Abstract
Cyclin D1 regulerer G1 progresjon. Dets transkripsjonsregulering er godt forstått. Imidlertid er mekanismen liggende cyklin D1 ubiquitinering og påfølgende nedbrytning ikke ennå klart. Vi rapporterer at cyklin D1 undergår økt nedbrytning i cytoplasma i S-fasen i en rekke kreftceller. Dette er mediert ved fosforylering ved Thr286 gjennom aktiviteten av Ras /Raf /MEK /ERK-kaskade, og F-boks-protein FBXW8, som er en E3 ligase. Flertallet av FBXW8 er uttrykt i cytoplasma i løpet av G1 og S-fasen. I motsetning til dette, cyklin D1 akkumuleres i kjernen i løpet av G1 fase og kommer ut i cytoplasmaet i S-fasen. Økt cyklin D1 nedbrytningen er knyttet til tilknytning FBXW8 i cytoplasmaet, og forbedret fosforylering av cyclin D1 gjennom vedvarende ERK1 /2-signalering. Uttømming av FBXW8 forårsaket en signifikant akkumulering av cyclin D1, samt lagring av CDK1 i cytoplasma. Dette resulterte i en kraftig reduksjon av celleproliferasjon. Disse effektene kan bli reddet av konstituerende atom uttrykk for cyclin D1-T286A. Dermed spiller FBXW8 en viktig rolle i kreftcelle spredning gjennom proteolyse av cyclin D1. Det kan gi nye muligheter for å utvikle behandlingsformer rettet mot ødeleggelse av cyclin D1 eller dens regulator E3 ligase selektivt
Citation. Okabe H, Lee SH, Phuchareon J, Albertson DG, McCormick F, Tetsu O (2006) En kritisk rolle for FBXW8 og MAPK i cyclin D1 Degradering og kreftcelle spredning. PLoS ONE 1 (1): E128. doi: 10,1371 /journal.pone.0000128
Academic Redaktør: Dong-Yan Jin, Avdeling for biokjemi, Kina
mottatt: 07.11.2006; Godkjent: 23 november 2006; Publisert: 27.12.2006
Copyright: © 2006 Okabe et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra American Cancer Society, den Concern Foundation, de Daiichi Pharmaceuticals, UCSF forsknings Evaluering Tildeling komiteen og V Foundation til OT, National Institutes of Health (R01 CA101359) til DGA, og Wood Foundation FM
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cyclin D1 regulerer G1 progresjon i kreftceller, og er overuttrykt i forskjellige ondartede svulster [1 ]. Som et resultat av dette er det et potensielt mål for legemiddel [2]. Transkripsjonell regulering av cyclin D1 er blitt grundig undersøkt, og er godt forstått [3] – [5]. Det er stimulert når for eksempel ulike mitogene signaler aktivere Ras /Raf /MEK /ERK (MAPK) kaskade. Etter syntese følgende MAPK-kaskaden aktivering, cyklin D1 forbinder med CDK4 /6, p21 eller p27 Cip1 Kip1 [6], [7].
I motsetning til mekanismen av cyclin D1 ubiquitinering og påfølgende nedbrytning ikke er helt karakterisert. Det er kjent at cyklin D1 er polyubiquitinated og deretter nedbrutt gjennom 26S proteasomet pathway. Denne prosessen krever fosforylering cyklin D1 ved treonin (Thr) -286, som ligger i nærheten av dets C-terminus [8]. Den cyclin D1 mutant T286A er motstandsdyktig mot ubiquitinering
in vitro Hotell og
in vivo Hotell og er en svært stabil protein. Glykogensyntasekinase-3β (GSK3P) kan fosforylere cyklin D1 ved Thr286, fremme kjernefysisk-til-cytoplasmatisk omfordeling av cyclin D1 [9], [10]. Imidlertid er rollen av GSK3P i cyclin D1-fosforylering og dens stabilitet har blitt stilt spørsmål nylig [11], [12], og p38 SAM2a har vært implisert i nedbrytningen av proteasomal cyklin D1 følgende osmotisk sjokk [13].
Vi forsøkte å identifisere kinase ansvarlig for fosforylering cyclin D1 på Thr286. Vårt arbeid viser at cyklin D1 destabiliseres spesielt i S-fasen i kreftceller og at økt nedbrytning medieres ved fosforylering ved Thr286 gjennom aktiviteten av Ras /Raf /MEK /MAPK-signalkaskade.
ubiquitin-proteinet ligase nødvendig for nedverdigende cyclin D1 har ennå ikke blitt identifisert. En F-boks protein, SKP2, har blitt foreslått [14], [15]. Imidlertid kan SKP2-medierte regulering av cyclin D1 være kontekst eller cellelinje avhengig, og kan være indirekte [7]. Videre gjør cyclin D1 ikke akkumuleres i SKP2 knockout mus embryonale fibroblast (MEF) celler [16], [17].
Dannelsen av polyubiquitin-proteinkonjugater er godt forstått [18]. Tre komponenter deltar i sekvensielle ubikvitin-overføringsreaksjoner. E1, en aktiverende enzym, E2 /Ubc, en ubiquitin-konjugerende enzym, og E3, et protein ligase, som er festet ubiquitin til en lysinrest på et målprotein
de best karakteriserte av disse enzymene er SCF E3-ubiquitin-ligaser, som regulerer substrat ubiquitinering i en fosforylering avhengig måte [19] – [21]. Disse ligaser danne en svært mangfoldig familie av komplekser oppkalt etter deres komponenter, S-fase kinase-assosiert protein 1 (SKP1), Cullin 1 (CUL1 /Cdc53), F-boks proteiner, og RBX1 /ROC1. SKP1 er en avgjørende adapter subenhet og selektivt samvirker med et stillas protein, enten CUL1 eller Cullin 7 (CUL7), for å fremme ubiquitinering av målrettede substrater [22], [23]. Association of CUL7 med SKP1 avhenger FBXW8 og danner en spesifikk SCF-lignende kompleks [22], [23]. Vår studie viser at F-box protein FBXW8 spesifikt gjenkjenner cyclin D1 i en fosforylering avhengig måte og regulerer sin stabilitet gjennom ubiquitin-proteasome veien.
Resultater
Cyclin D1 protein er destabilisert spesielt i S-fasen i kreftceller
for å undersøke mekanismen og viktigheten av cyclin D1 proteolyse, vi først vurderes uttrykket profilen til cyclin D1 under cellesyklusprogresjon fra quiescence i tre normale cellelinjer (NIH 3T3 WI -38 fibroblaster, og CCD841 CoN tykktarm epitel celler) og i tre kreftcellelinjer (HCT 116 og SW480 tykktarm kreft og T98G glioblastom). Normale celler (Fig. 1A og fig. S1 [A]), og kreftceller (Fig. 1B og fig. S1 [B]) ble frigjort fra quiescence ved G0 /G1 fase og cellecyklus-profiler ble bestemt ved flow-cytometrisk cellesyklus analyser. I begge celletyper, øket cyklin D1 ekspresjon gradvis etter re-inntreden i cellesyklusen og nådde et maksimum ved den G1-S-overgangen. I alle tre normale cellelinjer, cyklin D1-nivåer forble konstant i løpet av S-fase (Fig. 1A og fig. S1 [A]), selv om vi har observert en svak reduksjon i cyklin D1 uttrykk etter inntreden i S-fasen. Dette funnet er i samsvar med tidligere observasjoner [24], [25]. I kontrast til alle de tre cancercellelinjer viste en dramatisk reduksjon av cyclin D1 ekspresjon i S-fasen (fig. 1B og fig. S1 [B]). Disse observasjonene tyder på at cyclin D1 omsetningen økte i S-fasen i disse cellene.
Cyclin D1 er destabilisert i S-fasen gjennom ubiquitin-proteasome sti i kreftceller. (A, B) Ekspresjon profilen til cyclin D1 under cellesyklusprogresjon i cellene frigjøres fra quiescence. Normale celler (A) og kreftceller (B) ble testet. (A) NIH 3T3 mus-fibroblaster og CCD841 CoN normal tykktarm epitel. (B) HCT 116 og SW480 celler. CCD841 Con celler ble synkronisert på G0 /G1 fasen av behandling med ACL-4 media uten EGF i 24 timer, og deretter stimulert med komplett ACL-4 media inneholder EGF. Andre celler ble løslatt fra quiescence av serum stimulering. Prøver ble samlet ved angitte tidspunkter. Cellecyklus fordelinger ble bestemt ved flow-cytometri og prosentandeler av hver fase er indikert. Western-blot ble utført med cyklin D1 og p-aktin-antistoffer, henholdsvis. (C, D) Puls-chase analyse av cyclin D1 i NIH 3T3-celler (C) og HCT 116 celler (D). Celler ble løslatt fra quiescence og merket med
35S-metionin for en time når de fleste av befolkningen var i G1 fasen (9 timer for NIH3T3 og 6 timer for HCT 116) eller i S-fasen (21 timer for NIH3T3 og 15 timer for HCT 116). Cellene ble renset med kald metionin i de angitte tidsrom og deretter lysert. Cyclin D1 ble immunopresipitert og analysert med SDS-PAGE. Autoradiografi ble utført. Nivåer av metabolsk merket-cyclin D1 ble estimert ved kvantitativ skanning ved hjelp Antall Én programvare (Bio-Rad) og blottet på grafen for å bestemme halveringstiden for cyclin D1. Cellesyklusfordeling er angitt nedenfor figurene. (E) Omsetning av cyclin D1 er mediert av ubiquitin-proteasome veien. NIH3T3 og HCT 116 celler ble frigjort fra quiescence av serumstimulering og behandlet i nærvær (+) eller fravær (-) av MG132 i 2 timer før høsting på hvert tidspunkt. Western blot ble utført med cyklin D1 og p-aktin-antistoffer. (F-H) Polyubiquitination av cyclin D1. (F) HCT 116 tykktarmskreftceller ble transfektert med HA-merket cDNA-ubikvitin (sporene 1-3) eller uten (kolonne 4) og deretter synkronisert til S-fasen gjennom sekvensiell manipulering av serum sult og stimulering. Celler ble behandlet med 25 uM MG132 (banene 3 og 4) eller uten det (kolonnene 1 og 2) i en time. Lysatene ble immunoutfelt med antistoff mot syklin D1 antistoffer (søyle 2-4) eller kontroll-IgG (kolonne 1) og immunoblottet med et HA-antistoff (øvre panel) eller et Cyclin D1-antistoff (nedre panel). Stjernene viser bakgrunns uspesifikke bånd (F-G). (G) Kjerne (N) og cytoplasmiske (C) proteiner ble fraksjonert (Fr.) fra cellelysatene er samlet i panel C, spor 3. Kjerne og cytoplasmiske ekstrakter ble immunoutfelt med antistoff mot syklin D1 (kolonnene 1 og 2) eller IgG ( felt 3) og immunoblottet med et HA-antistoff (øvre panel) eller et Cyclin D1-antistoff (nedre panel). (H) cellesyklusen distribusjoner.
For å bekrefte denne observasjonen, NIH 3T3 mus fibroblast og HCT 116 tykktarm kreft celler ble synkronisert på G0 /G1 fase og løslatt fra quiescence og utsatt for puls-chase analyse . Fig. 1C og D viser puls-chase analyser på
35S metabolsk merket cyclin D1 på 9 timer (NIH 3T3) eller 6 timer (HCT 116), da de fleste av cellene var i G1 fasen, og på 21 timer (NIH 3T3) og 15 timer (HCT 116) når de fleste var i S-fasen (fig. 1C og D, bunn tabeller). Merkede cyklin D1 nivåer ble bestemt ved hjelp av kvantitativ skanning (fig. 1C og D). Det var ingen signifikant forskjell i halveringstid for cyclin D1 under G1 og S faser i NIH 3T3-celler. I motsetning til dette, var det en signifikant forskjell i HCT 116-celler (S-fasen T
1/2 = 11,8 min, sammenlignet med T
1/2 = 27,5 min i G1 fase). Dermed er cyclin D1 destabilisert spesielt i S-fasen i HCT 116 celler.
Cyclin D1 er degradert i cytoplasma i S-fasen gjennom ubiquitin-proteasome sti i kreftceller
Vi neste fastslått om cyclin D1 destabilisering i S-fasen skyldes økt proteolyse gjennom ubiquitin-proteasome veien. Vi behandlet HCT 116 og NIH 3T3-celler med MG132, en proteasominhibitor, for 2 timer før høsting på hvert tidspunkt i løpet av cellesyklusprogresjon (fig. 1E). I behandlede celler HCT 116, cyklin D1 akkumulert betydelig i S-fasen, uten signifikant akkumulering i løpet av G1 fase. I motsetning til dette, forskjellen i akkumulerte cyklin D1 mellom G1 og S-fasen i NIH 3T3-celler viste seg å være mye mindre. Disse funnene tyder på at det i disse kreftcellene, er cyclin D1 destabilisert i S-fasen gjennom 26S proteasome veien.
Figurer 1F-H bekrefte at destabilisering av cyclin D1 innebærer polyubiquitination. På fig. 1F, HCT 116 celler ble transfektert med (baner 1-3) eller uten (spor 4) HA-merket ubiquitin cDNA og deretter synkronisert til S-fasen. Celler ble behandlet med MG132 (banene 3 og 4) eller uten det (kolonnene 1 og 2) i en time. Lysater ble immunopresipitert med et cyklin D1 antistoff (sporene 2-4) eller kontroll-IgG (kolonne 1) og immunoblottet med et HA-antistoff. En gruppe av langsommere vandrende bånd ble gjenkjent av HA-antistoff utelukkende i anti-cyklin D1 immunopresipitater i nærvær av ubiquitin (spor 2 og 3) og den reduserte mobilitet båndene ble ytterligere forbedret etter eksponering for MG132 (felt 3), hvilket indikerer at disse bandene inkludert polyubiquitinated cyclin D1. Disse observasjonene bekreftet at cyclin D1 er degradert under S-fasen gjennom ubiquitin-proteasome sti i HCT 116 celler. Fig. 1H viser at mer enn 70% av disse cellene i S-fasen.
For å identifisere hvor cyklin D1 degradering blir øket i løpet av S-fasen, vi ekstrahert nukleær (N) og cytoplasmiske (C) protein fra cellelysatene er samlet i fig. 1F spor 3 (fig. 1G). Histone H1 ble utelukkende oppdaget i atomfraksjonen, mens MEK1 ble helt uttrykt i cytoplasma ekstrakt, noe som tyder på at vi lykkes fraksjonerte cellelysatene (Fig. S1 [C]). Flertallet av cyclin D1 ble lokalisert i cytoplasma (fig. S1 [C]). Kjerne- og cytoplasmiske ekstrakter ble immunoutfelt med antistoff mot Cyclin D1 (figur 1G, felt 1 og 2) eller IgG (felt 3) og immunoblottet med et HA-antistoff. Polyubiquitinated cyklin D1 bånd ble hovedsakelig påvist i cytoplasmiske ekstrakter. Videre hemming av kjernefysisk til cytoplasma lokalisering av cyclin D1 med Leptomycin B (LMB) ikke forbedre disse bandene betydelig i kjernen (fig. S1 [D]). Vi konkluderer med at cyclin D1 er degradert i cytoplasma spesielt i S-fasen av en proteasome avhengig mekanisme i HCT 116 celler.
MAPK samhandler med cyclin D1 gjennom en D-domene og fosforylerer Thr286
MAPK-aktivitet er forhøyet i alle tre kreftcellelinjer som ble undersøkt (data ikke vist; [ref.4]). Vi undersøkte muligheten for at de Ras /Raf /MEK /ERK-MAPK signalkaskade kan regulere fosforyleringen av cyclin D1 rest Thr286, som etterfølges av prolin (figur 2A;. [Ref 8.], [9])
.
MAPK fosforylerer cyclin D1 ved Thr286, som utløser påfølgende ubiquitinering. (A) Identifikasjon av D-domenet i cyclin D1 (Cyc D1). Illustrasjonen av full-lengde human Cyc D1 viser det område av D-domenet (A.A. 179-193) og MAPK fosforylering området Thr (T) 286, etterfulgt av prolin (P) (heltrukket strek og en pil, henholdsvis). Aminosyresekvensen av D-domenet innen Cyc D1 er på linje med andre kjente MAPK-tilkoblingssider av forskjellige ERK-substrater. Den dublett av grunnleggende (+) og ikke-polare (φ) aminosyrene er konservert rester i kjerne D-domenemotiv L /I /V-X-L /I /V. Aminosyre-posisjonene til de fleste 5 «rester av D-domener er angitt med tallene i den venstre for hver aminosyresekvens respektivt. (B, C) p42 ERK2
in vitro
kinase analyser for cyclin D1 (øverste panelene). (B) villtype eller mutant rekombinant GST-T286A full lengde Cyc D1 protein ble blandet med
32P-ATP i kinaseanalyse reaksjonsbuffer i nærvær eller fravær av renset ERK2. Reaksjoner ble utført ved 30 ° C i 30 minutter og stoppet ved tilsetning av prøvebuffer lasting. Prøvene ble separert med SDS-PAGE og
32P-opptaket ble påvist ved autoradiografi. Immunoblotting (IB) analyse ved anvendelse av antistoffer for å Cyclin D1 er gitt som en referanse for å vise substratmengder. (C) GST alene (spor 1), GST-C-terminal WT Cyc D1-fusjonsprotein beholder bindingssetet av MAPK (aminosyrer 165-295, spor 2), T286A (felt 3) og en fullstendig delesjon av D- domene AD, spor 4) ble anvendt. IB analyse ved anvendelse av antistoff mot GST gitt som en referanse for å vise substratmengder. (D) Immunpresipitasjon (IP) og IB analyse etter ektopisk uttrykk for Flag-merket ERK2 sammen med enten HA-taggede WT eller AD Cyc D1 i HCT 116 tykktarmskreftceller. Et Western blot for inngangskontroller (10% totalt lysater) er også vist. (E) Western blot-analyse med Thr286 fosforylert Cyclin D1 (pCycD1 Thr286) og total Cyc D1 etter transfeksjon av forskjellige former av HA-merkede Cyc D1 ekspresjonsvektorer i HCT 116 tykktarmskreftceller. (F, G)
In vitro-
ubiquitinering analyser ved anvendelse av HeLa celle-ekstrakter fraksjon II som en kilde av enzymer som er nødvendige for å konjugere ubiquitin til substrater og ATP. (F) GST-full lengde Cyc D1 WT, T286A, eller DD ble anvendt for en reaksjon enten med rekombinant ERK2 (sporene 3-5) eller uten (søyle 1-2). Prøver ble separert ved hjelp av SDS-PAGE og immunoblottet med en cyklin D1 antistoff. ATP ble lagt til alle baner, og ingen ubiquitin ble lagt til lane 1. (G) GST-full lengde Cyc D1 WT ble brukt med eller uten ubiquitin. Etter SDS-PAGE separasjon, ble immunobloting utført med antistoffer til syklin D1 (spor 1, 2) eller ubiquitin (banene 3 og 4). (H, I) Puls-chase analyse av cyclin D1 i HCT 116 celler etter eksponering til U0126. Eksponensielt voksende HCT 116-celler ble behandlet med DMSO eller 10 uM U0126 i 30 minutter. (H) Cellene ble puls-merket med
35S-metionin og ble jaget i de angitte tidsrom. Cyclin D1 ble immunopresipitert og deretter analysert med SDS-PAGE. Autoradiografi ble utført. (I) Nivåer av metabolsk merket-cyclin D1. (J) Western blot analyse med pCycD1 Thr286, total cyclin D1, fosforylering bestemt ERK (perk), og total ERK antistoffer. (K) cellesyklusen utdelinger vist.
ERK /MAPK er en prolin (Pro) -rettet protein kinase [26]. Det krever en kinase docking nettsted (eller D-domene) på underlaget for å øke fosforylering effektivitet (figur 2A. [Ref 27.]). D-domener har blitt funnet i forskjellige ERK-substrater, såsom Elk-1, Sap-1, Sap-2, Ets-1 og c-Myc (figur 2A;. [. Ref 27], [28]). Vi søkte etter en D-domene på cyclin D1 med Motif Scan-programvare (https://scansite.mit.edu). Gjennom en rekke strenge søk, identifiserte vi en svært signifikant (innen 0,041 persentil) D-domene i aminosyrer 179-193 (Fig. 2A), noe som tyder på at Ras /Raf /MEK /ERK MAPK signalkaskade kan være ansvarlig for cyclin D1 fosforylering.
for å teste muligheten for at renset ERK /MAPK kan fosforylere rekombinant cyclin D1, renset ERK2 ble sikkert brukt til å fosforylere en glutation
S
-transferase (GST) -cyclin D1 fusjonsprotein (fig. 2B og C). Renset ERK2 effektivt fosforylert GST-fullengdes vill type (WT) cyklin D1 (fig. 2B, kolonne 2). I motsetning til dette, ERK2 mislyktes i å fosforylere T286A, en cyklin D1 mutant (fig. 2B, spor 4), noe som tyder på at Thr286 er hoved fosforyleringssetet av ERK /MAPK. Identiske resultater ble oppnådd i nærvær av renset CDK4 /6; ERK var i stand til å fosforylere cyclin D1 på Thr286, ikke bare i den monomere form, men også innen cyclin D1-CDK4 /6 komplekser (data ikke vist).
For å finne ut om ERK /MAPK krever D-domene for effektiv cyklin D1 fosforylering ved Thr286, utførte vi
in vitro
kinase-analyser ved anvendelse av en fullstendig sletting av D-domene (AD) fra GST-C-terminal cyclin D1-fusjonsprotein. Denne fusjonsprotein beholder MAPK bindingssetet. Fig. 2C viser at det rensede ERK2 effektivt fosforylert WT cyklin D1 (spor 2), men ikke den T286A og DD-mutanter (banene 3 og 4).
Disse resultatene antyder sterkt at MAPK samvirker med Cyclin D1 gjennom sin D-domene å fosforylere Thr286. For å bekrefte denne muligheten, utførte vi en immunoprecipitation og immunoblotting (IP-IB) analyse etter ektopisk uttrykk for Flag-merket ERK2 med enten HA-taggede WT eller AD cyclin D1 i HCT 116 tykktarmskreftceller (Fig. 2D). ERK2 forbundet godt med WT Cyclin D1 (kolonne 2) og dårlig med AD Cyclin D1 (felt 3). For å fastslå viktigheten av MAPK i fosforyleringen av cyclin D1 ved Thr286 i HCT 116 cellene transfektert vi cellene med forskjellige former for cyklin D1 ekspresjonsvektorer (fig. 2E). Ektopisk uttrykk for cyclin D1 ble skilles fra endogen uttrykk ved redusert mobilitet av HA-merket cyclin D1. Vi analyserte fosforyleringen status av eksogent cyklin D1 uttrykk ved Thr286. Cyclin D1 fosforylering ble betydelig redusert ved delesjon av D-domenet (felt 4). Disse observasjonene antydet at flertallet av Thr286 fosforylering i HCT 116 celler er gjennom MAPK aktivitet.
Ras /MAPK-mediert ubiquitinering og nedbrytning av cyclin D1 er direkte knyttet til sammenslutningen av MAPK /ERK med cyclin D1
Vi neste undersøkt om MAPK-mediert fosforylering av cyclin D1 kan føre ubiquitinering av cyclin D1
in vitro plakater (fig. 2F og G). Vi brukte en ubiquitinering analysesystem som benytter Fraksjon II HeLa celleekstrakter som en kilde av enzymer som er nødvendige for å konjugere ubiquitin til substrater og ATP [29]. Polyubiquitination av cyclin D1 (figur 2F, felt 1 og 2) ble ytterligere forbedret ved ERK2 (fig. 2F, felt 3 og fig. 2G, sporene 2 og 4). Langsommere vandrende bånd ikke ble påvist i fravær av ubiquitin (fig. 2G, sporene 1 og 3), noe som tyder på at de består av polyubiquitinated former av Cyclin D1 (fig. 2G, baner 2 og 4). Vi tror at polyubiquitination kreves for direkte interaksjon av ERK2 med cyclin D1 og fosforylering av cyclin D1 ved Thr286, fordi ubiquitinering ble i stor grad forhindret i D-domene-delesjonsmutant form (AD) og alanin for Thr286 substitusjon (T286A) av Cyclin D1 ( Fig. 2F, baner 4 og 5).
stabiliteten cyclin D1 protein er regulert av ERK /MAPK aktiviteter i HCT 116 kreftceller
Vi har også bestemt bidrag av ERK /MAPK til stabiliteten av cyclin D1 i kreftceller. Vi utførte puls-chase analyse på metabolsk merket-cyclin D1 etter hemme MAPK aktiviteter (figur 2 H-K,. [Refs 30.], [31]). Eksponensielt voksende HCT 116-celler ble behandlet med U0126 i 30 minutter, som i betydelig utarmet den fosforylerte form av ERK (ekstra fordel) og cyklin D1 ved Thr286 (pCyc D1 Thr286) uten å påvirke cellesyklus-profil (fig. 2J og K). Nivåer av metabolsk merket-cyclin D1 ble beregnet ved kvantitativ scanning som beskrevet ovenfor (fig. 2I). Reduksjon av MAPK-aktivitet økte halveringstiden til cyclin D1 fra 22,5 min til 54,6 min. Disse data indikerer at stabiliteten til cyclin D1 er regulert av ERK /MAPK-aktivitet i kreftceller.
Cyclin D1 stabilitet er regulert gjennom SCF eller SCF-lignende bane
På grunn av den strenge spesifisitet E3 ligaser og deres substrater [18], er det sannsynlig å ha sin egen E3 ligase cyclin D1. Vi antok at cyklin D1 proteolyse er mediert av SCF E3 ligaser eller en SCF-liknende kompleks av E3-ligaser, hvor en F-boks-protein bestemmer spesifisiteten for dets substrat. For å teste denne ideen, utførte vi IP-IB-analyse (Fig. 3A). Cyclin D1 fra eksponentielt voksende HCT 116 celler ble immunoutfelt og sekvensielt utslettet med antistoffer mot cyclin D1, CDK4, SKP1, CUL1 og CUL7. Cyclin D1 forbundet med SKP1, CUL1 eller CUL7, og CDK4, noe som tyder på at dens proteolyse formidles av SCF (SKP1-CUL1-F-box protein) eller SCF-lignende (SKP1-CUL7-FBXW8) kompleks av E3 ligaser.
FBXW8 ubiquitinates cyclin D1 i en Thr286 fosforylering avhengig måte. (A) IP-IB-analyse (til venstre). Protein fra eksponentielt voksende HCT 116 celler ble utfelt med antistoffer til Cyclin D1 eller IgG. Immunutfelninger ble utsatt for SDS-PAGE og sekvensielt utslettet med cyclin D1, CDK4, SKP1, CUL1 og CUL7 antistoffer. IB analyse med 5% av de totale cellelysatene ble gitt som en kontroll (til høyre). (B) IB analyse følgende utarming av SKP1 uttrykk i 48 timer etter behandling med SKP1 siRNA dobbel tråd oligonukleotider i HCT 116 celler. Non-targeting siRNA (Control) og mock transfeksjon (-) fungerte som kontroller. (C) IP-IB-analyse. Tjueseks F-boks full lengde koding cDNA ble klonet inn V5 eller Flag epitop tag ekspresjonsvektorer. Disse V5 eller Flag-merket F-box protein DNA plasmider ble transfektert sammen med HA-merket cyclin D1 (HA-Cyc D1) og CDK4 uttrykk vektorer inn T98G celler. Celler ble samlet inn 24 timer senere. Prøvene ble utfelt med et HA epitop tag antistoff. Immunutfellinger ble underkastet SDS-PAGE og deretter farget med V5 eller Flag (F-boks-proteiner), HA (Cyc D1) antistoffer. IB-analyse med 10% av totale cellelysater ble levert (nederst). (D) IP-IB-analyse (øverst). V5-merket F-box protein DNA plasmider ble transient transfektert sammen med enten HA-merket cyclin D1 (Cyc D1) villtype (WT) eller T286A mutant, og CDK4 ekspresjonsvektorer i T98G celler henholdsvis. Prøvene ble utfelt med et HA epitop-tag antistoff. Immunutfellinger ble underkastet SDS-PAGE og deretter blottet med V5 (F-boks-proteiner), HA (Cyc D1), og Thr286 fosforylert cyklin D1 (pCyc D1 Thr286) antistoffer. IB analyse med 10% av totale cellelysater ble gitt for sammenligning (nederst). (E)
In vitro
ubiquitinering analysen.
In vitro
oversatt F-boks proteiner med rekombinant GST-helaftens cyclin D1 (Cyc D1) villtype, trekker HeLa celle fraksjon II med ATP, Ubiquitin og ERK2, og
in vitro
-translated enten SKP1, RBX1 og CUL1, eller SKP1, RBX1 og CUL7 proteiner ble inkubert ved 30 ° C i 2 timer. Prøver ble separert ved hjelp av SDS-PAGE og immunoblottet med en cyklin D1 antistoff. (F)
In vitro
polyubiquitination av cyclin D1 gjennom SCF-lignende (SCFL) kompleks FBXW8 (SKP1-CUL7-FBXW8-RBX1 /SCFL
FBXW8). WT eller T286A GST-Cyc D1 ble inkubert i nærvær av renset ERK2 (kolonnene 1 og 3) eller dets fravær (kolonne 2) ved 30 ° C i 2 timer. Prøver ble separert ved hjelp av SDS-PAGE og immunoblottet med en cyklin D1 antistoff. Stjerne indikerer uspesifikke bånd. (G) Tilberedning av polyubiquitination av cyclin D1 gjennom SCFL
FBXW8
in vitro
bruke renset E1 og E2. GST-WT Cyc D1 ble inkubert med rekombinant SCFL
FBXW8 i nærvær eller fravær av E1 og E2 /UbcH5C. Prøvene ble separert ved SDS-PAGE og immunoblottet med en cyclin D1 antistoff.
For å teste om nivåer av cyclin D1 er i hovedsak regulert av SCF eller SCF-lignende bane, vi utført en immunoblot analyse 48 timer etter tappe SKP1 uttrykk med siRNA dobbel tråd oligonukleotider i HCT 116 celler (fig. 3B). siRNA for SKP1 betydelig redusert SKP1 uttrykk og resulterte i opphopning av cyclin D1. Disse observasjonene sterkt støtte ideen om at cyclin D1 stabilitet er regulert gjennom SCF eller SCF-lignende bane.
FBXW8, en F-box protein, knytter spesielt med cyclin D1 i en Thr286 fosforylering avhengig måte
Vi neste identifiserte proteinet ansvarlig for cyclin D1 stabilitet. Vi testet kandidatens menneske F-box protein gener for å identifisere den unike E3 ubiquitin ligase for cyclin D1. Substratspesifisitet av SCF komplekser skjer via protein-protein interaksjons domener som ofte tryptofan-asparaginsyre (WD) 40 motiver eller leucine-rich gjentar (LRR) innenfor F-boks proteiner [20], [21]. Vi søkte NCBI databaser for menneske F-boks proteiner med WD40 eller LRR motiver. Vi fant ca 70 potensielle gener. Blant disse ni hadde WD40 gjenta motiver og 17 hadde LRR motiver.
Vi har fått disse genene ved først å utføre revers transkriptase-PCR (RT-PCR) ved hjelp av total RNA fra HEK 293, HCT 116 eller WI-38 celler . Den full-lengde cDNA vi hentet ble klonet inn V5 eller Flag epitop tag ekspresjonsvektorer. For å løse om noen av produktene av disse genene kan gjenkjenne cyklin D1, vi transient transfektert DNA-plasmider for V5 eller Flag-merket F-box proteiner inn T98G celler med eller uten N-terminale HA-merket cyklin D1 og CDK4 ekspresjonsvektorer ( fig. 3C). Etter 24 timer ble cellene oppsamlet og utført IP-IB-analyse. Prøvene ble felt med et HA epitop tag antistoff og farget med Flag (FBXW7 og FBXL5) eller V5 (andre), og cyclin D1 antistoffer. Panel C viser cyclin D1 assosiere med to F-boks proteiner, FBXW8 (spor 7) og FBXL12 (spor 15). FBXW8 besatt WD40 motiver og FBXL12 hadde LRR motiver.
Fordi F-box protein underlag må være fosforylert [19], vi testet om FBXW8 og FBXL12 gjenkjenne cyclin D1 i en Thr286 fosforylering avhengig måte. Vi transient transfektert T98G celler med V5-merket F-box protein DNA plasmider og cyclin D1 (villtype eller T286A mutant) og CDK4 ekspresjonsvektorer. Prøvene ble utfelt med et HA epitop tag antistoff og utslettet med V5, HA og Thr286 fosforylert cyclin D1 antistoffer (Fig. 3D). FBXW8 var assosiert med både cyclin D1 villtype og T286A mutant, men de fleste var bundet til villtype, som var hovedsakelig fosforylert ved Thr286. I kontrast, fikk vi ikke se en betydelig forskjell mellom villtype cyclin D1 og mutant i forbindelse med FBXL12. Disse resultatene tyder på at FBXW8 gjenkjenner cyklin D1 i en Thr286 fosforylering avhengig måte, men FBXL12 ikke. I samsvar med dette funnet, ble FBXL12 ikke involvert i cyclin D1 polyubiquitination
in vitro plakater (Fig. 3E, lane 9). Vi konkluderte med at FBXW8 kan spille en rolle i cyclin D1 stabilitet.
FBXW8 ubiquitinates cyclin D1 i en Thr-286 fosforylering avhengig måte
Vi har undersøkt om
in vitro
ubiquitinering av cyklin D1 krever FBXW8 (fig. 3E). Vi ruges hvert
in vitro
-translated F-box protein med rekombinante GST-cyclin D1 (Cyc D1), fraksjon II HeLa celleekstrakter med ATP, ubiquitin og ERK2, og enten
in vitro
-translated SKP1, RBX1 og CUL1, eller SKP1, RBX1 og CUL7 proteiner. Deretter blottet vi dem med en cyclin D1 antistoff. Cyclin D1 ubiquitinering ble påvist i de kombinasjoner av FBXW8 med SKP1, CUL1, og RBX1 (spor 5), eller FBXW8 med SKP1, CUL7, og RBX1 (spor 6). Men polyubiquitinated band ble ikke økt i andre kombinasjoner. For å bekrefte at SCF komplekser ble montert riktig på
in vitro
oversettelse, vi utførte immmunoprecipitation med hver F-box protein i
35S-merket
in vitro
oversatte prøver (ikke vist ) og testet om kompleksene inneholdende β-TRCP var funksjonelle for polyubiquitination av β-catenin (fig. S1 [E]). Våre resultater tyder på at cyclin D1 ubiquitinering innebærer FBXW8.
Vi neste undersøkt om
in vitro
ubiquitinering av cyclin D1 gjennom SCF-lignende (SCFL) kompleks FBXW8 (SKP1-CUL7-FBXW8-RBX1 /SCFL
FBXW8) krever fosforylering av cyclin D1 ved Thr286 (fig. 3F). Polyubiquitination gjennom SCFL
FBXW8 ble dramatisk redusert ved uttømming av ERK2 (kolonne 2). Videre cyclin D1 polyubiquitination ble i stor grad forhindret av alanin-for-Thr286 substitusjon (T286A, spor 3), noe som tyder på at fosforylering av cyclin D1 ved Thr286 er nødvendig for ubiquitinering av SCFL
FBXW8. Disse dataene er i god overensstemmelse med vår observasjon at FBXW8 knytter spesielt med cyclin D1 i en Thr286 fosforylering avhengig måte.
Til slutt, vi rekonstruert cyclin D1 polyubiquitination
in vitro
bruker renset E1 og E2 enzymer (fig. 3G). SCFL
FBXW8 fremmer UbcH5C-katalysert polyubiquitin kjeden forsamlingen [22].
