulst fra en DMH behandlet ICAD
– /- mus; oppmerksom på de store nekrotiske kjerner (svarte piler) og vaskularisering (gule piler). (D) PCNA uttrykk i colontumorer fra DMH-behandlede ICAD
– /- mus som vurderes av IHC. (E) H E-fargede snitt med tumor fra en DMH-behandlede ICAD
– /- mus med inflammatoriske celler (piler) i nærheten av tumoren. (F) MCP-1 og COX2 uttrykk i colontumorer fra DMH-behandlede ICAD
– /- mus som vurdert av IHC; høyre panel er en IgG kontroll.
Genetiske endringer som gjør CECs resistente mot apoptose eller mer proliferativ er kritiske hendelsene som starter i tykktarm tumorigenesis [1]. Den påfølgende opphopning av disse modifiserte epitelceller bidrar til ACF formasjon. Disse forstadier til kreft kan eller ikke kan utvikle seg til svulster, men er generelt ansett for å være en forutsetning for tumorprogresjon [5]. Vi undersøkte derfor effekten av ICAD mangel på ACF på et tidligere tidspunkt (12 uker etter siste DMH injeksjon) og før utbygging av store adenomer. Overraskende, selv om antallet ACF i kolon av DMH-behandlede ICAD
– /- mus tendert høyere enn påvist i WT motstykke, forskjellen var ikke statistisk signifikant (figur 4).. Disse resultatene tyder på at ICAD mangel spilte en større rolle i tumorprogresjon i stedet for i initiering
WT og ICAD
-. /- Mus fikk DMH injeksjoner en gang i uken i 8 uker. Mus ble avlivet 12 uker senere. ACF ble identifisert og tellet i H n = 12. * Forskjell fra DMH-behandlede WT mus, p 0,05. Høyre panel representerer et eksempel på en stor ACF i tykktarmen av en DMH behandlet ICAD
– /-. Mus
Fremme av genomisk ustabilitet ved ICAD mangel på DMH eksponering hos mus og effekter på tykktarm kreft-relaterte gener
CAD-mangel ble nylig forbundet med genomisk ustabilitet i huden karsinogenese og i bestrålte cellelinjer [20], [21]. Inhibering av DNA-fragmentering av en caspase-3-resistent mutant av ICAD ført til økt kromosomforstyrrelser i et p53-uavhengig måte [32]. Vi neste ønsket å undersøke om økningen i tumor følsomhet i DMH-behandlede ICAD
– /- mus var assosiert med en endring i genomisk integritet i kolon av DMH-behandlede ICAD
– /- mus. For å oppnå dette, utførte vi matrisen sammen genomisk hybridisering (aCGH) analyser av tumorholdige kolon vev av ICAD
– /- mus og sammenlignet med WT motstykker. Figur 5 viser at behandling med DMH forårsaket en mild genomiske ustabilitet i WT mus, som besto hovedsakelig av delesjoner mest fremtredende i kromosomene 2, 9, 11, 13, og 15. I skarp kontrast til modifikasjonene i kolon vev av DMH-behandlede ICAD
– /- mus var omfattende og besto hovedsakelig av presiseringer. Figur 5B viser kvantitative vurderinger av endringene eksemplifiserende bidrag ICAD til genomisk ustabilitet. Det er bemerkelsesverdig at mens ICAD mangel var assosiert med 170 forsterkning og 120 sletting foci ble ICAD ferdigheter forbundet med blokade av de fleste amplifikasjoner (20 foci) med en moderat effekt på delesjoner (68 foci). Når stringens ble økt, og en cutoff av et 3-gangers forandring var påført, det numrene for de endrede områder markert redusert, men utviklingen forble den samme (fig. 5D), noe som ytterligere bekrefter involvering av ICAD i genomisk integritet.
kromosomalt DNA isolert fra de ulike forsøksgruppene ble vurdert for generell kromosomavvik ved hjelp av en oligo microarray-baserte CGH med en chip som inneholder 105 000 muse genomiske sonder.
