Abstract
Bakgrunn
Genomisk avvik er et felles trekk ved kreft hos mennesker, og også er en av de grunnleggende mekanismer som fører til overekspresjon av onkogener og underexpression av tumorsuppressorgener. Vår studie tar sikte på å identifisere hyppige genomisk endringer i bukspyttkjertelkreft.
Materialer og metoder
Vi brukte rekke komparativ genomisk hybridisering (matrise CGH) for å identifisere tilbakevendende genomiske forandringer og validert protein uttrykk av utvalgte gener ved immunhistokjemi.
Resultater
Seksten gevinster og trettito tap skjedde i mer enn 30% og 60% av svulstene, henholdsvis. Høyt nivå presiseringer på 7q21.3-q22.1 og 19q13.2 og homozygot slettinger på 1p33-p32.3, 1p22.1, 1q22, 3q27.2, 6p22.3, 6p21.31, 12q13.2, 17p13. 2, 17q21.31 og 22q13.1 ble identifisert. Spesielt, forsterkning av akt2 ble påvist i to karsinomer og homozygot sletting av CDKN2C i to andre tilfeller. I 15 uavhengige valideringsprøver, fant vi at akt2 (19q13.2) og MCM7 (7q22.1) ble forsterket i 6 og 9 tilfeller, og CAMTA2 (17p13.2) og PFN1 (17p13.2) ble homozygously slettet i tre og 1 saker. Akt2 og MCM7 ble overuttrykt, og CAMTA2 og PFN1 ble underexpressed i kreft i bukspyttkjertelen vev enn i morfologisk normale operative margin vev. Både GISTIC og Genomisk Workbench programvare identifisert 22q13.1 inneholder APOBEC3A og APOBEC3B som eneste homozygot delesjon regionen. Og uttrykket nivåer av APOBEC3A og APOBEC3B var betydelig lavere i tumorvev enn i morfologisk normale operative margin vev. Ytterligere bekreftelse viste at overekspresjon av PSCA var signifikant assosiert med lymfeknutemetastase, og overekspresjon av HMGA2 var signifikant assosiert med invasiv dybde av kreft i bukspyttkjertelen.
Konklusjon
Disse tilbakevendende genomiske forandringer kan være nyttig for avsløre mekanismen av bukspyttkjertelen kreftutvikling og gi kandidat biomarkører
Citation. Liang JW, Shi ZZ, Shen TY, Che X, Wang Z, Shi SS, et al. (2014) Identifisering av Genomisk Endringer i bukspyttkjertelkreft ved hjelp av Array-basert Comparative Genomisk Hybridisering. PLoS ONE 9 (12): e114616. doi: 10,1371 /journal.pone.0114616
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 16 juli 2014; Godkjent: 12 november 2014; Publisert: 11.12.2014
Copyright: © 2014 Liang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Science and Technology Major Prosjekt of China (2012ZX09506001, 2011YQ17006710), og Natural Science Foundation National of China (81241086), og Yunnan Provincial Research Foundation for Basic Research, Kina (Grant No. 2013FD012). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Bakgrunn
kreft i bukspyttkjertelen er en av de mest malignent kreft i verden med en 5-års overlevelse på under 5% [1]. Opp til nå, er det ikke konvensjonell behandling med en betydelig innvirkning på i løpet av kreft i bukspyttkjertelen, slik at prognosen for pasienter fortsatt dårlig. Derfor identifisering av molekylære endringer bak denne kreft vil legge grunnlaget for bedre klinisk ledelse og utfall.
Genomisk ustabilitet er et karakteristisk trekk ved nesten humane tumorer [2]. Kopitallet endringer er ofte funnet i kreftformer, og antas å bidra til initiering og progresjon av tumorer ved amplifisering og aktivering av onkogener eller delesjon-indusert down-ekspresjon av tumorsuppressorgener. Flere tidligere studier har identifisert noen tilbakevendende kromosom endringer i pacreatic kreft, for eksempel gevinster på 1Q, kromosomer 2, 3 og 5, 7 p, 8Q, 11q, 12p, 14q, VED BETJENING 17Q, 19q og 20Q, tap på kromosomene 1P, 3P, 6 , 8p, 9p, 10Q, 13q, 14q, 15Q, 17p og 18q, og amplifikasjoner av FGFR1, HER2 og DcR3 [3], [4], [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. Imidlertid er den tilgjengelige informasjonen fortsatt begrenset, spesielt for kinesisk kreft i bukspyttkjertelen.
Denne studien identifisert vanlige gevinster, tap, presiseringer og homozygot slettinger i bukspyttkjertelkreft. Vi evaluerte ytterligere protein uttrykk nivået på kopitall-økt gener HMGA2 og PSCA.
Materialer og Metoder
Studiedesign
Først, genetiske avvik i bukspyttkjertelen karsinom var oppdages ved hjelp av Agilent 44K human Genome CGH microarray og vanlige genomiske endringer ble identifisert. Deretter validert vi protein uttrykk for HMGA2 og PSCA som var plassert i felles aberrasjon kromosom regioner i pancreactic kreft.
Pasienter og Prøver
Fersk resected vev fra 93 bukspyttkjertelkreft pasienter ble samlet inn av Avdeling for patologi, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, Kina fra 2006 til 2008. Alle bukspyttkjertelkreft pasienter ble behandlet med radikal operasjon, og ingen av dem fikk noen behandling før operasjonen. Representative tumor områder ble skåret ut av erfarne patologer og umiddelbart lagret ved -70 ° C inntil anvendelse. Alle prøvene anvendt i denne studien var restprøver etter diagnose prøvetaking. Hver pasient inngått separate informerte samtykke former for prøvetaking og molekylær analyse. Kliniske kjennetegn ved pasientene som brukes i rekken CGH studien er vist i tabell 1. Denne studien ble godkjent av etikkomiteen of Cancer Institute og sykehus, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences (No. NCC2013B-30).
Genomisk DNA Extraction
Genomisk DNA ble isolert fra tumorvev ved hjelp av Qiagen DNeasy Blood Tissue Kit som beskrevet av produsenten (Qiagen, Hilden, Tyskland). Tumor celleinnholdet av alle prøvene var større enn 50% av HE farging.
Array-basert CGH
Array CGH eksperimenter ble utført ved hjelp av standard Agilent protokoller (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) . Kommersiell humant genomisk DNA (Promega, Warrington, Storbritannia) ble anvendt som referanse. For hver CGH hybridisering, ble 500 ng av referanse genomisk DNA og den samme mengde av tumor-DNA spaltet med Alu I og RSA-restriksjonsenzym (Promega, Warrington, Storbritannia). Det fordøyde referanse DNA-fragmenter ble merket med cyanin-3-dUTP og tumor-DNA med cyanin-5 dUTP (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Etter opprydding, ble referanse og svulst DNA-prober blandet og hybridisert på Agilent 44K menneskelige genom CGH mikromatriser (Agilent) i 40 timer. Vasking, skanning og data utvinning prosedyrer ble utført følgende standardprotokoller.
Mikromatrise Data Analysis
Microarray data ble analysert ved hjelp av Agilent Genomisk Workbench (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) og BRB-arraytools ( https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html). Agilent Genomisk Workbench ble brukt til å beregne log
2
ratio for hver sonde og identifisere genomiske avvik. Midlere log
2
forhold på alle probene i et kromosom område mellom 0,25 og 0,75 ble klassifisert som genomisk vinning, 0,75 så høyt nivå DNA-amplifikasjon, -0,25 som hemizygous tap, og mindre enn -0,75 som homozygot delesjon. I pathway berikelse analyse, er p-verdien beregnes for hver bane basert på null fordeling oppnås ved en 1000-tiden tilfeldig utvalgsmetode.
Real-time PCR
PCR reaksjoner ble utført i et totalvolum på 20 ul, inkludert 10 ul av 2XPower SYBR grønn PCR Master mix (Applied Biosystems, Warrington, UK), 2 pl av cDNA /genomisk DNA (5 ng /mL) og 1 ul av primerblanding (10 pM hver ). PCR-amplifisering og påvisning ble utført i ABI 7300 (Applied Biosystems, Warrington, Storbritannia) som følger: en innledende denaturering ved 95 ° C i 10 min; 45 sykluser med 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Den relative genekspresjon eller relativ kopiantallet av mål-genet ble beregnet ved hjelp av sammenlignende CT Fremgangsmåte ved normalisert til en endogen GAPDH. Den i forhold til kalibratoren ble gitt ved formelen 2
-ΔΔCt. ΔCT ble beregnet ved å subtrahere den gjennomsnittlige GAPDH CT fra gjennomsnittet CT av genet av interesse. Forholdet definerer nivået for relative uttrykk eller relativ kopiantallet av målgenet som for GAPDH. 2
-ΔΔCt 2,0 ble satt for et mål forsterkning, og to
-ΔΔCt. 0,25 ble satt for et mål homozygot delesjon
Immunhistokjemisk farging
formalinfiksert, ble parafininnstøpte pankreastumorer plassert på vevet microarray. For hvert tilfelle ble kreftvev ble gjentatt tre ganger, og tilstøtende morfologisk normalt vev for to ganger. Glassene ble deparaffinized, rehydrert, neddykket i 3% hydrogenperoksydoppløsning i 10 min, oppvarmet i citrat-buffer (pH 6) i 25 minutter ved 95 ° C og avkjølt i 60 minutter ved romtemperatur. Platene ble blokkert med 10% normalt geiteserum i 30 minutter ved 37 ° C og deretter inkubert med muse-monoklonalt antistoff mot HMGA2 (Abcam, Cambridge, MA) og kanin-polyklonalt antistoff mot PSCA (Abcam, Cambridge, MA) over natten ved 4 ° C. Etter å ha blitt vasket med PBS, ble platene inkubert med biotinylert sekundært antistoff (fortynnet 1:100) i 30 minutter ved 37 ° C, etterfulgt av streptavidin-peroksidase (1:100 fortynning) inkubering i 30 minutter ved 37 ° C. Immunolabeling ble visualisert med en blanding av 3,3′-diaminobenzidin-løsning. Kontra ble gjennomført med hematoksylin.
Expression nivået ble fastsatt på basis av fargeintensitet og prosentandel av immunreaktive celler. Negativ uttrykket (poengsum = 0) ble ingen eller svak farging, eller moderat til sterk farging i 25% av cellene. Svak uttrykket (poengsum = 1) var en moderat eller sterk farging i 25% til 50% av cellene. Og sterkt uttrykk (poengsum = 2) var . 50% av cellene med sterk farging
Statistical Analysis
t-test og Chi-kvadrat test ble utført med den statistiske programvaren SPSS 15.0 . Forskjellene ble bedømt som statistisk signifikant når den tilsvarende tosidig
P
verdien var. 0,05
Resultater
gevinster og tap i bukspyttkjertelen karsinom oppdaget av Array CGH
Femten prøver av bukspyttkjertelkreft ble analysert i denne studien, og alle av dem hadde genomiske forandringer (område: 1 til 387). Seksten gevinster og trettito tap ofte ble oppdaget (frekvens på gevinst 30%, og tap 60%). De mest hyppige gevinster var 8p23.3 (41,7%), 1q44 (40%), 14q32.33 (40%), 19q13.43 (36,7%), 1q21.3 (36%) og 5q31.1-q31.2 (35,6%), og de fleste vanlige tap var 11p15.4 (70,7%), 15q15.1-q21.1 (70%), 3p21.31 (68,9%), 17p13.3-p13.2 (66,7%), 19p13.3-p13.2 (66,7%), 5p13.3 (63,3%), 11p11.2 (63,3%) og 19p13.3-p13.11 (63,3%). GISTIC analyse viste at kopiantall reduksjon av APOBEC3A (22q13.1) og APOBEC3B (22q13.1) var signifikant (fig. 1 og Tabell 2).
A. Genome-wide frekvens tomt på bukspyttkjertelkreft ved matrise CGH analyse. Linje på høyre side av 0% -aksen, vinning; linje til venstre på 0% -aksen, tap. B. Tall avvik i kreft i bukspyttkjertelen. X antall avvik; Y, antall tilfeller. C. Gevinst og tap (HDS) identifisert av GISTIC.
Amplifikasjoner og Homozygot slettinger i bukspyttkjertelen karsinom oppdaget av Array CGH
Høyt nivå presiseringer ble oppdaget to kromosom regioner, inkludert 7q21.3-q22.1 og 19q13.2. Homozygot slettinger ble identifisert i 1p33-p32.3, 1p22.1, 1q22, 3q27.2, 6p22.3, 6p21.31, 12q13.2, 17p13.2, 17q21.31 og 22q13.1 (tabell 3). Spesielt ble kreft genet akt2 (19q13.2) forsterkes i to karsinomer, og CDKN2C (1p33) ble homozygously slettet i to andre tilfeller. (Fig. 2). Ved å søke på COSMIC databasen, fant vi at forsterkningen av akt2 var assosiert med økt sentitivity til stoffet Z-LLNIe-CHO. Mer interessant, var homozygot sletting av 22q13.1 inneholder APOBEC3A og APOBEC3B identifisert i både GISTIC og Agilent Genomisk Workbench analyse (Fig. 3).
A. forsterkning av akt2. B. homozygot sletting av CDKN2C. Pilene angir posisjonen akt2 og CDKN2C.
Cycles representerer sondene av APOBEC3A og APOBEC3B.
Vi videre valgt de forsterkede gener akt2 (19q13.2 ) og MCM7 (7q22.1) og homozygot slettet gener CAMTA2 (17p13.2) og PFN1 (17p13.2) for validering av real-time PCR. I 15 uavhengige valideringsprøvene, ble presiseringer av akt2 og MCM7 påvist i 6 og 9 tilfeller, og homozygot sletting av CAMTA2 og PFN1d i 3 og 1 tilfeller, henholdsvis (fig. 4A og 4B). Akt2 og MCM7 ble overuttrykt, og CAMTA2 og PFN1 ble underexpressed i kreft i bukspyttkjertelen vev enn i morfologisk normale operative margin vev (Fig. 5A og 5B).
A. amplication av akt2 og MCM7. B. homozygot sletting av CAMTA2 og PFN1. C. homozygot sletting av APOBEC3A og APOBEC3B. Ratio = (Kopier antall kandidat genet i tumorvev) /(Kopier antall kandidat genet i kommersielle humant genomisk DNA).
A. Overekspresjon av akt2 og MCM7. B. Underexpression av CAMTA2 og PFN1. C. Underexpression av APOBEC3A og APOBEC3B.
I uavhengige valideringsprøvene, APOBEC3A og APOBEC3B ble homozygot slettet i 3 og 4 svulster, henholdsvis (fig. 4C). De mRNA uttrykk nivåer av APOBEC3A og APOBEC3B i tumorvev var betydelig lavere enn i morfologisk normale operative margin vev (Fig. 5C)
Pathways Beriket for Kopier nummer Endringer
Pathway berikelse analyse ved hjelp KEGG database ble anvendt på CGH dataene. Vi fant at to veier beriket i gener med gevinst, og at seks baner beriket i gener med tap. De genomiske gevinster i bukspyttkjertelen karsinom endret trasé av gamma-heksaklorsykloheksan nedbrytning og oksidativ fosforylering. Men cyanoamino acid metabolism, glutation metabolisme, atrazin degradering, taurin og hypotaurin metabolisme, arakidonsyre metabolisme og Parkinsons sykdom trasé ble endret av genomiske tap (Tabell 4).
Validering av HMGA2 og PSCA i bukspyttkjertel~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP bruker Immunohistochemistry
Kopier nummer økning på HMGA2 og PSCA ble oppdaget i ett og fire svulst, henholdsvis. På grunn av deres betydelige rolle i tumorgenese [10], [11], [12], [13], analyserte vi protein ekspresjon av HMGA2 og PSCA ved hjelp av immunhistokjemi (IHC). Resultatene viste at overekspresjon av HMGA2 og PSCA ble påvist i 76,7% og 65,0% av bukspyttkjertelen kreftpasienter, henholdsvis (fig. 6). Videre overekspresjon av PSCA var signifikant assosiert med lymfeknutemetastaser (tabell 5), og overekspresjon av HMGA2 var signifikant assosiert med invasiv dybde av kreft i bukspyttkjertelen (tabell 6).
A. Sterk og negative uttrykk for HMGA2. B. Sterk og negative uttrykk for PSCA.
Diskusjoner
Genomisk avvik kan bidra til kreftutvikling og tumorprogresjon. For å identifisere DNA kopi nummer endringer i kreft i bukspyttkjertelen, utførte vi matrise-basert komparativ genomisk hybridisering og fant at seksten gevinster med frekvens over 30% og trettito tap over 60%, med to høyt nivå presiseringer på 7q21.3- q22.1 og 19q13.2 og ti homozygot slettinger på 1p33-p32.3, 1p22.1, 1q22, 3q27.2, 6p22.3, 6p21.31, 12q13.2, 17p13.2, 17q21.31 og 22q13. 1. Ved å sammenligne våre resultater med CGH data presentert i progenetix nettside [14], [15], fant vi at de fleste genomiske avvik var konsekvent. Men det var fortsatt noen forskjeller. For eksempel tap av 9p var hyppigere enn tap av 9q i progenetix data, men hyppigheten av 9q tap var høyere enn 9p tap i vår studie. Gevinsten av kromosom 7 var svært vanlig i progenetix data, men tapet av dette kromosomet var hyppigere i våre data.
Det bemerkelsesverdige var kreft genet akt2 forsterket i to bukspyttkjertelen kreftpasienter og kreft genet CDKN2C ble homozygously slettet i to andre tilfeller. Vi validert forsterkning av akt2 og MCM7 (7q22.1) og homozygot sletting av CAMTA2 (17p13.2) og PFN1 (17p13.2) i kreft i bukspyttkjertelen, og videre funnet at akt2 og MCM7 ble overuttrykt, og CAMTA2 og PFN1 ble underexpressed i bukspyttkjertelkreft, sammenlignet med de i morfologisk normale operative margin vev. Disse resultatene antydet at gener inkludert akt2, MCM7, CAMTA2 og PFN1 kan spille viktige roller i kreft i bukspyttkjertelen. Homozygot delesjon av CDKN2C har blitt funnet i myelom, og kopiantall reduksjon av CDKN2C var signifikant assosiert med en dårligere total overlevelse [16], [17], [18]. Men det var fortsatt lite informasjon om rollen til CDKN2C i bukspyttkjertelkreft. Når det gjelder endring av akt2 i menneskelige kreftformer, Miwa et al. har rapportert forsterkning av akt2 var i 3 av 12 bukspyttkjertelkreft cellelinjer og i 3 av 20 primær bukspyttkjertelen karsinom. Overekspresjon av akt2 ble også påvist i de 3 cellelinjer med forsterket akt2 [19]. Oppreguleringen av akt2 ble korrelert med prognose [20]. Tanno et al. fant at aktiv AKT fremmet invasivitet av kreft i bukspyttkjertelen celler gjennom opptil regulerende IGF-IR uttrykk [21]. RNAi samtidig målrette akt2 og K-ras kan inhibite bukspyttkjerteltumorvekst [22]. Chen et al. viste at akt2 hemming kan oppheve gemcitabin-indusert aktivering av akt2 og NF-kB, og fremme gemcitabin-indusert PUMA oppregulering, noe som resulterer i chemosensitization av pankreastumorer til gencitabine [23]. Våre resultater ytterligere bekreftet forsterkningen av akt2 i bukspyttkjertelkreft. Ved å søke på COSMIC databasen, fant vi også at forsterkningen av akt2 var assosiert med økt sentitivity til stoffet Z-LLNIe-CHO. Alle disse resultatene antydet at forsterkningen av akt2 kanskje utvikle seg til en biomarkør for å dele bukspyttkjertelen kreftpasienter i ulike undergrupper for å søke alternativ behandling strategi. Og i fremtiden, om stoffet Z-LLNIe-CHO kunne brukes til å behandle kreft i bukspyttkjertelen pasienter med akt2 forsterkning bør studeres.
Det er interessant både GISTIC og Genomisk Workbench programvare identifisert 22q13.1 (som inneholder APOBEC3A og APOBEC3B) som homozygot delesjon regionen. Real-time PCR-analyse viste at APOBEC3A og APOBEC3B ble underexpressed i kreft i bukspyttkjertelen vev enn i morfologisk normale operative margin vev. APOBEC enzymer fungere i medfødte immunreaksjoner, inkludert de som er rettet mot retrovirus, noe som tyder på koblinger mellom immunitet, mutagenese og virusinfeksjon i ferd med kreftutvikling. APOBEC3A kunne forårsake hypermutasjon av genomisk DNA og DNA-dobbeltstrengbrudd, og kata overgangen fra en frisk til en cancer-genomet [24], [25]. Pham et al. rapporterte at APOBEC3A ble uttrykt i keratinocytter, og oppregulert i hudkreft [26]. APOBEC3B ble overuttrykt i et flertall av eggstokkreft cellelinjer og høy klasse primære eggstokkreft. Improtantly APOBEC3B uttrykk ble korrelert med total mutaion belastning samt forhøyede nivåer av transversjon mutasjoner [27]. Harris et al. rapportert at APOBEC3B sto for opp til halvparten av mutasjons belastning i bryst karsinom uttrykker dette enzymet [28]. Med andre kreftformer, inkludert blære, cervix, lunger og hode og hals, ble APOBEC3B også oppregulert og dens foretrukne target-sekvensen ble mutert hyppig og gruppert [29]. Sletting av APOBEC3B dempes HBV-clearance, og resulterte i HBV-infeksjon og økt risiko for å utvikle leverkreft [30]. Sletting av APOBEC3 var også assosiert med risiko for brystkreft blant kvinner i europeisk opphav [31]. Homozygot sletting av APOBEC3B var signifikant assosiert med ugunstige utfall for HIV-1 erverv og progresjon til AIDS [32]. Det vil være interessant å undersøke hvilken rolle homozygot sletting av APOBEC3A og APOBEC3B i bukspyttkjertelen kreftutvikling.
HMGA2 og PSCA har blitt rapportert å være assosiert med kreft i bukspyttkjertelen. Piscuoglio et al. viste at prosentandelen av tumorceller med HMGA2 og HMGA1 atom immunoreaktivitet positivt korrelert med økende malignitet karakter og lymfeknutemetastase [33], [34]. Og HMGA2 opprettholdt onkogene RAS-indusert epitelial-mesenchymale overgang i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler [35]. Vår studie viste at gevinster av HMGA2 og PSCA ble påvist i ett og fire bukspyttkjertelen karsinom, henholdsvis. I IHC analysen ble overekspresjon av HMGA2 påvist i 76,7% og den for PSCA i 65,0% av tumorer. Og overekspresjon av PSCA var signifikant assosiert med lymfeknutemetastaser, og overekspresjon av HMGA2 var signifikant assosiert med invasiv dybde for kreft i bukspyttkjertelen.
Totalt vår studie identifisert flere kopitall-endret kromosom regioner i bukspyttkjertelkreft. Disse funnene gir viktig innsikt i de molekylære endringer assosiert med bukspyttkjertelen tumorigenesis. Videre studier bør gjennomføres for å utforske mulige tumorigene rollene til disse kopiantallet endret gener.
