Abstract
Fokuset i denne studien er de anti-kreft effekt av
Cudrania tricuspidata
stilk (CTS) trekke på livmorhalskreftceller. Effekten av CTS på cellelevedyktighet ble undersøkt i HPV-positive cervical kreft celler og HaCaT humane normale keratinocytter. CTS viste signifikant doseavhengig cytotoksiske effekter i livmorhalskreftceller. Imidlertid var det ingen cytotoksisk effekt av CTS på HaCaT keratinocytter ved konsentrasjoner på 0,125 til 0,5 mg /ml. Basert på denne cytotoksisk effekt, demonstrerte vi at CTS indusert apoptose ved å nedregulere de E6 og E7 virale onkogener. Apoptose ble oppdaget av DAPI farging, annexin V-FITC /PI farging, cellesyklus analyse, western blotting, RT-PCR, og JC-1 farging i Siha livmorhalskreftceller. De mRNA uttrykk nivåer av ytre vei molekyler som Fas, død reseptor 5 (DR5), og TNF-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) ble økt med CTS. Videre CTS behandling aktivert kaspase-3 /caspase-8 og spaltning av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). Men mitokondrie membran potensial og uttrykk nivåer av indre vei molekyler som BCL-2, BCL-XL, Bax, og cytokrom C ble ikke modulert av CTS. Tatt sammen indikerer disse resultater at CTS indusert apoptose ved å aktivere den ytre vei, men ikke det indre vei, i Siha cervikale kreftceller. Disse resultatene tyder på at CTS kan anvendes som en modulerende middel i livmorhalskreft
relasjon:. Kwon S-B, Kim M-J Yang JM, Lee H-P, Hong JT, Jeong H-S, et al. (2016)
Cudrania tricuspidata
Stem Extract induserer apoptose via den ytre vei i Siha livmorhalskreftceller. PLoS ONE 11 (3): e0150235. doi: 10,1371 /journal.pone.0150235
Redaktør: Yi-Hsien Hsieh, Institutt for biokjemi og bioteknologi, TAIWAN
mottatt: 24 november 2015; Godkjent: 10 februar 2016; Publisert: 09.03.2016
Copyright: © 2016 Kwon et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av den grunnleggende program (2015R1A2A2A09001137) av National Research Foundation of Korea (NRF), https://www.nrf.re .kr /nrf_eng_cms. D.Y. Yoon ble støttet delvis av prioriterte forskningssentre Program (2012-0006686). Forfatterne er takknemlige for Pharma Teksol og Chungcheongbukdo Bio CS for deres intellektuelle og finansiell støtte til dette prosjektet. Det var ingen ytterligere eksterne midler mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser: Forfatter. Eun Suk Kim er ansatt av et kommersielt selskap, Chungcheongbukdo Bio CS, og selskapet gir støtte i form av lønn for henne. Imidlertid gjorde selskapet ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Den spesifikke rolle denne forfatteren er formulert i § «forfatter bidrag «
Forkortelser:. HPV, human papilloma virus; CTS,
Cudrania tricuspidata
stammen; DR, død reseptor; TRAIL, TNF-relatert apoptose-induserende ligand; PARP, poly (ADP-ribose) polymerase
Innledning
Livmorhalskreft er en av de vanligste sykdommer som påvirker kvinner over hele verden og er fortsatt en høy årsaken til dødelighet blant kvinner i utviklingsland [1-2 ]. Epidemiologiske og kliniske data tyder på at infeksjon med høyrisiko humant papilloma virus (HPV) typer, for eksempel typene 16 og 18, spiller en viktig rolle i flere faktorer etiologi av livmorhalskreft [3]. Høyrisiko HPV teinene E6 og E7 spiller viktige roller i å opprettholde livmorhalskreft cellevekst. Oncoproteiner E6 og E7 inaktivere tumor p53 og pRb, henholdsvis [4]. Høyrisiko HPV oncoprotein E6 forbinder med og degraderer p53, mens HPV protein E7 konkurrerer med E2F for retinoblastom protein (pRb) bindingsseter [5].
Cudrania tricuspidata
er et løvtre som tilhører til familien
Moraceae Hotell som distribueres hovedsakelig i Korea, Kina og Japan. Hele
C
.
tricuspidata
anlegget har blitt utnyttet som en viktig folk rette for kreft i Korea i løpet av de siste tiårene, mens det har også blitt brukt som en tradisjonell medisin for herding nevritt og betennelse i andre deler av Asia [6]. I tillegg er flere effekter av
C
.
tricuspidata
ekstrakt har blitt rapportert, inkludert antioksidantaktivitet [7] og hemmende effekt på nitrogenoksid syntase [8]. Imidlertid er anti-kreft effekt av ekstrakt av stammen av
C
.
tricuspidata
på livmorhalskreftceller er ikke undersøkt.
Dermed målene med denne studien var å undersøke anti-kreft aktivitet av
Cudrania tricuspidata
stilk (CTS) trekke på HPV-positive livmorhalskreftceller og å undersøke apoptotiske mekanismer for CTS. Her rapporterer vi at CTS behandling fører til apoptose via ytre vei, samt gjennom undertrykkelse av HPV-16 teinene E6 og E7 og endring av protein nivåer av p53 og p-pRb.
Materialer og metoder
Reagenser og antistoffer
CellTiter 96 AQ
ueous One Solution Cell Proliferation Assay Reagent [MTS, 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium] ble kjøpt fra Promega (Madison, WI, USA). Propidiumjodid (PI) og 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) flekken ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). NE-PER Kjerne- og Cytoplasmatiske Utvinning reagenser ble kjøpt fra Pierce (Rockford, IL, USA). Antistoffer spesifikke for PARP, caspase-3, caspase-8, p53, BCL-2, BCL-XL, Bax, Bud, pRb, p-pRb, og cytokrom C ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Den anti-kanin-IgG-pepperrot-peroksidase (HRP) -konjugert sekundært antistoff og anti-mus IgG HRP-konjugert sekundært antistoff ble anskaffet fra Millipore (Billerica, MA, USA). Antistoffer spesifikke for p27, p21, og glyseraldehyd 3-phospahte dehydrogenase (GAPDH) ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). JC-1 (5,5 «, 6,6′-tetraklor-1,1′, 3,3»-tetraetyl benzimidazolycarbocyanine klorid) ble innkjøpt fra Enzo (Farmingdale, NY, USA). Generelt-caspase inhibitor Z-VAD-FMK og caspase-8 inhibitor Z-IETD-FMK ble kjøpt fra R Hyclon Laboratories, Logan, UT, USA) inneholdende 10% (v /v) varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS; Hyclon Laboratories). Cellene ble inkubert ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO
2/95% luft med mettet fuktighet.
Celleviabilitet analyser
Celleviabilitet ble vurdert av MTS fargestoff reduksjon analysen, som måler mitokondrie lungefunksjon. Cervical kreft celler ble sådd ut (12 x 10
4 celler /ml) i 100 ul medium /brønn i 96-brønners plater, inkubert over natten, og ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av CTS, som nevnt i figuren sagn i 24 timer . Cellelevedyktigheten ble beregnet ved å vurdere MTS metabolisme som tidligere rapportert [10]. I korte trekk, ble medieprøver (100 ul) fjernet og inkubert med 100 ul av MTS-PMS-blandingen løsning i 1 time ved 37 ° C. Optisk absorbans ble målt ved 492 nm ved hjelp av en ELISA-leser (Apollo LB 9110, Berthold Technologies GmbH E7, 5′-TGA AGG ACA TGG CTT AGA AGT G-3 «(fremover), 5′-GGT GCA AGG GTC ACA GTG TT-3′ (bakover); TRAIL, 5»-AAG TTT GTC GTC GTC GGG GT-3 «(fremover), 5′-TGG TGC AGG GAC TTC TCT CT-3» (bakover); Fas, 5’TGA AGG ACA TGG CTT AGA AGT- 3 «(fremover), 5′-GGT GCA AGG GTC ACA GTG TT-3′ (bakover); DR5, 5»-CAG AGG GAT GGT CAA GGT CG- 3 «, 5′-TGA TGA TGC CTG ATT CTT TGT GG-3′; og GAPDH, 5»-TGG GCT ACA CTG AGC ACC AG-3 «(fremover), 5′-GGG TGT CGT TGT TGA AGT CA-3» (bakover).
Western blot analyse
Celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av CTS til 24 timer, høstes, vaskes med PBS, og resentrifugert (1890 x
g
, 5 min, 4 ° C). De resulterende cellepellets ble resuspendert i lyseringsbuffer inneholdende 50 mM Tris (pH 7,4), 1,5 M natriumklorid, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,25% natriumdeoksykolat, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), og en protease inhibitor cocktail. Cellelysatene ble inkubert på is i 1 time og avklares ved sentrifugering ved 17 010 ×
g
i 30 min ved 4 ° C. Proteininnhold ble kvantifisert ved hjelp av en Bradford-analyse (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og et UV-spektrofotometer. Cellelysatene ble separert ved 10-12% SDS-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE). Proteiner ble overført til polyvinylidendifluorid-membraner (PVDF, Millipore, Billerica, MA, USA), som ble blokkert i 5% ikke-fettholdig tørrmelk ble oppløst i Tris-bufret saltvann som inneholdt Tween-20 (2,7 M NaCl, 53,65 mM KCl, 1 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1% Tween-20) i 1 time ved romtemperatur. Membranene ble inkubert over natten ved 4 ° C med spesifikke primære antistoffer. Etter vasking ble membranene inkubert med de sekundære antistoffer (HRP-konjugert anti-kanin eller anti-mus IgG) i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking ble blotter analysert ved hjelp av West-Zol Plus og en western blot deteksjonssystem (intron Bioteknologi, Sungnam, Sør-Korea).
Atom og cytoplasmatiske fraksjone
De CTS-behandlede celler innsamlet og fraksjonert ved hjelp av NE-PER Kjerne- og Cytoplasmatiske Utvinning reagenser (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA) i henhold til produsentens protokoll.
Analyse av mitokondriemembranen potensial (MMP)
MMP (Δψ
m) ble evaluert ved JC-1-farging og flowcytometri. Siha celler ble sådd i 60 mm kulturskåler (2,5 x 10
5 celler /brønn) og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av CTS. Cellene ble høstet med trypsin-EDTA og overført til 1,5 ml rør. JC-1 (5 ug /ml) ble tilsatt til cellene og blandet inntil det var fullstendig oppløst, hvoretter cellene ble inkubert i mørke i 10 min ved 37 ° C i en inkubator. Cellene ble sentrifugert (300 x
g
, 5 min, 4 ° C), vasket to ganger med PBS og resuspendert i 200 ul PBS. Løsningene ble delt ved hjelp av en FACSCalibur instrument og analysert av Cellquest programvare (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Hele protokollen ble utført i minimal lys.
Lyddempningsplater av endogene HPV16 E6 og E7 uttrykk ved siRNAs
sirnas av E6 og E7 og egge siRNA ble kjøpt fra Dharmacon (Dharmacon, Lafayette, CO ). E6 siRNA-sekvensen og E7 siRNA-sekvensen ble brukt som beskrevet i tidligere rapportert [11]. Å undertrykke transkripsjon av endogene HPV16 E6 og E7 gener, Siha celler ble midlertidig kotransfektert med de syntetiske sirnas for HPV16 E6 og E7 eller en nontargeting siRNA hjelp Lipofectamine RNAiMAX reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner.
Statistisk analyse
data er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter. Statistisk signifikans ble vurdert med t-test. *
p
0,05 eller **
p
0.005 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Identifikasjon av fenoliske forbindelser i CTS
Vi identifiserte potensielle medisinske komponenter (fig 1, Tabell 1) og et stort antall klorogensyrer (tabell 2) i CTS ekstraktet ved bruk av HPLC. Tabell 2 viser de komponentene i CTS-ekstrakt, som inkluderte klorogensyre, (+) – catechin, caffeic syre, phloretic syre, veratric syre, hesperidin, quercetin, og naringenin. CTS Ekstraktet inneholdt forskjellige fenoliske syrer og var rik på klorogensyre (64,42 mg /g). Klorogensyre har blitt rapportert å ha kreft og antioksidantegenskaper [12-15]. Quercetin, hesperidin, og andre fenoliske syrer slik som koffeinsyre har også blitt rapportert å utvise anti-kreft effekt i flere typer kreft [16-18]. Imidlertid er disse forbindelser var tilstede i lave konsentrasjoner i CTS ekstrakt.
sytten typer av fenoliske-sammensetningen av prøven ble analysert ved å sammenligne den spekteret av prøven og standardkomponenter passet for å lage en standardkurve fra toppareal pr komponent for å kvantifisere mengden av endringen. (A) De sytten typer referanse fenoliske syreforbindelser. (B)
Cudrania tricuspidata
stilk (CTS) ekstrakt. HPLC-analysen viste tilstedeværelse av åtte forbindelser som svarer til åtte blant 17 standardforbindelser. The 5, 7, 11 topper representert klorogensyre, caffeic syre, og veratric syre, henholdsvis.
CTS induserer cytotoksiske virkninger i livmorhalskreftceller og normale keratinocytter
den cytotoksiske effekten av CTS ble vurdert i flere cellelinjer ved hjelp av MTS analysen. Livmorhalskreft cellelinjer og HaCaT normale keratinocytter ble behandlet med ulike konsentrasjoner og tidsperioder (fig 2). Som vist i figur 2B, ble levedyktighet av cervikale kreftceller ble redusert i en dose- og tidsavhengig måte ved CTS ekstrakt. Levedyktigheten av de CaSki HPV16-positive celler ble redusert i en tids- og doseavhengig måte ved CTS ekstrakt, men i mindre grad enn det som ble observert i de Siha HPV16-positive celler. I tillegg CTS ikke hadde noen cytotoksisk effekt i HaCaT humane normale keratinocytter konsentrasjoner på 0,125 til 0,5 mg /ml (figur 2A). Derfor bestemte vi oss for å gjennomføre en studie om mekanismen bak apoptose indusert av CTS ekstrakt i Siha livmorhalskreftceller.
(A) HaCaT, (B) Siha og CaSki celler ble behandlet for 24-48 timer med ulike konsentrasjoner av CTS ekstrakt, hvoretter cellenes levedyktighet ble undersøkt ved bruk av MTS-analysen. Resultater av * p 0,05 og ** p 0,005 ble betraktet som statistisk signifikant. CTS-behandlede celler ble sammenlignet med kontrollcellene.
CTS induserer morfologiske endringer og apoptose i celler Siha
fasekontrastmikroskopi viste at CTS-indusert celledød og morfologiske endringer i Siha-celler på en doseavhengig måte etter en 24 timers behandling (figur 3A). DAPI farging ble anvendt for å observere atom kondensasjon, en markør for apoptose. Nuclear kondensering var signifikant og doseavhengig økning i CTS-behandlede celler sammenlignet med den for kontrollcellene (figur 3B og 3C). Annexin V-FITC /PI farging er vanligvis brukt for å detektere apoptose og nekrose. Apoptose ble ytterligere bekreftet ved annexin V-FITC og PI-farging etter en 24 timers behandling med CTS. De Siha celler behandlet med CTS ved konsentrasjoner på 0,125 til 0,5 mg /ml i 24 timer viste en signifikant økning i andelen av apoptotiske celler i sammenligning med den for kontrollcellene, hvilket indikerer at CTS indusert apoptose. Men det var ingen endringer i CTS behandlet HaCaT celler (figur 3D).
(A) Mikroskopiske bilder av Siha celler behandlet med CTS i 24 timer. Bildene ble tatt av fasekontrastmikroskopi ved 100 × forstørrelse. (B) Fluorescens mikroskopiske bilder av Siha celler behandlet med CTS i 24 timer. ble observert Nuclear kondens og kromatin krymping. (C) Dataene om apoptotiske kjerner av hele DAPI fargede celler ble oppsummert som stolpediagrammer. Resultater av *
p
0,05 og **
p
0,005 ble betraktet som statistisk signifikant. (D) Etter behandling med den angitte konsentrasjon av CTS i 24 timer Siha og HaCaT-celler ble farget med annexin V-FITC /PI.
CTS inhiberer E6 /E7 uttrykk og regulerer ekspresjon av E6 /E7-målsøkende anti-tumor faktorer
E6- og E7-oncoproteiner er kjent for å føre til nedbrytning av p53 og pRb, respektivt. Derfor ville nedregulering av E6 og E7 onkogener forventes å resultere i restaurering av p53 og pRb nivåer [19-20]. HPV-16 E6 og E7 mRNA-ekspresjonsnivåene ble undersøkt ved kvantitativ RT-PCR. E6 mRNA-ekspresjon ble redusert i CTS behandlede Siha celler sammenlignet med den til de ikke-behandlede kontrollceller. I tillegg ble E7 mRNA-ekspresjon også redusert (figur 4A). Ekspresjonsnivået av p-pRb ble nedregulert, men pRb ekspresjon var uforandret i CTS-behandlede Siha celler (figur 4B). CTS doseavhengig øket ekspresjon nivå av p53, som resulterer i modulasjon av nedstrøms faktorer, p21 og p27. Som vist i figur 4B, ble p21 og p27 ekspresjonsnivåene økte på en doseavhengig måte ved CTS behandling som forventet.
(A) mRNA-nivåer av oncoproteiner E6 og E7 som påvist ved QRT-PCR. (B) Western blot analyser av pRb, p-pRb, p53, p21 og p27. Siha celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av CTS i 24 timer.
CTS hemmer cellesyklusprogresjon og modulerer cellesyklusrelaterte faktorer
For å vurdere effekten av CTS på cellesyklus progresjon, vi undersøkte cellesyklus status ved flowcytometri. I de foregående forsøk ble uttrykk nivåer av p53 og nedstrøms-genene p21 og p27 øket etter behandling med CTS (figur 4B). Sammenlignet med de ikke-behandlede kontrollceller, CTS-behandlede celler viste signifikant og doseavhengig akkumulering i sub-G1-fase (figur 5B). Men det var ingen signifikante endringer i populasjoner av celler i G0 /G1, S og G2 /M faser etter behandling med CTS (figur 5A).
(A) cellesyklusen profiler av CTS behandlet Siha celler. (B) Andelen av celler i sub-G1 fase. Resultater av **
p
0,005 ble betraktet som statistisk signifikant. CTS-behandlede celler ble sammenlignet med ubehandlede celler.
Effektene av CTS er uavhengige av indre vei
Mitokondriell dysfunksjon er den viktigste faktoren i den indre apoptose veien. Når mitokondriene membranpotensiale kollapser, er cytokrom C frigjøres i cytosol, hvoretter den danner apoptosome med Apaf-1 og caspase-9 [21]. For å måle mitokondriemembranen potensial kollaps etter CTS behandling, utførte vi JC-1 farging og FACS analyse. Som vist i figur S1A, ble JC-1 topp ikke forskjøvet følgende CTS behandling. I tillegg er de vestlige blot analysene viste at CTS behandling ikke endre uttrykket nivåer av pro-apoptotiske faktor Bax eller de av anti-apoptotiske faktorer Bcl-2 og Bcl-XL. I tillegg ble cytokrom C ikke slippes ut i cytosol (S1B Fig). De konkluderer dermed med at forsterkningen av apoptotiske signal etter CTS behandling er uavhengig av signalering via den indre reaksjonsvei apoptose.
CTS-indusert apoptose medieres via dødsreseptor aliserte
Fordi vi demonstrert at egenverdi apoptose veien var ikke involvert i CTS-indusert apoptose, vi neste fokusert på ytre apoptose veien. Den ytre apoptose pathway mottar signaler gjennom binding av ekstracellulære død ligand proteiner til proapoptotiske dødsreseptorer (DRS) [22]. Den ytre vei overfører signaler fra ekstracellulære ligander gjennom proapoptotiske DRs til apoptotiske caspase maskiner [23]. I tillegg er poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) som er involvert i apoptose, så vel som en rekke andre cellulære prosesser. Vi undersøkte uttrykk nivåer av ytre vei relaterte faktorer TRAIL, DR5, og FAS Siha celler etter CTS behandling (figur 6A). Våre resultater viste at CTS behandling oppregulerer mRNA nivåer av TRAIL, DR5, og Fas. Protein ekspresjonsnivåene av caspase-3, caspase-8, PARP, og bud, ble spaltet på en doseavhengig måte ved CTS (figur 6B). I tillegg har vi identifisert de spesifikke kaspasene som er involvert i den pro-apoptotiske virkningsmekanisme CTS. Siha-celler ble forbehandlet med caspaser-inhibitorer, inkludert en generell caspase-inhibitor og et caspase-8-inhibitor. Som vist i figur 6C, forbehandling med generell kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK før CTS behandling vesentlig blokkert CTS-indusert apoptose. En tilsvarende inhiberende effekt på CTS-indusert apoptose ble produsert av caspase-8-inhibitor Z-IETD-FMK. Disse resultater viser at caspase-3, caspase-8, og PARP aktiveres via DR-mediert signalisering i løpet av CTS-indusert apoptose.
(A) mRNA-nivåene av TRAIL, DR5 og Fas som påvist ved QRT-PCR . (B) Western blot-analyse av ytre vei-relaterte faktorer. Siha-celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av CTS i 24 timer. (C) Western blot-analyse av virkningene av CTS etter forbehandling med generell kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK eller caspase-8-inhibitor Z-IETD-FMK i Siha celler.
Nedregulering av E6 og E7 gener forbedret CTS indusert apoptose
For å undersøke om CTS-indusert apoptose ville bli berørt av E6 /E7 nivåer, ble E6 /E7 siRNA transfekterte og behandlet med CTS. Apoptose aktiverende proteiner så som caspase-3, caspase-8, og PARP ble mer spaltet i henhold til E6 /E7 siRNA transfeksjon og CTS behandling (figur 7). p-pRb uttrykk nivået ble redusert i E6 /E7 siRNA transfekterte Siha celler sammenlignet med kontroll siRNA transfekterte celler. Imidlertid p53-ekspresjon nivå endret seg ikke (fig 7). Disse resultater viser at CTS kan støtte induksjon av apoptose ved nedregulering av E6 /E7 mRNA-uttrykk.
Western blot-analyse av apoptose-relaterte faktorer, etter transfeksjon av kontroll siRNA eller E6 /E7 målretting siRNA.
Diskusjoner
hoved~~POS=TRUNC med studien var å bekrefte anti-kreft effekt og tilhørende mekanismer av CTS i menneskelige livmorhalskreftceller. CTS ekstrakt hemmet livmorhalskreftcelle spredning i HPV-positive Siha og CaSki celler. Den cytotoksiske effekt av CTS i HPV-16-positive celler Siha var litt bedre enn dens effekt på CaSki-celler (figur 2). Denne effekten kan skyldes det faktum at antallet av HPV-genomet kopier på CaSki-celler er høyere enn den for Siha celler [24]. Dette funnet tyder på at det totale antall HPV-kopier i cellene kan ha påvirket deres mottakelighet for apoptosiske effekter CTS [24]. I tillegg demonstrerte vi at CTS ned-regulert ekspresjonsnivåer av onkogener E6 og E7 i HPV-16-positive cellelinjer. Som forventet basert på redusert uttrykk nivået av E6, fikk vi bekreftet at p53 uttrykk ble økt i doseavhengig måte. Interessant, redusert ekspresjon av E7 var ikke assosiert med endret pRb uttrykk; imidlertid, ble p-pRb ble redusert på en doseavhengig måte ved CTS (figur 4B). Dette resultatet minnet tidligere rapporter som viser at hemming av E7 resulterte i redusert fosforylering av pRb uten å endre generelle pRb protein uttrykk [20].
CTS ekstrakt inneholder flere fenoliske forbindelser (fig 1). Klorogensyre er til stede ved den høyeste konsentrasjon blant dem. Klorogensyre har blitt rapportert å ha kreft, antioksidant, og antidiabetiske effekter [14, 25-26]. I tillegg er klorogensyre den andre hoved bioaktive komponent i kaffe etter koffein [25]. Klorogensyre stimulerer glukosetransporten i L6 skjelettmuskulatur via AMPK aktivering, noe som bidrar til den gunstige effekten for diabetes [25]. Videre er klorogensyre en antioksidant som kan redusere utslipp av glukose i blodet etter et måltid [26]. I tillegg kan klorogensyre indusere cellulær DNA-skade og apoptose i lungekreftceller uten å påvirke normale lungefibroblaster [14]. Imidlertid er anti-kreft-effekter av klorogensyre i cervikale kreftceller er ikke blitt grundig undersøkt. Koffein syrer finnes i mange naturlige planter [27], og har vist seg å undertrykke tumorvekst ved å hemme tumorcelle-proliferasjon og øke antioksidantaktivitet [28]. En tidligere studie viste at caffeic syrer hemmet spredning, adhesjon og migrasjon av A549 humane lungekreftceller og HT29-D4 tykktarmskreftceller [29]. I tillegg, hesperidin, naringenin og quercetin har blitt rapportert å utvise anti-kreft effekt i flere kreftcelletyper [16-17, 30-31].
Apoptose er mediert av de indre og ytre baner. Den indre vei er mediert av mitokondrie ytre membran permeabilization (MOMP) og cytokrom c utgivelse fra mitokondriene til cytoplasma [32-33]. I cytosol, induserer cytokrom c montering av apoptosome, som inneholder adapteren protein Apaf-1 og apoptose-initiere protease caspase-9. Apoptosome formasjon aktiverer caspase-9, som aktiverer effektor caspaser [34]. Den ytre vei mottar signaler gjennom bindingen av ekstracellulære protein ligander til proapoptotiske-DR befinner seg på celleoverflaten [23]. Selv om flere DRs har blitt beskrevet, har vi fokusert på Fas (CD95) og DR5 og deres respektive ligander som Fas ligand (Fas L) og TRAIL [35]. DRs har en intracellulær død domene som rekrutterer adapter proteiner og caspase-8 [36]. Binding av død ligand til DR resulterer i dannelsen av dødsinduserende signale kompleks (DISC), sammensatt av død reseptor, FADD og caspase-8 [37]. Den DISC aktiverer en nedstrøms signalkaskade som resulterer i apoptose [38-40]. Vi har undersøkt hvilke veier som er involvert i apoptose indusert av CTS i Siha livmorhalskreftceller. Selv om indre vei relaterte faktorer som ikke ble berørt av CTS behandling (S1 figur), uttrykk nivåer av ytre vei-relaterte faktorer som Fas, DR5, TRAIL, og caspase-8, ble påvirket av CTS behandling (figur 6).
Våre resultater viser at CTS har en betydelig anti-kreft effekt mot cervikale kreftceller. Dette er den første demonstrasjonen av evne til CTS for å inhibere ekspresjon av HPV-16 E6 og E7-onkogener, og for å indusere apoptose mediert av den ytre vei i cervikale kreftceller. Imidlertid bør videre studier identifisere spesifikke forbindelser i CTS ansvarlige for sine kreft effekter.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Effekter av CTS på mitokondriemembranen potensial og cytokrom C utgivelse i Siha livmorhalskreftceller. Product: (A) Forskjellen i JC-1 farger ble analysert ved flowcytometri. JC-1 aggregater (oransje) er en funksjon av friske celler, mens JC-1 monomere (grønt) er en funksjon av apoptotiske celler. (B) Western blot analyse av anti-apoptotiske faktorer Bcl-2 og Bcl-xL, pro-apoptotisk faktor Bax og cytokrom C i Siha livmorhalskreftceller. Siha celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av CTS i 24 timer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0150235.s001 plakater (TIF)
Takk
Denne forskningen var støttet av den grunnleggende program (2015R1A2A2A09001137) av National Research Foundation of Korea (NRF). (https://www.nrf.re.kr/nrf_eng_cms). D.Y. Yoon ble støttet delvis av Priority Forskningssentre Program (2012-0006686).
