Abstract
Bakgrunn
Jiaogulan (Gyp), de viktigste komponentene fra
Gynostemma pentaphyllum
Makino, er mye brukt i tradisjonell kinesisk medisin. Denne studien forsøkte å undersøke anti-kreft effekt og de underliggende mekanismene for Gyp på menneskelige kolorektal kreft celler SW-480.
Materialer og metoder
Den hemmende effekten av Gyp på SW-480 -celler ble evaluert ved MTT-analyse. Apoptotisk celledød ble detektert ved kjerne Hoechst 33342 farging og DNA-fragmentering analyse. Apoptose ble analysert ved hjelp av Annexin V-PE /7-amino-actinomycin D farging. Cellemembranen integritet ble evaluert med flowcytometri følgende PI farging. Endringer av mitokondriemembranen potensial (
Δψ
m) ble påvist gjennom flowcytometri analyse av rhodamine 123 (Rh123). Rollen av reaktive oksygenforbindelser (ROS) i Gyp indusert celledød ble undersøkt ved intracellulær ROS generasjon og generell ROS åtseldyr. Sårhelende analysen ble utført for å undersøke Gyp-hemmet migrering av SW-480 celler
in vitro
. I tillegg ble forandringer i F-aktin microfilaments analysert ved hjelp av FITC-merket phalloidin toksin farging og de morfologiske endringer ble evaluert under scanning-elektronmikroskop (SEM).
Resultatene
Etter Gyp behandling, plasmamembranen permeabiliteten til SW-480 celle ble øket,
Δψ
m ble redusert betraktelig, nivået av intracellulær ROS nivået ble øket, DNA-fragmentering og apoptotisk morfologi ble observert. Celler behandlet med Gyp utøve alvorlig fila nettverk sammenbrudd, så vel som vesentlig reduksjon i antallet av mikrovilli. Gyp induserte endringer av celle levedyktighet, cellemigrasjon, intracellulær ROS generasjon og kjernemorfologi var lette åpenbart til NAC.
Konklusjon
Resultatene i denne studien antydet at ROS spiller en viktig rolle i Gyp indusert celletoksisitet og apoptose, og mitokondriene skaden kan være oppstrøms ROS generasjon etter Gyp behandling. Funnene i denne studien gi nye bevis for anti-tumor mekanismer som Gyp induserer apoptose
in vitro
Citation. Yan H, Wang X, Niu J, Wang Y, Wang P Liu Q (2014) Anti-kreft effekt og de underliggende mekanismene for Jiaogulan på menneskelige tykktarmskreft SW-480 celler. PLoS ONE 9 (4): e95609. doi: 10,1371 /journal.pone.0095609
Redaktør: Nukhet Aykin-Burns, University of Arkansas for Medical Sciences; College of Pharmacy, USA
mottatt: 16. desember, 2013, Godkjent: 27 mars 2014; Publisert: 21 april 2014
Copyright: © 2014 Yan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National «Twelfth Five-Year» Plan for Science and Technology Support (2011BAI06B05). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en ledende dødsårsaken i verden, med nesten en million nye tilfeller og 500.000 dødsfall fra CRC rundt om i verden hvert år [1], [2]. Det er mange risikofaktorer for CRC, inkludert høy alder, inflammatoriske tarmsykdommer, medisinsk historie av godartede adenomatøse polypper, familiehistorie med CRC, lavt inntak av grønnsaker og frukt, høyt inntak av animalsk fett og bearbeidet kjøtt [3], [4] .
i klinisk behandling CRC, tradisjonelle behandlinger som strålebehandling, kjemoterapi og kirurgi er ikke den beste kur metoden for det på grunn av dårlig prognose og alvorlige bivirkninger. Derfor søker etter nye anti-tumor terapi er ekstremt presserende. Nå har naturlig medisin i kreftbehandling vakte stor bekymring i inn- og utland, på grunn av sin sikkerhet, effiiciency og minimale bivirkninger [5].
Jiaogulan (Gyp), en populær folkemedisinen i Kina, er de viktigste komponentene i utdrag fra
Gynostemma pentaphyllum
Makino. Det finnes hovedsakelig som dammarane type triterpene glykosider (figur 1). Gyp hadde vært kjent for sitt store positive effekter for behandling av hepatitt, hyperlipoproteinemia og hjerte-og karsykdommer [6] – [8]. Studier har vist at Gyp har en aktivitet av anti-inflammatorisk, anti-trombotisk, antioksiderende og anti-kreft handlinger [9] – [12]. Men, til nå, er det ingen rapport om Gyp-indusert anti-tumor effekt på menneskelige kolorektal kreft. Så, i denne studien, ble det cytotoksisitet og apoptose av SW-480 celle indusert av Gyp undersøkt. Rollen av reaktive oksygenforbindelser (ROS) i Gyp indusert celledød ble analysert ved intracellulær ROS generasjon og ROS åtseldyr. Disse resultatene kan gi bevis for rollen Gyp som en potent anti-kolorektal kreft agent i klinisk anvendelse.
Materialer og metoder
Kjemikalier og reagenser
Gyp ble vennlig levert av Ankang Pharmaceutical Institute of Beijing University. Pulveret ble oppløst i 80% etanol (EtOH) for å få en lagerløsning med 100 mg /ml, som ble sterilisert ved et 0,22 um membranfiltrering. 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltertrazolium bromid tetrazolium (MTT), rhodamin-123 (Rh123), Hoechst 33342, propidiumjodid (PI) og N-acetylcystein (NAC) ble anskaffet fra Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri, USA). 2 «, 7»- dichlorodihydrofluorescein-diacetat (DCFH-DA) og FITC-phalloidine ble levert av Molecular Probes Inc. (Carlsbad, CA, USA). Guava nexin Reagens ble hentet fra Millipore Corporation (Rica, MA, USA). Alle andre reagenser var kommersielle produkter av analysekvalitet.
Cell Kultur
Den menneskelige tykktarmskreft SW-480 celler ble hentet fra cellen bank av den kinesiske Academy of Science, Shanghai, Kina. Cellelinjen ble dyrket i RPMI-1640 medium inneholdende 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin (100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) og 1% glutamin i cellekultur kolbe under en fuktig 5% CO
2 og 95% luft atmosfære ved 37 ° C.
Vurdering av celleviabilitet etter Gyp Behandling
for å undersøke effekten av Gyp på SW-480 celleproliferasjon, celler ble sådd i 96-brønn plater. Forskjellige konsentrasjoner (0, 70, 100 og 130 ug /ml; 80% etanol ble anvendt som løsningsmiddel kontroll) av Gyp ble tilsatt og cellene ble inkubert i forskjellige tidsrom, i en tetthet på 1 x 10
5 celler /ml, henholdsvis. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved hjelp av MTT-analyse [13]. Absorbansen ved 570 nm ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser (Bio-Tek ELX800, USA). Den cellelevedyktighet Gyp behandlede prøvene ble deretter beregnet ved å sammenlignet med kontrollen.
Flow Cytometry Analyse av cellemembranintegritet
PI er en fluoriserende membran-impermeant fargestoff som farger kjernen ved interkalering mellom de stablede baser av nukleinsyre. Siden PI kommer inn i cellen bare hvis cellemembranen blir gjennomtrengelig, er det mye brukt i celledød undersøkelser for å måle integriteten av plasmamembranen. Når den er bundet til nukleinsyrer, den absorpsjonsmaksimum for PI er 535 nm og den maksimale fluorescensemisjonen er 617 nm [14]. Celler i 24-brønners plater ble behandlet med den angitte konsentrasjon av Gyp for 6, 12, 24 og 48 timer henholdsvis. Deretter ble cellene høstet og skylt to ganger med PBS, farget med 5 ug /ml PI i 5 minutter i mørket og analysert ved strømningscytometri. Data ble analysert ved hjelp av FCS Express V3 (De Novo Software).
Undersøkelse av mitokondriemembranen potensial (Δψ
m)
For å studere
Δψ
m forandringer, ble cellene farget med Rh123, som selektivt går mitokondrier med intakte membranpotensial og fastholdes i den mitokondrielle [15]. Når mitokondrier membranpotensialet er tapt, Rh123 deretter vasket ut av cellene. Celler i 24-brønners plater ble behandlet med den angitte konsentrasjon av Gyp for 4 og 8 timer. Cellene ble høstet og skylt to ganger med PBS, resuspendert i 500 ul av 1 ug /ml Rh123 og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter i mørket. Prøvene ble deretter umiddelbart detektert ved strømningscytometri. Data ble analysert ved hjelp av FCS Express V3 (De Novo Software).
flowcytometrisystemer Analyse av DNA Fragmentering
For å analysere DNA-fragmentering, flowcytometrisk påvisning av DNA hypoploidy etter tilsetting PI til de døende celler og permeabilizing dem ved fryse-tining ble utført [14]. Størrelsen på DNA-fragmenter som fremkommer som et hypoploid DNA histogram. For å undersøke effekten av Gyp på DNA skade av SW-480 celler, utførte vi oligonucleosomal DNA fragmentering av flowcytometri. Celler i 24-brønners plater ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Gyp for 6, 12, 24 og 48 timer henholdsvis. Cellene ble deretter farget med 5 ug /ml PI og analysert for DNA-innhold ved hjelp av strømningscytometri.
Hoechst 33342 Farging
For å kunne observere endringer av kjerner morfologi av tumorceller etter Gyp behandling, Hoechst 33342 farging ble anvendt. Etter behandling med den angitte konsentrasjon av Gyp for 6, 24 og 48 timer, ble cellene farget med 10 uM Hoechst 33342 i 15 minutter ved romtemperatur. Deretter ble de fargede cellene skylles tre ganger med PBS og observert ved hjelp av et fluorescens mikroskop med standard eksitasjon filtre. Eksitasjon bølgelengde og emisjon bølgelengde var 346 nm og 460 nm, henholdsvis.
Analyse av Cell apoptose
Cell apoptose ble oppdaget etter behandling med den angitte konsentrasjon av Gyp for 12 og 24 timer. Kvantifisering av celle apoptose ble målt ved Guava nexin assay, som benytter Annexin V-PE for å detektere fosfatidylserin på den ytre membran av apoptotiske celler. Membranen-impermeant fargestoff, 7-amino-actinomycin D, blir også brukt som en indikator på cellemembranintegritet. I korte trekk ble 100 ul celler til hver prøve suspendert i en blanding av 100 pl Annexin V-PE og 7-ADD bindingsbuffer. Etter inkubasjon ved romtemperatur i 20 minutter, ble prøvene analysert ved hjelp av strømningscytometri. Befolkningen ble delt inn i tre grupper: levende celler med lavt nivå fluorescens, de apoptotiske celler i tidligere stadier med grønn fluorescens, og på slutten av apoptotiske celler med både rød og grønn fluorescens
Wound Healing analysen
.
Cellene ble sådd ut i 24-brønners plater og inkubert i 24 timer. Deretter celler i individuelle brønner ble såret ved å skrape med en pipette tips og behandlet med den angitte konsentrasjon av Gyp. Etter 24 timer inkubering ble cellene fotografert under fase-kontrastmikroskopi.
fila Analyse
etter annen behandling, ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter ved 37 ° C. Celler ble permeabilisert med 0,1% Triton X-100 i PBS i 7 min, og blokkert med 1% BSA i PBS i 1 time ved 37 ° C. Mellom hvert trinn som er beskrevet ovenfor, ble cellene vasket tre ganger med PBS i 5 minutter ved 37 ° C. Fulgt blokkerende celler ble farget med 5 ug /ml FITC-phalloidine i 1 time ved 37 ° C i mørket. Bilder ble innhentet av en laser scanning confocal mikroskop (TCS SP5, Leica, Tyskland).
elektronmikroskop (SEM) Observasjon
Etter 24 timer etter ulike behandlinger, celler i hver gruppe ble fikset i fosfatbufret 2,5% glutaraldehyd-løsning, renset med PBS og dehydrert ved gradert alkohol, kritisk punkt tørket fra flytende CO
2 og gull freste. Overflatene på cellene ble observert ved scanning elektronmikroskop (S-3400N, Hitachi, Japan).
Påvisning av intracellulær reaktive oksygen arter (ROS) Generasjon og dens rolle i Gyp forårsaket Cytotoksisitet
for å bestemme endringer i ROS-nivå, måler vi den oksidative omsetting av den følsomme fluorescerende probe 2 «, 7′-dichlorofluorescein-diacetat (DCFH-DA) for å fluorescerende 2′, 7»-dichlorofluorescein (DCF). DCFH-DA diffunderer lett gjennom cellemembranen og enzymatisk hydrolysert ved intracellulære esteraser for å danne ikke-fluorescerende DCFH, som deretter hurtig oksyderes for å danne sterkt fluorescerende DCF i nærvær av ROS, og fluorescensintensiteten er proporsjonal med ROS produksjon. Celler i 24-brønners plater ble behandlet med den angitte konsentrasjon av Gyp for 4 og 8 timer. Cellene ble høstet og skylt to ganger med PBS, resuspendert i 500 pl av 10 pM DCFH-DA og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter i mørket. Prøvene ble deretter umiddelbart detektert ved strømningscytometri. Data ble analysert ved hjelp av FCS Express V3 (De Novo Software).
For å undersøkt hvilken rolle ROS i Gyp indusert celledød og apoptose, NAC (5 mM) ble brukt som en ROS inhibitor lagt til kulturmediet før lasting Gyp av en time. Cellen levedyktighet nedgang, intracellulær ROS generasjon,
Δψ
m tap, den kjernefysiske morfologiske endringer og cellemigrasjon hemming ble spesielt analysert som beskrevet ovenfor.
Statistical Analysis
data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av minst tre uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble utført ved enveis variansanalyse. Statistisk signifikans ble etablert på
p
. 0,05
Resultater
Effekter av Gyp på celleviabilitet
Figur 2 viser at Gyp hemmet SW-480 celleproliferasjon i en dose- og tidsavhengig måte. Levedyktighet ble betydelig redusert når Gyp dose var 70 ug /ml eller høyere (
p
0,01) og forlenget inkubasjon forbedret levedyktighet tap. IC50-verdiene var ca 91,77 og 83,8 ug /ml når cellene ble inkubert med Gyp for henholdsvis 24 og 48 timer,.
SW-480 ble sådd ut i 96-brønners plater og behandlet med 0, 70, 100 og 130 ug /ml Gyp for 24 og 48 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse. Hver verdi er uttrykt som et gjennomsnitt ± S.D. av minst tre uavhengige bestemmelser. Enveis ANOVA ble brukt for sammenligning av flere gruppeanordning, etterfulgt av Dunnetfs t-test. **
P
0,01 versus kontroll. (Feilfelt = SD, n = 3).
Gyp-indusert plasmamembran Skade av SW-480 Cells
PI farging kombinert med flowcytometri ble brukt til å evaluere Gyp-indusert cellemembranskade. I SW-480 celler, membranskade som en tidlig tilfelle av Gyp indusert celleskade (figur 3). Etter inkubering i 6 timer, prosentandelen av celler med høyere PI fluorescens gradvis økt fra 10,07% til 21,93% når cellene ble utsatt for Gyp doseområde på 70-130 ug /ml. Celler eksponert for 70 ug /ml Gyp viste ikke mye øket cellemembranskade med det forlengede inkubasjonstid. Mens celler etter 100 ug /ml og 130 ug /ml Gyp behandling ble cellemembranskade sterkt øket av den langvarige inkubasjonstid, viste omtrent 46,27% og 67,87% av celler med høy PI fluorescens ved 48 timer etter behandling, henholdsvis.
Celler ble behandlet med Gyp for 6, 12, 24 og 48 (vertikal akse) vs. PI fluorescens (horisontal akse).
Gyp-indusert Δψ
m Tap SW-480 celler
Rh123 farging kombinert med flowcytometri ble brukt til å evaluere Gyp-indusert
Δψ
m endringer. Som vist i Figur 4, viser det at Gyp indusert tap av
Δψ
m ganske tidlig og forårsaket nedgang på
Δψ
meter i en dose- og tids avhengig måte. Etter 4 timers inkubering, prosentandelen av celler med
Δψ
m tapet økte fra 9,9% til 28,8% når Gyp øket fra 70 ug /ml til 130 ug /ml. Når inkubasjonstid økt fra 4 til 8 timer, prosentandelen av celler med
Δψ
m tap økte fra 16,65% til 20,95% når Gyp var 100 mikrogram /ml.
Celler ble behandlet med Gyp til 4, 8 timer og merket med rhodamin 123 og analysert ved strømningscytometri. Histogrammene viser antall celle kanal (vertikal akse) vs. rhodamine 123 fluorescens (horisontal akse).
Gyp-indusert DNA Fragmentering av SW-480 Cells
For å bestemme DNA skade aktiviteten av Gyp, ble prosentandelen av skadede celler analysert ved anvendelse av PI-farging ved strømningscytometri, som beskrevet i fremgangsmåtene. Som vist i figur 5, Gyp-indusert DNA-fragmentering ble i en dose- og tidsavhengig måte. Ingen betydelig DNA-fragmentering ble påvist ved annen dose av Gyp etter behandling i 6 timer, mens en betydelig mengde av stor-skala DNA-fragmentering ble observert ved den høyeste dosen Gyp (100, 130 pg /ml) etter 12 timers inkubering, og DNA skader i nedre Gyp dose (70 ug /ml) behandlede celler har ikke forbedret med forlenget inkubasjonstid. Etter 48 timers inkubering, DNA-fragmentet av kontrollgruppen er 2,37%, det økte til 10,03%, 26,33% og 56,07% ved Gyp concertration var 70, 100 og 130 ug /ml, respektivt.
Celler ble behandlet med Gyp for 6, 12, 24 og 48 (vertikal akse) vs. PI fluorescens (horisontal akse).
Gyp-indusert morfologiske endringer av SW-480 Cells
Figur 6 viste resultatene av Hoechst 33342 flekker i SW-480 celler behandlet av Gyp. Svakt blå og homogen celle ble observert i kontrollgruppen. Celler i Gyp behandlede grupper viste forbedring av Hoechst 33342 farging og endring av cellemorfologi i en Gyp-dose og inkubasjon-tidsavhengig måte. Når Gyp konsentrasjonen var over 100 mikrogram /ml, ble SW-480 celler alvorlig skadet med lyse blå nukleær farging og fase bilder som er indikert celler var krympet til unormal runde typen, og celletallet ble betydelig redusert.
Celler ble behandlet med Gyp på de angitte konsentrasjoner for 6, 24, 48 «Materialer og metoder».
Påvisning av Cell apoptose ved hjelp av flowcytometri
de apoptotiske priser ble målt ved Annexin V -PE og 7-ADD flekker etter 12,24 h følgende ulike behandlinger. Fraksjonene av celler i hver kvadrant ble analysert ved hjelp av kvadrant statistikk [16]. Som vist i figur 7, prosentandelen av celler med Annexin V-positiv farging gradvis økes på en konsentrasjonsavhengig måte etter Gyp behandling, hvilket antyder at Gyp kan indusere apoptotisk respons i SW-480-celler. I ubehandlet kontrollgruppe, 94.85% celler var levedyktige, 1,45% cellepopulasjonen var i tidlig stadium av apoptose (nederst til høyre) og 2,95% cellepopulasjonen var i sent stadium av apoptose (øverst til høyre). Mens, etter 12 timers inkubering med Gyp, den apoptotisk cellepopulasjon (nederst til høyre + øverst til høyre) økte fra 25,40% til 38,70% når legemiddelkonsentrasjonen økte fra 70 ug /ml til 130 ug /ml. Når inkubasjonstiden økt fra 12 til 24 timer, økte apoptotisk cellepopulasjon fra 29,45% til 41,70% når Gyp var 100 ug /ml.
Dot plott av Annexin V og 7-AAD-opptak etter indikerte konsentrasjoner i SW-480 celler. Cellene ble analysert på 12, 24 timer etter behandling.
Gyp hemmet Migrering av SW-480 In vitro
For ytterligere å bekrefte den hemmende effekten av Gyp på SW-480 cellemigrasjon, en sårtilheling assay ble utført (figur 8). Sårhelingsprosessen evnen til cellene gjenspeiler deres bevegelse og migrering på overflaten som de er forankret til for vekst. Sammenlignet med 0-t etter såret, etter 24 timer inkubering, meget tette celler i kontrollen gradvis økte til mellomrommet over såret, celler i 70 ug /ml Gyp-behandlede gruppe viste liten forskjell med kontroll forskjell med kontroll, mens celler i 100 ug /ml og 130 ug /ml Gyp-behandlede grupper sjelden vokste til mellomrommet over såret, og celletettheten ble alvorlig nedsatt.
celler i 24-brønners plater ble såret ved å skrape med en pipettespiss og cellene ble inkubert med Gyp i 24 timer. Cellene ble fotografert under fase-kontrastmikroskopi (x 200 forstørrelse).
fila Analyse
Det er vel etablert at cytoskjelett-elementer var nær knyttet til cellebevegelse [17], [ ,,,0],18]. Endringene av F-aktin microfilaments organisasjon i SW-480 celler etter Gyp behandlet ble undersøkt ved fluorescens mikroskopi ved hjelp av FITC-merket phalloidin toksin. Som vist i figur 9, kontrollceller viste en regelmessig rekke av definerte actin filamenter er tilstede langs cellene, jevnt fordelt i cytoplasma, mens celler i 100 ug /ml Gyp viste en uorden av actin filamenter, en økning av aktin Stree fibre og grønn fluorescens flekker ble observert. Celler behandlet med 130 mikrogram /ml Gyp demonstrert en absolutt skade av aktin nettverk og fullstendig bortfall av actin filamenter.
Celler ble farget med phalloidin (grønn) for F-aktin. Skala barer, 10 mikrometer.
SEM Observation
ble observert morfologiske endringer i henhold SEM (figur 10). I kontrollgruppen ble cellene først epitelial i form med tallrike mikrovilli over overflaten av cellen. Mens i 70 ug /ml,-celler viste en signifikant reduksjon i antall mikrovilli, overflaten av mange celler å bli forholdsvis glatt uten noen åpenbar mikrovilli. Når Gyp-dosen var over 100 pg /ml, ble SW-480-celler alvorlig skadet med tydelig deformasjon, krympede til unormal rund typen, og celletallet ble betydelig redusert. Mens i 130 ug /ml, ble enkelte papillous fremspring observert på overflaten av cellene hvor cytoplasmaet syntes å ha ekstrudert gjennom membranen grense.
Forstørrelse av bildene var 1500 og 5000 x, henholdsvis. Skala barer:. 30, 10 mikrometer
ROS involvert i Gyp-indusert SW-480 Cytotoksisitet
Den intracellulære ROS produksjonen ble analysert ved flowcytometri med DCFH-DA farging. Dataene vist i Figur 11 antyder det intracellulære ROS-nivåene ble øket etter Gyp behandling, ved 4 timer etter behandling, var omtrent 13,97%, 21% og 13,07% av celler i 70, 100 og 130 ug /ml Gyp behandlede grupper viste lyse DCF fluorescens, mens bare 5,43% av cellene i kontrollgruppen viste lyse DCF fluorescens. Når inkubasjonstiden økte fra 4 til 8 timer, prosentandelen av celler med lys DCF fluorescens øket til 29,77%, 35,97% og 33,43% ved Gyp var 70, 100 og 130 ug /ml, henholdsvis. Vi fant ROS generasjon ble først økte med økende Gyp konsentrasjon og deretter litt redusert på mye høyere Gyp dose, noe som kan skyldes flere cellelyse forårsaket av Gyp behandling ved høyere medikamentkonsentrasjon.
Celler ble behandlet med Gyp for 4, 8-DA og fluorescensintensiteten av det oksyderte produkt DCF i individuelle celler ble detektert ved strømningscytometri. Prosentandelen av fluorescerende celler i hver gruppe ble vist.
For ytterligere å undersøke om intracellulær ROS høyde var involvert i Gyp-indusert celledød, vi utførte påfølgende analyser. Resultatet i Figur 12A viser at redusert celleviabilitet forårsaket av Gyp var sterkt reddet av NAC (
p
0,05). I tillegg Gyp forårsaket intracellulære ROS generasjon, kromatin kondensering og cellevandring inhibering ble alle synlig forhindret av NAC (figur 12B-D). Men den reduserte
Δψ
M forårsaket av Gyp ble ikke hindret av NAC (figur 12E). Disse resultatene indikerer at ROS var involvert i Gyp-indusert skade i SW-480 celler og
Δψ
m tap kan være en viktig oppstrøms aktivator av ROS generasjon, og den økte ROS kan bli stimulert av skadede mitokondrier.
(A) Celleviabilitet, (B) intracellulær ROS generasjon, (C) atom morfologiske endringer, (D) cellemigrasjon, (E)
Δψ
m tap ble spesielt analysert som beskrevet i «Materialer og metoder».
Diskusjoner
Kreft er en kompleks sykdom, og de tradisjonelle kreft terapi har ikke kommet betydelig de siste årene. De viktigste begrensningene i kirurgi, cellegift og strålebehandling er at de forårsake alvorlige bivirkninger og dårlig prognose på grunn av toksisitet av ikke-kreftvev og chemoresistance [19]. Imidlertid har naturmedisin vakte stor bekymring i området av kreft kjemoterapi på grunn av sikkerhet, effekt og anti-multiresistens.
Gyp har vært brukt som tradisjonell kinesisk urtemedisin i hundrevis av år på grunn av sitt brede utvalg av helse fordelene [20] – [22]. I den foreliggende undersøkelse, Gyp-indusert apoptose i humane kolorektal cancer SW-480-celler ble undersøkt.
Resultatene viste at Gyp reduserte prosenten av levedyktige celler i SW-480-celler. I mellomtiden har tidligere undersøkelser vist at den cytotoksiske effekt av Gyp på normale PBMC-celler var mye mindre [23]. Resultatene tyder på at Gyp er istand til å utøve forskjellige alternative cytotoksisitet i kreftceller og normale celler, noe som kan være potensielt anvendelige som et forebyggende kreft eller behandlingsmiddel.
Cellelinjen SW-480, etablert fra den primære adenokarsinom som oppstår i tykktarmen, var Duck etappe B (Dukes «B betyr at kreften har vokst gjennom muskelen laget i tykktarmen eller endetarmen, invaderte gjennom bolle veggen, men lymfeknuter klare) [24]. Spread er gjennom lokal invasjon gjennom bollen veggen og via lokale lymfekar, blod (portal vene i leveren) og transcoelomic. Derfor er metastasering av en av de største utfordringer for en vellykket behandling av kreft [25] og forebygging av kreftmetastase er like viktig mål for forbedring av en pasients prognose. I denne studien undersøkte vi hvorvidt Gyp kunne hemme migrering av SW-480-celler. Resultatene i figur 8 antydet Gyp inhiberte migrering av celletype i et Gyp doseavhengig måte. Aktin cytoskjelettet er et strukturelt nettverk av proteiner som er nødvendig for flere biologiske funksjoner, inkludert celle sammentrekning, celle motilitet og vesikkel-handel et al [26], [27]. Endringene i cellulære avdelinger kan påvirke dynamikken i celleadhesjon [18]. Figur 9 eksponert endringer av fila, uordnede arrangement av F-aktin og fullstendig bortfall av fila nettverk ble observert i 100, 130 mikrogram /ml Gyp. Dessuten, som vist i figur 10, er antallet mikrovilli ble signifikant redusert når Gyp-dosen var 70 ug /ml eller høyere. Resultatene antyder Gyp indusere fila nettverk kollaps, og til slutt, skade på celleformen og migrering evne.
Apoptose spiller en viktig rolle i homeostase og kan induseres og reguleres av mange signalveier stimulerings [28], [29 ]. Feilregulering av apoptose er ansett som en stor kreft kjennetegn, slik at apoptoseinduksjon er uten tvil den mest potente forsvaret mot kreft [30], [31]. Mange studier har vist at forskjellige forbindelser utvunnet fra planter kunne indusere apoptose i mange kreftceller [29], [32], [33]. DNA-fragmentering og noen morfologiske egenskaper, inkludert membran blebbing, cellekrymping, kromatin kondensering og dannelse av apoptotiske legemer er typisk biokjemisk funksjon av apoptose [34], [35]. I foreliggende studie, Gyp var i stand til å forårsake innlysende DNA-fragmentering i SW-480 celler i en dose- og tidsavhengig måte. Dessuten vises Hoechst 33342 farging analysen noen morfologiske egenskaper etter Gyp behandling for eksempel celle svinn, kromatin kondens med margination av kromatin til kjernemembranen og fragmentert punktat blå atom fluorescens i SW-480 celler. Til slutt, figur 7 foreslå Gyp kunne gi en betydelig øke apoptotiske celler og redusere levedyktige celler, indikerer apoptotisk respons ble markert forsterkes etter Gyp i SW-480 celler. Derfor tyder resultatene på Gyp kan indusere apoptose i SW480 celler.
skade av cellemembranen systemet vil føre membran depolarisering, disturbe asymmetri av membranens lipider, indusere hemming av membran enzymer, føre mistet av plasmamembran integritet [36 ], og disse cellulære funksjoner etter hvert kan indusere celle apoptose ved engasjement av døds reseptorer [37]. Farging med PI og analysert ved flowcytometri viste at Gyp forårsaket cellemembranen skade var en tidlig hendelse. Vi spekulere at mekanismen for Jiaogulan i plasmamembranskade kanskje på grunn av aglycones av Jiaogulan [38] har dets virknings på cellemembranen, for derved å skade cellemembranen eller inn celler for å forebygge tumorvekst.
mitokondrier spiller en viktig rolle i progresjon av apoptose [39]. Derfor mitokondrier membranpotensiale endringer etter forskjellig konsentrasjon av Gyp behandling i SW-480 celler ble målt. I studien, nedgangen av
Δψ
m var på tidlig 4 timer etter Gyp behandling og forbedret ved å øke konsentrasjonen av Gyp, noe som tyder Gyp indusert celle apoptose i SW-480 celler kan være mitokondrier avhengige.
Dessuten Forbedring av ROS produksjonen har vært forbundet med apoptotisk respons indusert av flere pro-apoptotiske forbindelser [40]. Våre resultater viste Gyp behandling betydelig stimulert ROS generasjon i SW-480 celler. NAC, en scavenger av ROS, ble benyttet for å bekrefte effekten av ROS etter Gyp behandling. NAC betydelig reddet Gyp indusert SW-480 cytotoksisitet, intracellulær ROS generasjon atom morfologiske endringer og cellemigrasjon hemming, men ikke
Δψ
m nedgang, noe som tyder på ROS spilt en viktig rolle i Gyp indusert SW-480 celle toksisitet og celle apoptose, og ROS generasjon var nedstrøms mitokondrier skade post Gyp behandling, og den økte ROS produksjonen kan stimulere av de skadede mitokondrier i vårt eksperimentelle system.
i konklusjonen, denne studien evaluerte cytotoksisitet av Gyp i SW-480 celler, viste at Gyp kan føre til cellemembran integritet skade, redusere
Δψ
m nivå, indusere DNA-fragmentering og initiere apoptotisk respons i SW-480 celler. ROS generert på SW-480-celler spiller en viktig rolle i Gyp-indusert celledød. Og, er det spekulert i at Gyp indusert celle apoptose i SW-480 celler kan være død reseptorer sti og mitokondrier avhengige. I tillegg vår studie viste også at Gyp kunne utøve en hemmende effekt på cellemigrasjon
in vitro Hotell og alvorlig fila nettverk kollaps samt betydelig reduksjon i antall microvilli. Disse resultatene tyder på Gyp indusere fila nettverk kollaps og skade cellen form og migrasjon evne. Disse studiene tyder Gyp kan ha stor verdi i menneskelige kolorektal kreft behandlinger. Ytterligere undersøkelser er nødvendig for å forklare de molekylære mekanismer for Gyp i kreftterapi.
