Abstract
Cisplatin, en vanlig brukt kjemoterapeutisk, er assosiert med ototoksisitet, nyretoksisitet og nevro, og dermed identifisere middel til å øke den terapeutiske indeks av cisplatin kan gi rom for bedre resultater. En SNP (rs4343077) innenfor
EPS8
, oppdaget gjennom et genom bred sammenslutning studie av cisplatin-indusert cytotoksisitet og apoptose i lymfoblastoide cellelinjer (LCLer), forutsatt drivkraft for å studere dette genet. Hensikten med dette arbeidet var å vurdere rollen til
EPS8
i mobilnettet mottakelighet for cisplatin i kreft og ikke-kreftceller. Vi brukte
EPS8
RNA interferens for å fastslå effekten av redusert
EPS8
uttrykk på LCL og A549 lungekreft celle følsomhet for cisplatin.
EPS8
knockdown i LCLer resulterte i en 7,9% økning i cisplatin-indusert overlevelse (
P
= 1.98 × 10
-7) og en 8,7% nedgang i apoptose (
P
= 0,004) sammenlignet med kontroll. I kontrast, redusert
EPS8
uttrykk i lungekreftceller resulterte i en reduksjon 20,6% i cisplatin-indusert overlevelse (
P
= 5.08 × 10
-5). Vi undersøkte deretter en
EPS8
inhibitor, mitramycin A, som en potensiell middel for å øke den terapeutiske indeks av cisplatin. Mitramycin En redusert
EPS8
uttrykk i LCLer resulterer i redusert cellulær følsomhet for cisplatin som gjenspeiles av lavere caspase 3/7 aktivering følgende cisplatin behandling (42,7% ± 6,8% i forhold til å kontrollere
P
= 0,0002 ). I 5 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer, mitramycin A også resulterte i redusert
EPS8
uttrykk. Tilsetning av mitramycin til 4 NSCLC-cellelinjer og en blærecancercellelinje, resulterte i økt følsomhet for cisplatin som var betydelig mer uttalt i tumorcellelinjer enn i LCL-linjer (p 0,0001). En EGFR-mutant-småcellet lungekreft-cellelinje (H1975) viste ingen signifikant endring i følsomhet overfor cisplatin med tillegg av mitramycin behandling. Derfor kan en hemmer av
EPS8
, slik som mitramycin A, forbedre cisplatin behandling ved å øke følsomheten for svulst i forhold til normale celler
Citation. Gorsic LK, Stark AL, Wheeler HE, Wong SS, Im HK, Dolan ME (2013)
EPS8
Hemming Øker Cisplatin følsomhet i lungekreft celler. PLoS ONE 8 (12): e82220. doi: 10,1371 /journal.pone.0082220
Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center i Dallas, USA
mottatt: 13. juni 2013, Godkjent: 24 oktober 2013; Publisert: 19.12.2013
Copyright: © 2013 Gorsic et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne er takknemlige for National Institute of Health, National Institute of General Medical Sciences UO1GM61393 (mED), National Institute of Health klinisk og translasjonell Science Award TL1 RR25001 (ALS), National Institute of Health Cancer Biology Training Grant T32CA009594 (HEW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cisplatin er en platina brukes til behandling av hode og nakke, eggstokkreft, livmorhalsen, testiklene, og lungekreft; men alvorlige toksisitet og iboende /ervervet resistens forstyrre sin effekt [1]. Forstå genetiske og molekylære mekanismer som denne kjemoterapeutisk middel forårsaker giftige bivirkninger ville være til stor nytte for pasientene. Spesielt identifikasjon av gener hvis ekspresjon bidrar til toksisitet ville tillate for utvikling av kjemoterapi for å omgå toksiske effekter.
Laboratoriet har utviklet en preklinisk modell farmakogenetiske anvendelse av lymfoblastoide cellelinjer (LCLer) for å identifisere genetiske varianter er tilknyttet mottakelighet for kjemoterapeutika å utfylle og forbedre kliniske farmakogenetiske studier [2] – [5]. Viktigere, varianter identifisert i cellebasert tilnærming har vist seg å være assosiert med responsen i eggstokk-kreft [6], lungecancer [7], hode- og nakkekreft [8], og paclitaxel-indusert perifer nevropati hos brystkreftpasienter [ ,,,0],9], som gir tillit til celle-basert modell for å identifisere klinisk relevante varianter.
for de fleste LCL studier, legemiddelindusert celleveksthemming ble den farmakologiske fenotype målt, men dette er en bred fenotype som inkluderer cellulære prosesser som fører til nekrose, celledød gjennom apoptotiske og ikke-apoptotiske reaksjonsveier, cellesyklus-stans og skadede celler som gjennomgår DNA-reparasjon [10]. Apoptose, en mer spesifikk fenotype, kan kaste lys over relevante enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) forbundet med cisplatin respons hos pasienter som følge av cisplatin er kjent for å forårsake celledød gjennom en apoptotisk reaksjonsvei [11]. Derfor, i en tidligere studie vi behandlet HapMap LCLer med cisplatin og målt caspase 3/7 aktivering samt celleveksthemming [12]. En GWAS avslørte 2449 SNPs og 1629 SNPs suggestively forbundet med cisplatin-indusert apoptose og cytotoksisitet (
P
0,001), henholdsvis med 19 overlappende SNPs [12]. En av de vanligste SNPs, rs4343077, der mindre allelet hadde lavere cisplatin-indusert apoptose (
P
= 0,0007) og høyere survivial (
P
= 0,0007) er også et uttrykk kvantitativ egenskap locus (eQTL) forbundet med baseline genuttrykk nivåer av 28 gener på
P
≤10
-4 [12]. Denne SNP er i et intron av epidermal vekstfaktor reseptor pathway underlaget 8 (
EPS8
).
Interessant,
EPS8
er spesielt knyttet til cisplatin- og paclitaxel-indusert narkotika reaksjon, hvor livmorhalskreftcellene ble mer følsomme for behandling etter
EPS8
knockdown [13]. Nylig,
EPS8
ble også funnet å være overuttrykt i menneskelige maligne gliomer og fremmet sin cellevekst [14]. Studier har rapportert økt uttrykk av
EPS8
i andre ulike humane tumorer inkludert eggstokkreft, kolorektal, lunge, hypofyse og muntlig kreft [15]. Som et resultat,
EPS8
svekking har vist seg å påvirke cellemigrering og cellulær proliferasjon i kreftceller [15].
På grunn av viktigheten av å
EPS8
som reaksjon på cisplatin i tumorceller [13] og vår identifikasjon av en SNP innenfor
EPS8 plakater (rs4343077) assosiert med både cisplatin cytotoksisitet og apoptose [12], vi evaluert relevansen av
EPS8
i følsomhet ytterligere til cisplatin. For å oppnå dette, brukte vi siRNA mot
EPS8 Hotell og en kjent
EPS8
inhibitor, mitramycin. Nedregulering ved hjelp av siRNA og /eller inhibering av
EPS8
av mitramycin resulterte i redusert større hemming av cellevekst i ikke-EGFR-mutante lungekreftceller og en blære cellelinje etter cisplatinbehandling. Vår studie identifiserer betydningen av
EPS8
i cisplatin-indusert cytotoksisitet.
Materialer og metoder
Cellelinjer
Ni LCLer (GM6991, GM7348, GM10838 , GM11994, GM12239, GM10859, GM11830, GM11840, GM12156) stammer fra individer av Nord- og Vest-europeisk opphav (HapMap CEU) ble opprettholdt i RPMI 1640 medium som inneholder 15% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, Utah, USA) og 20 mm L-glutamin. Cellelinjer ble fortynnet 3 ganger i uken til en konsentrasjon på 350.000 celler /ml. A549, ble NCI-H1437, NCI-H1563 og NCI-H1975 (human ikke-småcellet lunge- karsinom-cellelinjer) holdt i RPMI 1640 inneholdende 10% føtalt bovint serum. NCI-H2126 (human ikke-småcellet karsinom cellelungelinjen) ble opprettholdt i DMEM: F12 inneholdende 0,005 mg /ml insulin, 0,01 mg /ml transferrin, 30 nM natriumselenitt, 10 nM hydrokortison, 10 nM beta-østradiol, ekstra 2 mM L-glutamin og 5% føtalt bovint serum (medium foreslått av ATCC). HTB9 (urinblære klasse II-carcinom-cellelinje) ble opprettholdt i RPMI 1640 og 10% føtalt bovint serum. Alle cellelinjer ble lagret i en 37 ° C inkubator med 5% CO
2. Kreftceller, medium og komponenter ble kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia, USA), Cellgro (Herndon, Virginia, USA) eller Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA).
Drugs
cisplatin og mitramycin A ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich dimetylsulfoksyd ble anvendt for å fortynne cisplatin til et 20 mM forråd, mens mitramycin ble fortynnet til en lager-konsentrasjon på 0,06 um ved anvendelse av fosfatbufret saltvann.
Sammenheng mellom
EPS8 Hotell og fenotyper
Genome-wide genuttrykk data ble samlet inn i vår lab med Affymetrix Genechip Menneskelig exon Array 1,0 ST Array [16] og alle rå ekson array-data har vært avsatt til Gene Expression Omnibus (tiltredelse no. GSE7761).
EPS8
genuttrykk nivåer ble korrelert til 5 mikrometer cisplatin-indusert cytotoksisitet og apoptose [12] i CEU LCLer (n = 77). Lineær regresjonsanalyse mellom
EPS8
nivåer og hver fenotype som ble utført med GraphPad Prism 4.
RNA interferens
Knockdown eksperimenter ble utført for å demonstrere effekten av lavere
EPS8
nivåer på cisplatin-indusert cytotoksisitet og apoptose. Bruke Lonza cellelinje 96 brønner Nucleofector Kit SF (Lonza Inc, Basel, Sveits), LCLer og A549 ble nucleofected 24 timer etter å ha blitt sådd på 5,5 × 10
5 celler /ml og 4,0 × 10
5 celler /ml, respektivt. Cellene ble sentrifugert ved 90 x g i 10 minutter ved romtemperatur og resuspendert i en konsentrasjon på 1 x 10
6 celler /20 ul i SF /supplement oppløsning og 2 mM sluttkonsentrasjon på AllStars negativ kontroll siRNA merket med AlexaFluor488 (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) eller en pool av Hs_EPS8 (SI00380737, SI03109302, SI00380751, SI00380744) FlexiTube siRNA (Qiagen). Program DN-100 ble brukt for LCL nucleofection og CM-130 for A549. Celler ble gitt 10 minutter hvile før tilsetningen av RPMI-medium, og deretter belagt for cytotoksisitet eller apoptose og inkubert over natten.
Cytotoksisitet følgende siRNA eller behandling med mitramycin
An alamarBlue celleveksthemmende analyse ble brukes til å måle cytotoksiske virkninger av cisplatin og mithramycin [17]. For
EPS8
siRNA eksperimenter, LCLer (GM6991, GM7348, GM10838, GM11994 og GM12239) ble behandlet med 5 mikrometer cisplatin 5 timer poste nucleofection, mens A549 ble behandlet med 5 mikrometer cisplatin 24 timer etter nucleofection. Følgende medikamentbehandling celler ble inkubert i 24 timer. AlamarBlue ble deretter tilsatt, og platene ble inkubert i ytterligere 24 timer før den ble avlest ved bølgelengder på 570 og 600 nm ved hjelp av Synergy HT (Biotek, Winooski, VT) og prosent overlevelse ble beregnet [12]. Å observere cytotoksiske respons med
EPS8
knockdown gjennom mithramycin, celler (GM10859, GM11830, GM11840, GM12156, A549, H1437, H1563, H1975, H2126 og HTB9) ble belagt og behandlet med enten mitramycin alene (0 og 0,01 uM), cisplatin alene (0, 1, 2,5, 5, 10 20, 25 og 50 uM), eller cisplatin i forskjellige konsentrasjoner i kombinasjon med 0,01 uM av mitramycin. Mitramycin behandling oppstod rett etter plating. Cellene ble deretter behandlet med cisplatin 6 timer legge mitramycin tilsetning og 10% av den totale brønnvolumet alamarBlue ble tilsatt 24 timer etter behandling med cisplatin. Etter ytterligere 24 timers inkubasjonsperioden ble platene lest som angitt ovenfor. Alle eksperimenter for prosent overlevelse målinger ble belagt i tre eksemplarer med et minimum av to separate eksperimenter.
Apoptose assay
Cisplatin- og mitramycin-indusert apoptose ble målt ved bruk av Caspase-Glo 3/7 reagens fra Promega Corporation (Madison, WI) som tidligere beskrevet [12]. For
EPS8
siRNA eksperimenter, belagt celler ble behandlet med 5 mikrometer cisplatin 5 timer poste nucleofection og caspase 3/7 ble målt 24 timer etter cisplatin behandling. For å evaluere
EPS8
genuttrykk følgende mithramycin eksponering ble cellene belagt og umiddelbart behandlet med mithramycin (0 eller 0,01 mm), deretter behandlet med 5 mikrometer cisplatin 20 timer etter mithramycin tillegg. Kaspase 3/7-aktiviteten ble målt 24 timer etter cisplatin og beregnet i forhold til kontrollgruppen (intet medikament tilsetning). Resultater for apoptose målinger representerer eksperimenter belagt i tre eksemplarer med et minimum av to uavhengige repetisjoner.
Kvantifisering knockdown av
EPS8
Celler ble pelletert på 5, 29 og 53 timer etter nucleofection med
EPS8
siRNA og egge kontroll, samt 6 og 20 timer etter mithramycin behandling. RNA ble ekstrahert ved hjelp av RNeasy Plus Mini kit og Qiacube (Qiagen) etter produsentens protokoll. mRNA ble deretter revers transkribert til cDNA, hvilket ga sluttkonsentrasjoner på 25 eller 50 ng /pl ved bruk av High Capacity Reverse Transcription kit (Applied Biosystems, Life Technologies, Grand Island, NY). CDNA ble brukt til å utføre QRT-PCR for å bekrefte knockdown av
EPS8 product: [18]. Applied Biosystems TaqMan primer ble brukt til å kvantifisere mRNA uttrykk for
EPS8 plakater (Hs00610286_m1).
Blandede effekter modell
Effekten av
EPS8
knockdown på cisplatin indusert apoptose og veksthemming ble modellert ved hjelp av følgende blandede effekter modell:
forsøk og cellelinjer var tilfeldige effekter som åpner for eksperiment spesifikke og cellelinje spesifikke avskjærer og knockdown status ble ansett som en fast effekt. Y representerer apoptose eller veksthemming. P-verdier for knockdown effekten ble beregnet ved hjelp av likelihood ratio test med modeller passer med REML satt til false. Egnethets av modellene ble vurdert å undersøke ut restene «distribusjoner. R Statistisk programvare (R Development Core-teamet https://www.R-project.org/) og
lme4
pakke (R pakke versjon 0,999375 til 42 https://CRAN.R-project.org/pakke = lme4) ble brukt for analyse.
samspill mithramycin ± cisplatin
for å teste samspillet effekten av celletype (tumor vs LCL) og mithramycin behandling på cisplatin dose-responskurve vi passer en blandet effekter. Den endelige modellen var: hvor den naturlige logaritmen av prosent overlevelse ble utfallet og tumor (status vs LCL status) og mithramycin behandling (TRT) ble løst effekter med interaksjonsledd; exp antydet en av de to biologiske replika og er montert som tilfeldig virkning; cisplatin dose og dens kvadrat ble brukt til å modellere doseresponskurven som tillater å være forskjellig for tumor og LCL linjer; cellelinje id ble lagt til som en tilfeldig effekt å ta hensyn til innenfor cellelinje korrelasjon. Ved montering av modellen resultatene på null konsentrasjon av begge legemidler (rader hvor overlevelse utfallet = 1 på grunn av måten prosent overlevelse ble beregnet) ble ekskludert. Log transformasjon ble brukt til å forbedre modell passer. Den koeffisient av samspillet sikt tumor:trt kan tolkes som gjennomsnittlig forskyvning av doseresponskurve når mithrmycin ble lagt inn i tumorlinjer i forhold til LCL linjer.
Resultater
Vellykket knockdown av
EPS8
gjennom RNA interferens
Fem CEU LCLer og kreftcellelinje A549 lunge ble benyttet for studier med
EPS8
knockdown. Celler ble nucleofected med enten en kryptert kontroll eller siRNA av
EPS8
. Sammenligne med det forvrengte styre,
EPS8
knockdown ble vist å være vellykket i alle 6 cellelinjer (Fig. 1A). De gjennomsnittlige prosenter av
EPS8
tvers av alle LCLer på 5, 29, og 53 h tidspunkter var 17,2 (± 7,5), 19,0 (± 4,3) og 40,6% (± 7,3), henholdsvis. A549 oppnådd
EPS8
knockdown til 7,4% og 10,5% i forhold til egge kontroll på 29 og 53 timer, henholdsvis.
Verdier består av 2 uavhengige eksperimenter med QRT-PCR kjøres i to eksemplarer. Cellelinje endringer i prosent overlevelse (
P
= 1.98 × 10
-7) og caspase 3/7 aktivitet (
P
= 0,004) for alle LCLer og A549 (
P
= 5.08 × 10
-5) på 5 mikrometer cisplatin grunn til
EPS8
knockdown vises med standard feil av gjennomsnittet bruker 6 replikerer fra 2 uavhengige forsøk (B).
Fenotypisk endres med
EPS8
siRNA
etter å ha bekreftet knockdown av
EPS8
, evaluert vi endringene i følsomhet for cisplatin målt som prosent overlevelse og caspase 3/7 aktivering. Korrelasjonen mellom
EPS8
uttrykk og cisplatin-indusert cytotoksisitet indikerte lavere nivåer av
EPS8
uttrykk signifikant korrelert til større prosent overlevelse på fem mikrometer cisplatin (
P
= 0,047); men cisplatin indusert apoptose nådde ikke signifikans (
P
= 0,499) (fig. S1). Ved hjelp av en blandet effekt-modell som kombinerer alle cellelinjer,
EPS8
RNA interferens viste en økt overlevelse av cisplatin-behandlet LCLer med et gjennomsnitt på 7,9% (
P
= 1.98 × 10
– 7) og redusert apoptose med et gjennomsnitt på 8,7% (
P
= 0,004) (fig. 1B). Disse resultatene viser at lavere nivåer av
EPS8
i LCLer redusere cellular følsomhet for cisplatin som gjenspeiles av økt celle overlevelse og redusert apoptose aktivitet ved behandling med cisplatin. Dermed sank
EPS8
i LCLer gir resistens mot cisplatin toksisitet. I motsetning til dette,
EPS8
nedregulering i A549 forårsaket større følsomhet overfor cisplatin med en reduksjon 20,6% i prosent overlevelse (
P
= 5,08 x 10
-5) (Fig. 1B).
mitramycin reduserer uttrykk for
EPS8
i kreft linjer og LCLer
Nivåer av
EPS8
uttrykk ble målt 6 og 20 timer etter behandling med mithramycin (0,01 mikrometer). Nivåer av
EPS8
ekspresjon ble redusert på tvers av alle 4 LCLer testet, med et gjennomsnitt på 74,4% (± 3,4) ved 6 timer og 29,8% (± 3,7) 20 timer i forhold til å få tak følgende mitramycin eksponering (fig. 2A ). Mitramycin også redusert
EPS8
uttrykk nivåer i 5 NSCLC cellelinjer og blærekreft cellelinje til et gjennomsnitt på 95,7% (± 3,4) på 6 timer og 59,9% (± 14.7) 20 timer med eksponering, sammenlignet med ingen medikamentell behandling kontroll (fig. 2B). Disse målingene bekrefter at behandlingen av mithramycin (0,01 mm) gir lavere uttrykk for
EPS8
i kreft lunge og blære celler samt i noncancerous LCLer.
Prosent verdier vist inkluderer to uavhengige eksperimenter med QRT-PCR kjøre i to eksemplarer for hvert forsøk med standard feil av gjennomsnittet.
mitramycin reduserer følsomheten LCLer til cisplatin
Vi bestemte da effekten av mithramycin på følsomheten LCLer til cisplatin-indusert caspase 3/7 aktivering. Snitt apoptose-nivåer over den 4 LCLer følgende cisplatin alene var 5,94 (± 0,9) i forhold til kontrollen, i forhold til cisplatin pluss mitramycin som sank den gjennomsnittlige caspase 3/7 nivåer til 3,38 (± 0,5) (fig. 3). Kaspase 3/7 aktivitet etter mitramycin alene (0,01 uM) resulterte i et gjennomsnitt på 3,41 (± 0,4) på tvers av 4 LCLer. Selv om mithramycin og cisplatin separat indusere apoptose, det var en gjennomsnittlig nedgang på 42,7% (± 6,8
P
= 0,0002) i caspase 3/7 aktivering ved å kombinere mithramycin med cisplatin sammenlignet med cisplatin alene, noe som tyder på en beskyttende effekt av mithramycin i form av apoptose. Lunge- og blærecancerceller ble også testet for apoptose med cisplatin (5 uM) i nærvær og fravær av mithramycin; men caspase 3/7 aktiveringsnivåer for disse cellene var ikke over baseline.
Hver LCL opplevd lavere cisplatin-indusert apoptose aktivitet med den ekstra mithramycin forhold til en ikke medikamentell behandling kontroll. Mitramycin behandlet 10859, 11830, 11840 og 12156 resulterte i en 47,1, 40,8, 48,9 og 34,0% nedgang fra cisplatin alene, henholdsvis. Dataene representerer to separate eksperimenter som hver ble utført i tre eksemplarer med standardfeil for gjennomsnittet.
mitramycin forbedrer følsomheten av tumorceller til cisplatin
I tillegg til å teste apoptose nivåer med cisplatin og mithramycin i LCLer og kreftceller, vi også målt hemming av cellevekst. Fem NSCLC cellelinjer med ulike mutasjonsstatuser ble valgt for studien; virkningen av mitramycin alene varierer for disse kreftcellelinjer som strekker seg 59,7 til 92,9% hemming av cellevekst (tabell 1). Sensitivitet overfor cisplatin ble funnet å øke med mitramycin behandling i 4 molekylært distinkte NSCLC-celler (Fig. 4). H1975 med en EGFR mutasjon, opplevde ingen vesentlig endring. Siden cisplatin er også brukes til behandling av blærekreft, valgte vi også å måle cisplatin og mithramycin effekter i en blære tumor linje for å se hvorvidt effekten ville etterligne NSCLC resultater; Vi observerte 59,6% overlevelse med mitramycin behandling alene (Fig. 4).
Square form representerer cisplatin konsentrasjoner alene, mens trekanten representerer cisplatin med tillegg av mitramycin (0,01 uM). Kurvene representerer to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer med standard feil av gjennomsnittet.
Men når undersøke effekten av mithramycin på følsomheten LCLer til cisplatin, vi ikke observere den samme grad av forbedret cellevekst inhibering. Mitramycin alene over 4 LCLer forårsaket en gjennomsnittlig celleveksthemming på 63,1% (± 12,8) 0.01 uM (fig. S2). Doseresponskurven for LCLer er forskjøvet nedover i gjennomsnitt omtrent 17% når mitramycin ble tilsatt. For tumorlinjer forskjøvet doseresponskurven nedover omtrent 26% i gjennomsnitt. P-verdien av samspillet begrepet var
P
0,0001. Dette, sammen med apoptose resultater, støtter forestillingen om at redusert uttrykk for
EPS8
via mithramycin er ikke like skadelig for LCL overlevelse som det er for kreftcellelinjer. Mitramycin forårsaker større følsomhet i NSCLC celler uten EGFR mutasjon og eventuelt andre typer kreft vev som sett av våre resultater i blæren tumor cellelinje, HTB9.
Diskusjoner
I denne studien har vi evaluert
EPS8
som et potensielt mål for kombinasjonsbehandling med cisplatin.
EPS8
ble valgt basert på tidligere prekliniske GWAS resultater ved hjelp av flere cellulære fenotyper: cisplatin-indusert cytotoksisitet og cisplatin-indusert apoptose målt ved caspase 3/7 aktivering. SNP (intronic til
EPS8
), rs4343077, var assosiert med cisplatin-indusert cytotoksisitet og apoptose samt baseline uttrykk av 28 målgener. Ved knockdown av
EPS8
ekspresjon i 5 LCLer, vi har observert en signifikant reduksjon i celle følsomhet overfor cisplatin, målt ved hemming av cellevekst og caspase 3/7 aktivering (
P
= 1,98 x 10
-7 og
P
= 0,004, henholdsvis) over LCLer. Litteratur bevis foreslo
EPS8
knockdown i tumorcellelinjer økt cellulær følsomhet for cisplatin [13], [15]. Våre resultater er enig med disse funnene, som viser at
EPS8
downregulation sensitizes A549 lungekreftceller til cisplatin behandling. Vi utvidet våre studier med andre molekylært definerte lungecellelinjer og en blære cellelinje, så vel som LCLer.
EPS8
knockdown i LCLer følgende mithramycin behandling resulterte i en nedgang i apoptotiske aktivitet når mithramycin ble kombinert med cisplatin sammenlignet med cisplatin alene. Selv om celle-cytotoksisitet målinger viste en liten økning i følsomheten av LCLer til cisplatin følgende mitramycin eksponering, følsomhet av kreftcellelinjer var signifikant større med mitramycin tillegg i forhold til LCLer. Unntaket var NSCLC cellelinje H1975 med en EGFR mutasjon. Dette innebærer knockdown av
EPS8
gjennom enten siRNA eller bruk av en inhibitor som mithramycin kan være en strategi for å øke svulst følsomhet for cisplatin.
EPS8 er et oncoprotein bidrar til malign transformasjon i tumorceller [12], [19]. Det er et substrat for epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) og deltar i EGFR signaliserer gjennom Rac, og trafficking gjennom Rab5 [20]. Dens tri-kompleks forhold med
SOS1 Hotell og
ABI1
har vist seg å være en viktig komponent for lysofosfatidisk syre-stimulert cellemigrasjon og Rac aktivering, som har vist seg å spille en viktig rolle i ovarian cancer metastase [21]. Nivåer av
EPS8
har også blitt implementert som en prognostisk verktøy for pasienter i tidlige stadier av livmorhalskreft [13]. Pasienter som har høyere uttrykk av
EPS8
tendens til å oppleve parametrial invasjon, lymfeknutemetastase og en reduksjon i overlevelse.
I utgangspunktet Yang et al. (2010), undersøkte mitramycin, et antibiotikum fra
Streptomyces
arter, som en potensiell hemmer av
EPS8
. De fastslått at mitramycin reduserer mRNA og proteinnivåene av
EPS8
i en human kolorektal adenokarsinom epitelial cellelinje og en human lungecarcinom epitelcellelinje. Videre
EPS8
nedregulering, ved mitramycin behandling, fører til en betydelig reduksjon i kreftcellevekst og migrasjon evne til [22].
mitramycin har vært en godkjent klinisk anticancer medikament siden 1970 [23] og som brukes i USA for klinisk behandling av Pagets sykdom, testikkel karsinom, og hyperkalsemi hos pasienter som opplever malignitet-forbundet benlesjoner [24] – [28]. Imidlertid har bruken i terapi behandling redusert gjennom årene på grunn av sine skadevirkninger og smal terapeutisk indeks [29]. Pasienter som behandles med mithramycin, for disse sykdommene, har blitt sett å oppleve gastrointestinal, lever, nyre og benmargs toksisitet, noe som resulterer i kvalme, oppkast og blødninger [30]. Til tross for sine alvorlige bivirkninger, har det vært en fornyet interesse for mitramycin nå at forståelse av dens vekselvirkninger på det molekylære nivå er under utvikling [29].
mitramycin er blitt funnet å interagere med GC-rikt DNA-områder plassert på den mindre spor av DNA [29], [31] – [33], som for tiden er antatt å forhindre transkripsjonsfaktor spesifisitet protein 1 (SP1) fra binding til en rekke promotere av proto-onkogener. Men Sp1 bindingsseter som ikke er relatert til en undergruppe av proto-onkogener synes å forbli upåvirket, slik som arrangøren p21
cip1 /waf1 [29]. Derfor, mitramycin kan ikke være spesifikke for Sp1 hemming og kan potensielt rettet mot et onkogen oppstrøms Sp1 interaksjon. Det har tidligere oppdaget at mithramycin reduserer også uttrykk for
c-myc
,
c-myb
,
c-src
,
c-met
og FOXM1 [22], [34]; imidlertid, mitramycin øker nivået av FOXO3A [34], en transkripsjonsfaktor som regulerer DNA-skade respons. Det kan være en mulighet for at disse genene henger sammen i et reaksjonsvei nedstrøms for mitramycin mål.
For eksempel,
EPS8
også er blitt vist å oppregulere FOXM1 [35], er en viktig faktor i utvikling og progresjon av visse kreftformer [36] som er kjent for å direkte binde med SP1 [37], [38]. SP1 og FOXM1 har vist seg å transactivate arrangører av
c-myc
synergi [38]. Videre
EPS8
demping har blitt funnet å redusere nivåene av
Src
,
SHC Hotell og
FAK plakater (også kjent som
PTK2
), en intracellulær tyrosin kinase som deltar i celle-adhesjon og motilitet [39]. FOXO3A kan også reguleres ved nærvær eller fravær av
EPS8
gjennom forskjellige veier, enten gjennom PI3K /AKT /mTOR signalering [40], eller via Ras-Raf-MEK-ERK-reaksjonsveien [41]. Shiota et al. (2010) undersøkte cisplatin motstand og bestemt at cisplatin resistente celler ble sensibilisert for behandling gjennom induksjon av FOXO3A av mitramycin [34]. En reduksjon i AKT signale aktiverer FOXO3A og induserer apoptose [36]; Derfor er det mulig at en reduksjon i
EPS8
nivåer avtar AKT, utløser fosforylering av FOXO3A og kreftceller til å gjennomgå apoptose i stedet for fortsatt spredning.
Ta en kollektiv titt på litteratur og vår resulterer det virker interessant at lungekreft cellelinje som ikke opplever økt celledød med mithramycin (H1975) har en EGFR mutasjon. Lungetumorcellelinje H1975 har en punktmutasjon i aktiverings sløyfen forårsaker en endring fra leucin til arginin (L858R) i exon 21, så vel som en sekundær punktmutasjon, T790M, endring av normal EGFR aktivitet [42]. EGFR tyrosin-hemmere brukes vanligvis til å bevisstgjøre EGFR muterte tumortyper til platina agenter, men EGFR vill type svulster sjelden svar på disse hemmere [43]. Potensielt kan tillegg av en mithramycin diett være gunstig for pasienter med villtype EGFR å bli sensibilisert for platina behandling gjennom hemming av
EPS8 Kjøpe og nedstrøms mål som spiller en stor rolle i tumorcellevekst, heft og motilitet . En mitramycin dose stor nok til å hemme visse onkogener, men lav nok til ikke å forårsake flere uønskede bivirkninger, ville tillate det kjemoterapeutiske middel til en mer effektiv måte forårsake cellulær død av tumorcellene.
Som konklusjon, våre resultater validere
EPS8
engasjement i celle respons på cisplatin behandling. Selv om vi testet mithramycin, kan det være mer spesifikke inhibitorer av
EPS8
som resulterer i en økt differanse mellom kreftceller og normale celler. Mitramycin evne til å redusere nivåene av
EPS8
forårsaket mindre apoptotisk aktivitet i LCLer enn ved cisplatin behandling alene. Redusert ekspresjon av
EPS8
gjennom behandling med mitramycin er mindre skadelig for normale celler (som målt i LCLer) sammenlignet med kreftceller. Samlet gir våre data ytterligere bekreftelse av rollen og betydningen av
EPS8
i cisplatin-indusert toksisitet og som et lovende mål for forbedring av cisplatin terapi.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Sammenheng mellom
EPS8
uttrykk nivåer og CEU LCL log transformert prosent overlevelse (
P
= 0,047, r
2 = 0,05, øverst) og caspase 3/7 aktivitet (
P
= 0,499, r
2 = 0,006, nederst)
doi: 10,1371 /journal.pone.0082220.s001 plakater (TIFF)
Figur S2.
LCLer er vist ved forskjellige konsentrasjoner av cisplatin med tilstedeværelse og fravær av mitramycin. Firkantet form representerer cisplatin konsentrasjoner alene, mens trekanten representerer cisplatin med tillegg av mitramycin (0,01 uM). Kurvene representerer to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer med standard feil av gjennomsnittet
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0082220.s002
(TIFF)
bekreftelser
Forfatterne er takknemlige for Farmakogenomikk av legemidler mot kreft cellelinje Kjerne ved University of Chicago for å få hjelp i bestilling og mottar disse cellelinjene.
