Abstract
flavonoider og flavonoid derivater, som har betydelige biologiske og farmakologiske aktiviteter, inkludert antitumor- og anti-inflammatorisk aktivitet, har blitt mye brukt i human helse. Å utforme en mer effektiv flavonoid antitumormiddel, endret vi flavonoid ryggraden med erstatninger av piperazin og metoksygrupper å syntetisere en roman flavonoid derivat, LZ-207. Anticancer virkning av LZ-207 mot HCT116 kolon kreftceller og den underliggende mekanisme av denne virkning ble undersøkt i dette studiet. Nærmere bestemt, LZ-207 oppviste hemmende effekt på vekst og levedyktighet i flere humane kolonkreftcellelinjer, og induserte apoptose i HCT116-celler både in vitro og in vivo. LZ-207 behandling også undertrykkes den nukleære translokasjon av NF-kB og fosforylering av IicB og IKKα /β på en doseavhengig måte både i HCT116-celler og humane akutt monocytisk leukemi THP-1-celler. Videre har LZ-207 også redusert sekresjon av det pro-inflammatoriske cytokin interleukin-6 (IL-6) i LPS-induserte THP-1-celler, og denne effekten ble bekreftet på transkripsjonsnivået. Videre er LZ-207 hemmet signifikant HCT116-celleformering som ble fremkalt av LPS-induserte THP-1-celler i en ko-kultur-system. Disse funnene belyst noen potensielle molekylære mekanismene for å forebygge betennelse drevet tykktarmskreft ved hjelp av den nylig syntetisert flavonoid LZ-207 og antydet muligheten for å videreutvikle nye terapeutiske midler som stammer fra flavonoider
Citation. Sun J, Li F, Zhao Y, Zhao L, Qiao C, Li Z, et al. (2015) LZ-207, en nylig syntetiserte flavonoid, induserer apoptose og undertrykker inflammasjonsrelaterte Colon Cancer ved å hemme NF-kB signalveien. PLoS ONE 10 (5): e0127282. doi: 10,1371 /journal.pone.0127282
Academic Redaktør: Dominique Delmas, UMR INSERM U866, FRANCE
mottatt: 10 desember 2014; Godkjent: 13 april 2015; Publisert: 29. mai 2015
Copyright: © 2015 Sun et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Science Teknologi Major Project (No.2012ZX09304-001), Project Program of State Key Laboratory of Natural Medicines, Kina Pharmaceutical University (No. JKGZ201101, SKLNMZZ201210, SKLNMZZCX201303 og SKLNMZZJQ201302, G140042), Program for Changjiang Scholars og Innovativ Research Team i Universitets (IRT1193), Natural Science Foundation of China (nr 91029744)
konkurrerende interesser National:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hver år, mer enn 600.000 mennesker dør av tykktarmskreft (CRC) og 1,25 millioner mennesker er diagnostisert med denne sykdommen. Kirurgisk fjerning av kreft ved operasjonen er den tradisjonelle terapi for alle stadier av CRC; Men mange pasienter har unresectable svulster og gå på å utvikle metastaser [1]. Derfor er nye terapeutiske midler for behandling av CRC presserende behov
Samler bevis har vist at betennelse er en kritisk komponent for tumorprogresjon [2].; områder av infeksjon, kronisk irritasjon og betennelse kan være høyrisikoområder for å utvikle seg til kreft. Den nære sammenhengen mellom inflammatoriske tarmsykdommer (IBDs) og tykktarmskreft har blitt foreslått siden 1925 og er fortsatt en kraftig sak å bevise sammenhengen mellom betennelse og kreft [3, 4]. Tidligere studier har rapportert at proinflammatoriske faktorer av den medfødte og ervervede immunforsvar, inkludert IL-6 [5] og TNF-α [6], kan bidra til utvikling og vekst av kolon neoplasi. NF-kB, som er en av mange nedstrøms mål for en TNF-reseptor-aktivering, er egnet til å spille en viktig rolle i kolitt-assosiert tumorigenesis fordi avvikende NF-kB-aktivering ble påvist i 50% av tykk- og kolitt-assosiert svulster og musestudier [7]. Samlet utgjør disse funnene tyder på en overbevisende rolle for betennelse i tykktarmen kreftutvikling.
Natur flavonoider er utbredt i menneskets kosthold og planter, inkludere alle sitrusfrukter, blåbær, persille, løk, sort te, grønn te, rød vin og bananer [8]. Disse forbindelser er lavmolekylære stoffer som er basert på en felles tre-ringstruktur med forskjellige substitusjoner [9]. Siden den franske paradoks forlot inntrykk av at mye av Frankrikes lavere forekomst av hjertesykdom i forbindelse med landets høye nivåer av rødvin forbruk, har flavonoider fra rødvin blitt et fokus for kreft forskningsstudier [10]. De potensielle gode egenskapene av flavonoider inkluderer antioksidant, antiaterosklerotisk, anti-inflammatorisk, antithrombogenic, antiosteoporotic, og antivirale effekter [10]. Nylig har antitumor effektene av flavonoider også blitt anerkjent [11]. Mange flavonoider, for eksempel quercetin [12], silymarin [13] og luteolin [14], utøve antitumor aktivitet mot ulike kreftcellelinjer, noe som tyder på at disse flavonoider er lovende agenter for kreftforebygging og garanterer videre studier. Flavonoider er fenyl-substituerte Chromones (benzopyranderivater) som består av et 15-karbongrunnleggende skjelett (C6-C3-C6) (Fig 1 A) med en kroman (C6-C3) kjerne (benzoringen A og den heterosykliske ringen C) og med en fenyl-gruppe (den aromatiske ring B) som normalt er substituert ved 2-stillingen [15]. I de senere år, wogonin, som er et flavonoid, har fått økende oppmerksomhet for sin antitumor-aktivitet i hepatoma [16], bryst-karsinom [17], magekreft [18], cervikal karsinom [19], og leukemi [20, 21] . Mange wogonin-derivater er blitt syntetisert for å få bedre vannløselighet og druggability, og noen av disse syntetiserte derivater har vist potensiell antitumoreffekter. For eksempel, LYG-202, som er en wogonin derivat, induserer apoptose i humane leverkreft HepG2 celler via indusere ROS-mitochondria veien [22]. LYG-202 induserer også cellesyklus og apoptose i human kolorektal kreft HCT116 cellene via sin regulering av p53 og p21WAF1 /Cip1 [23]. En annen wogonin derivat, LW-214, har potent antitumoraktivitet i humane brystcancer MCF-7-celler ved å nedregulere Trx-1 og ved å aktivere JNK-reaksjonsveien, til syvende og sist å indusere mitokondrier-mediert apoptose [24]. I dette arbeidet har vi fokusert på LZ-207, som er en nylig syntetisert flavonoid med en struktur som minner om wogonin. En metoksygruppe i LZ-207 er substituert i 6′-stillingen, og en substitusjons piperazin skjer i 7′-stillingen (se figur 1B). Disse substitusjonene forbedrer vannløseligheten (tabell 1) og druggability av LZ-207 sammenlignet med andre flavonoid familiemedlemmer. Derfor var vi interessert i å undersøke de antitumor effekter av LZ-207 på kolitt-assosiert kreft og i å avsløre samspillet mellom inflammatoriske celler og kreftceller. I denne artikkelen, studerte vi vekst-inhiberende effekter av LZ-207 i HCT116-celler og de inhiberende virkninger av LZ-207 for inflammatoriske prosesser i THP-1 monocytter. Vi har også undersøkt de inhiberende virkninger av LZ-207 på den inflammatoriske respons utløst ved dyrking av HCT116-celler med LPS-indusert human monocytt THP-1-celler.
(A) Kjemisk struktur av 15-karbon-flavon ryggrad. (B) Kjemisk struktur av LZ-207 (C
26H
32N
2o
6, MW = 468,5421).
Materialer og metoder
Reagenser
LZ-207 (renhet 99%), som ble oppnådd fra Dr. Zhiyu Li (Kina Pharmaceutical University, Kina), ble oppløst i DMSO til 0,1 M som en stamoppløsning og lagret ved -20 ° C. LZ-207 ble friskt fortynnet med cellekulturmedium til forskjellige sluttkonsentrasjoner før hvert eksperiment. Den endelige DMSO-konsentrasjonen ikke overstige 0,1% og hadde ingen virkning på cellevekst og differensiering.
lipopolysakkarider (LPSs), 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) og 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Et annexin V-FITC apoptose deteksjon kit, en kjemiluminescerende electro skift-analyse (EMSA) kit, og humant IL-1β og IL-6 enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) sett ble kjøpt fra Bender MedSystems Co., Ltd. (Burlingame, CA, USA), Beyotime institutt for bioteknologi (Nanjing, Kina), og KeyGen Biotech Co., Ltd (Nanjing, Kina), henholdsvis.
Primær β-actin antistoff ble hentet fra BOOSTER Bioteknologi, Ltd . (Wuhan, Kina) og brukes på en 1: 20.000 fortynning. Primær Akt, Bax, caspase-3, caspase-8, caspase-9, ERK, IκBα, NF-kB, JNK, p38, p-Akt, p-ERK, p-JNK, p-p38-antistoffer ble oppnådd fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA) og alle ble brukt på en 1: 500 fortynning. Primær Bcl-2, IKKα /β, PARP, p-IKKα /β, p-IκBα antistoffer ble erholdt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) og ble alle anvendt i en 1: 1000 fortynning. IRDye 800-konjugerte sekundære antistoffer ble oppnådd fra Rockland, Inc. (Philadelphia, Pennsylvania, USA) og brukes på en 1:. 15000 fortynning
Cell kultur
Menneskelig tykktarmskreft HCT116-celler, menneske kolorektal kreft SW1116 og HT29 celler, menneske navleveneendotel HUVEC celler, normal human lunge fibroblaster MRC5 celler og menneske akutte monocytic leukemi THP-1 celler ble oppnådd fra cellen bank av den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina). HCT116, HT29, SW1116, HUVEC, MRC5 og THP-1-celler ble dyrket enten i McCoys 5A medium eller DMEM-medium (Gibco, Invitrogen Corporation, NY, USA). Alle media ble supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Invitrogen Corporation, NY, USA), 100 U /ml benzylpenicillin, og 100 ug /ml streptomycin ved pH 7,4, og cellene ble opprettholdt i en CO
2 inkubator (Thermo Forma, Thermo Fisher Scientific, Inc., MA, USA) med en fuktet atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C [25, 26].
celleviabilitet assay
SW1116 celler, HT29-celler, HCT116-celler, HUVEC-celler, MRC5 celler og THP-1-celler ble platet i 96-brønners plater med 100 ul av den passende medium ved en optimal tetthet. Cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av LZ-207 og inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2 til 24, 48 og 72 timer. Deretter ble 20 ul av MTT-løsning (5 mg /ml) tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2 for ytterligere 4 timer. Deretter ble supernatantene fjernet, og 100 ul DMSO ble tilsatt til hver brønn. Platene ble ristet i 2 minutter for å sikre fullstendig løselighet av de formazankrystaller, og cellelevedyktigheten ble bestemt på grunnlag av den mitokondrielle omdanning av MTT til formazan. Absorbans (A) ble målt ved 570 nm ved bruk av en universell mikroplateleser (EL800, BioTek Instruments Inc.). Inhiberingen forhold (%) og overlevelsesrate (%) ble beregnet ved anvendelse av følgende ligninger:
A
Behandlet og A
Kontroll var de gjennomsnittlige absorbans-verdiene av tre parallelle forsøk fra de behandlede og kontroll gruppene, respektivt.
IC
50, som er den konsentrasjon som forårsaket 50% inhibering av celle-levedyktighet, ble beregnet ved anvendelse av logit-metoden [24].
DAPI farging assay
cellekjerner ble visualisert med DAPI flekker, som avgir blå fluorescens ved binding til AT-regioner av DNA, for å oppdage eventuelle morfologiske tegn på apoptose. Etter at LZ-207 behandling i 24 timer ble HCT116-celler fiksert med kald 4% paraformaldehyd i 30 minutter, vasket to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS), og deretter permeabilisert med 0,3% Triton X-100 i 20 minutter ved romtemperatur. Etter å ha blitt vasket to ganger med PBS, ble cellene inkubert med DAPI (1 pg /ml) i 10 minutter, og så observert ved hjelp av fluorescensmikroskopi (Olympus, Japan) med en topp eksitasjonsbølgelengde på 340 nm [27].
Annexin V /PI dobbeltfarging assay
apoptose-medierte tumorcelledød ble undersøkt ved bruk av en dobbel fargemetode med et FITC-merket Annexin V /PI Apoptose Detection Kit ifølge produsentens instruksjoner. HCT116-celler i McCoys 5A medium inneholdende 10% FBS ble dyrket i 6-brønners plater på et behagelig tetthet i 24 timer. Etter at LZ-207 (5, 10, eller 20 uM) behandling i ytterligere 24 timer, ble cellene høstet, vasket to ganger med kald PBS, og deretter resuspendert i 500 ul bindingsbuffer. Deretter 5 ul av Annexin V og 5 ul av PI ble suksessivt tilsatt til hvert rør, blandet forsiktig og holdt på is i 10 min i mørket. Datainnsamling og analyse ble utført ved hjelp av en Becton Dickinson FACS Calibur flowcytometer med FlowJo 7 programvare med eksitasjon /emisjon på 488/530 nm. Den venstre nedre delen av fluorocytograms (An-, PI-) representerer normale celler, høyre nedre delen av fluorocytograms (An +, PI-) representerer begynnelsen og midten av apoptotiske celler, og retten øvre delen av fluorocytograms (An +, PI +) representerer sent apoptotiske celler [28, 29].
Mitokondrietrans potensial (ΔΨm) vurdering
Mitokondrietrans potensielle (ΔΨm) endringer kan angis av JC-1, et fluorescerende fargestoff fra keygen JC-1 apoptose Detection Kit (Kina). Etter at LZ-207 (5, 10, eller 20 uM) behandling i 24 timer ble HCT116 cellene høstet, vasket med PBS, resuspendert i JC-1 arbeider buffer. Etter inkubering ved 37 ° C med 5% CO
2 i 30 minutter, ble cellene vasket to ganger med inkuberingsbuffer og analysert ved strømningscytometri og programvare FlowJo 7 med innstillinger av FL1 (FITC, grønn) og FL2 (PI, røde ) [30].
Utarbeidelse av mitokondrielle og cytosoliske fraksjoner
mitokondrie og cytosoliske fraksjoner fra celler ble utarbeidet etter keygen mitokondrier isolasjon kit (Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter at LZ-207 (5, 10, eller 20 uM) behandling i 24 timer ble HCT116 cellene høstet, vasket med PBS, resuspendert i kald lyseringsbuffer, og homogenisert på is vann med en stram pistill. Deretter ble cellene overført til medium-buffer og sentrifugeres i 10 minutter ved 4 ° C (1200 g). Supernatanten ble oppsamlet og sentrifugert igjen i 10 minutter ved 4 ° C (7000 g) for å oppnå mitokondriene (pellet) og cytosol (supernatant) fraksjoner. Mitokondrier og cytosol fraksjoner av HCT116-celler ble lagret ved -80 ° C [31].
Immunofluorescence
HCT116-celler ble sådd ut på dekkglass i 6-brønners plater i 24 timer og behandlet med LZ -207 (5, 10, eller 20 uM) med eller uten LPS (10 pg /ml) i ytterligere 24 timer. Deretter ble cellene vasket tre ganger med PBS i 5 minutter hver, fiksert med kald 4% paraformaldehyd i 30 minutter, skylles tre ganger med PBS i 5 minutter hver, permeabilisert med 0,3% Triton X-100 i 20 minutter, blokkert med 5 % BSA i 60 minutter og inkubert med primært NF-kB-antistoff (fortynnet 1: 200) over natten ved 4 ° C. Etter skylling tre ganger med PBS inneholdende 0,01% Tween 80 i 5 minutter hver, ble cellene farget med FITC-merket sekundært geite-anti-muse-IgG-antistoff (1: 100) ved 37 ° C i 1 time i mørke. Deretter ble cellene vasket tre ganger med PBS i 5 minutter hver og farget med DAPI. Bildene ble tatt med et Olympus FV1000 konfokalmikroskop [32].
Fremstilling av helcellelysater og cytosoliske og nukleære ekstrakter
I korthet ble cellene dyrket til omtrent 80-90% konfluens og behandlet med LZ-207 ved de angitte konsentrasjoner med eller uten LPS (10 pg /ml) i 24 timer. De hele cellelysater ble fremstilt som tidligere beskrevet [33]. Nukleære og cytosoliske proteinekstrakter ble fremstilt ved anvendelse av en kjernefysisk /cytosol Fraksjonesett i henhold til den modifiserte produsentens protokoll nedenfor. Etter vasking to ganger med PBS, ble cellene oppsamlet i rør med PBS ved å skrape med en celleskrape og sentrifugert i 5 minutter ved 4 ° C (600 g). Deretter fjernet vi supernatanten forsiktig resuspendert cellepelleten med cytosolisk utvinning buffer og inkubert denne suspensjonen på is i 15 min, etterfulgt av en 15 minutters sentrifugering ved 4 ° C (14 000 g). Supernatanten (cytoplasmisk fraksjon) ble forsiktig overført til en ren, på forhånd avkjølt rør og lagret ved -80 ° C for senere bruk. Deretter ble det samme volumet av cytosolisk utvinning buffer tilsatt til pelleten på nytt, og de samme fremgangsmåten ble gjentatt som før, bortsett fra den overliggende væske ble kastet sist. Den nukleære pellet ble resuspendert i atom ekstraksjonsbuffer, holdt på is i 30 minutter, og deretter sentrifugert i 15 minutter ved 4 ° C (12 000 g). Supernatanten (kjerneproteinekstrakt) ble forsiktig overført til en ren, på forhånd avkjølt rør og lagret ved -80 ° C [33].
EMSA
HCT116-cellekjerneproteiner ble ekstrahert som beskrevet tidligere. EMSA ble utført ved hjelp av en ikke-radioaktive (biotin merket) gel shift analyse i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt ble oligonukleotidprober syntetisert, glødet, og merket ved anvendelse av et biotin 3′-enden DNA merkingskit (Pierce). Ved å følge produsentens protokoll ble det fremstilte DNA-proteinkomplekser løst på en 6% ikke-denaturerende polyakrylamidgel i en 0,5 x Tris-borat-EDTA-buffer ved 380 mA i en time og deretter overført til en nylonmembran. Til slutt ble gelen forskyvning av biotin-merket DNA visualisert ved kjemiluminescens ved hjelp av en Bio-Rad infrarødt system og en kjemiluminescerende EMSA kit [34].
Western blot-analyse
helcellelysater og cytosolisk og nukleære ekstrakter fra behandlede celler ble fremstilt som beskrevet ovenfor, og proteinkonsentrasjonen ble målt under anvendelse av en BCA-analyse med en multimodus Varioskan mikroplate-spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) ved 562 nm. Like mengder av proteinprøver ble fremstilt, separert ved SDS-PAGE og overført på nitrocellulose (NC) membraner. Membranene ble blokkert med 1% BSA i PBS ved 37 ° C i 1 time og deretter inkubert med de indikerte primære antistoffer over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med IRDye 800-konjugerte sekundære antistoffer i 1 time ved 37 ° C. Deteksjon ble utført ved hjelp av Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Inc., Lincoln, NE, USA). Alle Blottene ble strippet og reprobed med polyklonalt anti-β-actin-antistoff for å fastslå lik lasting av proteiner [35].
Cytokin kvantifisering ved hjelp av ELISA
humant IL-6 og IL-1 ELISA-kit ble anvendt i henhold til produsentens instruksjoner for å kvantifisere ekspresjon av utskilt IL-6 og IL-1 p cytokiner i supernatantene av behandlede THP-1-celler. THP-1-cellene ble behandlet med LZ-207 (5, 10, eller 20 uM) med eller uten LPS (10 pg /ml). Hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger. De cytokin-nivåer er uttrykt i pg /ml. Cytokiner ble ikke oppdaget i frisk mediet som brukes til kultur disse cellene [36].
RNA ekstraksjon og kvantitativ real-time PCR (qPCR) assay
Total RNA fra behandlede THP-1 celler ble hentet ved hjelp av en fenol /kloroform metode med TRIzol reagens (Invitrogen). Revers transkripsjon (RT) ble utført ved hjelp av like mengder av mRNA, og kvantitativ real-time PCR (qPCR) ble utført etter Takara kit-protokollen (Takara, Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Japan). cDNA ble også samlet inn for sanntids kvantitativ revers transkripsjon-PCR (QRT-PCR), som ble utført ved hjelp av en Chromo4instrument (Bio-Rad, Berkeley, CA, USA) med SYBR Grønn Master Mix (Applied Biosystems, CA, USA). Den relative mengde av mål-mRNA ble bestemt ved hjelp av sammenlignende terskelsyklusen (Ct) Fremgangsmåte ved normalisering av mål-mRNA Ct-verdiene til disse verdiene for β-aktin (△ Ct) [37]. Primersekvensene som ble brukt var som følger:
IL-6-sense: 5′-TGTAGTGAGGAACAAGCCAGAG-3 «,
IL-6-antisense: 5′-TACATTTGCCGAAGAGCC-3′;
IL-1β-sense: 5′-AGGCTGCTCTGGGATTC-3 «;
IL-1β-anti: 5′-GCCACAACAACTGACGC-3′;
β-actin-sense: 5′-CTGTCCCTGTATGCCTC T-3 «,
β-actin-antisense: 5′-ATGTCACGCACGATTTCC-3′
Co-kultur av HCT116-celler med THP-1-celler
HCT116-celler ble sådd ut i 6-brønns plater ved 4 x 10
4 celler per brønn og fikk vokse til tilnærmet 80% konfluens. THP-1-cellene ble oppsamlet ved sentrifugering (600 g i 10 minutter, vasket og resuspendert ved en sluttkonsentrasjon på 2 x 10
5 celler /ml) og tilsatt til HCT116-celler. Deretter ble ko-kultursystem forblir ubehandlet, aktivert med LPS, eller behandlet med LZ-207 sammen med LPS. Etter 24 timer ble ko-kultursystem stoppet, og cellekulturmedier ble fjernet. De HCT116-celler ble vasket to ganger med kald PBS (pH = 7,4), og cellenes levedyktighet ble målt ved hjelp av MTT-analyser som beskrevet ovenfor [38, 39].
Antitumor effekt på HCT116 nakne mus-xenotransplantater
dyret forsøket ble utført på grunnlag av sop etablert av staten Food and Drug Administration (Drug Administration) i Kina. Atymiske BALB /c nakne mus, kvinnelig, 35-42 dager gamle med vekt fra 18 til 22 g ble oppnådd fra Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences. De spesifikke patogen frie nakne mus ble oppdratt i et kontrollert miljø (23 ± 2 ° C, 55 ± 5% fuktighet, 12h lys + 12h mørk /dag) og matet med standard laboratorie mat og vann. 1 x 10
6 HCT116-celler ble injisert i høyre armhule til hver nakne mus for å etablere en dyremodell. Etter 12 dager ble mikrometer calipers anvendt for å bestemme tumorstørrelsen. Nakne mus med likt tumorvolum ble utvalgt og tilfeldig delt inn i 5 grupper: 0,9% saltvann kontrollgruppen (12 nakne mus), 5-FU 30 mg /kg positive gruppe (6 nakne mus), LZ-207 20 mg /kg gruppe ( 6 nakne mus), LZ-207 10 mg /kg-gruppen (6 nakne mus) og LZ-207 10 mg /kg-gruppen (6 nakne mus). Den nakne mus fikk intravenøs injeksjon hver tredje dag. Tumorvolum og kroppsvekt ble målt også hver tredje dag. Etter 21 dagers behandling, alle nakne mus ble avlivet, ble perifert blod oppsamlet; tumorene ble fjernet og veiet; hjerter, lever, milt, lunger og nyrer ble separert. Tumorvolum (TV) ble beregnet ved anvendelse av følgende ligning: TV (mm
3) = D /2 x d
2, hvor D og d er den lengste og den korteste diameter på tumor, henholdsvis [27].
Statistisk analyse
Alle data er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD) fra triplikate eksperimenter utført på en parallell måte, med mindre annet er angitt. Alle data sammenligninger ble gjort ved hjelp av Student
t
-UNDERSØKELSER og ble ansett som statistisk signifikant på *
P
0,05 og **
P
0,01.
Resultatene
LZ-207 hemmer tumorcellelevedyktighet
MTT-analyser ble brukt for å undersøke effekten av forskjellige konsentrasjoner av LZ-207 på cellelevedyktigheten av tumorcellelinjer (SW1116, HT29 og HCT116-celler), godartet cellelinjer (HUVEC og MRC5 celler) og THP-1 celler. Etter en 48 timers behandling, LZ-207 effektivt hemmet levedyktigheten til SW1116, HT29, og HCT116-celler (figur 2A), med IC
50-verdier på 25,1 ± 0,86, 39,5 ± 1,13, og 13,2 ± 1,49 pm, henholdsvis ( figur 2B). Som vist i figur 2C, HCT116-celler viste tids- og doseavhengig følsomhet til LZ-207. IC
50-verdier for 24, 48 og 72 h LZ-207 behandlinger i HCT116-celler var 19,81 ± 0,75, 14,58 ± 0,42 og 9,32 ± 0,50 uM, respektivt (figur 2D). Derfor ble HCT116-cellelinje som er valgt for alle etterfølgende eksperimenter med 5, 10 og 20 uM LZ-207-behandlinger i 24 timer. Tre doser av LZ-207 viste ingen tydelig effekt på overlevelsen av benigne celler og THP-1-celler som vil bli brukt i den ko-kultursystemet under.
(A) Den inhiberende effekt av et 48 h behandling med LZ-207 på SW1116, HT29 og HCT116-celler. (B) IC
50 verdier av en 48 timers behandling med LZ-207 i SW1116, HT29 og HCT116-celler. (C) HCT116-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av LZ-207 på 24, 48 og 72 timer. (D) IC
50-verdier på 24, 48 og 72 h LZ-207 behandlinger i HCT116-celler. (E) Overlevelsesraten av en 48 timers behandling med LZ-207 på HUVEC og MRC5 celler. (F) Overlevelsesraten av en 48 timers behandling med LZ-207 på THP-1-celler. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 3).
LZ-207 induserer apoptose i HCT116 cellene
Den morfologi HCT116-celler ble alvorlig endret etter 24 h behandling med LZ-207. For å undersøke hvorvidt LZ-207 indusert apoptose i HCT116-celler, ble DAPI farging anvendt for å detektere endringer i atom. Fluorescens mikroskopi viste at kontrollceller var jevnt farget med blå fluorescens, noe som viser den typiske homogen fordeling av kromatin i kjerne. I motsetning til dette, HCT116-celler behandlet med LZ-207 slippes ut en lysere fluorescens, noe som indikerer begynnelsen av apoptose på grunn av kromatin kondensasjon og nucleolus pyknosis (figur 3A).
HCT116-celler behandlet med 5, 10 eller 20 pM LZ-207 i 24 timer. (A) Morfologiske forandringer av kjerne ble observert ved hjelp av fluorescensmikroskopi (400 x). Celler ble undersøkt for tilstedeværelse av apoptotiske legemer og kjerne pyknosis. (B) Annexin V /PI dobbel farging analyse av HCT116-celler.
Y
-aksen viser PI-merket befolkningen, og
X
-aksen viser FITC-merket annexin V-positive celler. (C) Den apoptotiske ratene HCT116-celler indusert av LZ-207. (D) Western blotting-analyse av PARP, Bax, Bcl-2, procaspase-3, procaspase-9, og procaspase-8 i HCT116-celler behandlet med LZ-207. (E-G) Densitometrisk analyse representerer den relative ganger endring i proteinekspresjon. (H-I) Endringen av ΔΨm ble påvist ved hjelp av JC-1-farging og analysert ved flowcytometri i LZ-207 behandlede HCT116-celler. (J-K) Western blot-analyse av cytokrom c i mitokondriene og cytosol i LZ-207 behandlede HCT116-celler. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 3). *
P
0,05, **
P
0,01, signifikant forskjell sammenlignet med kontrollen.
LZ-207-indusert apoptose i HCT116-celler ble ytterligere bekreftet ved hjelp av Annexin V /PI fargings analyser. Etter behandling med 5, 10 eller 20 mikrometer LZ-207 for 24 timer, tidlig apoptotiske priser i kontroll og behandlede HCT116-celler var 4,35, 10,21, 14,76 og 22,14%, henholdsvis, og på slutten av apoptotiske ratene var 3,76, 9,75, 21,78, og 26,79%, henholdsvis (figur 3B og 3C). Disse resultatene viste at LZ-207 behandling induserer både tidlig og sen apoptose i en konsentrasjonsavhengig måte.
Western blots viste at proteinnivået spaltet PARP økte med økende konsentrasjoner av LZ-207, mens proteinnivået av intakt PARP redusert, noe som bekrefter evnen til LZ-207 for å indusere apoptose i en del av sin antitumoreffekt på HCT116-celler (figur 3D og 3E). Vi har også funnet at Bcl-2-ekspresjon ble redusert etter HCT116-celler behandlet med LZ-207 i 24 timer, mens Bax ekspresjon økes, noe som fører til en betydelig økning i forholdet Bax /Bcl-2 (figur 3F). Vi oppdaget videre at procaspase-3 og procaspase-9 ekspresjon signifikant redusert etter at LZ-207-behandling, noe som indikerer at denne mitokondrielle reaksjonsvei kan være involvert i LZ-207-indusert apoptose (figur 3G). I mitokondriene-mediert apoptose, depolarisering av den mitokondrielle transmembranpotensialet (ΔΨm) ledsaget av frigjøring cytokrom c fra mitokondrie inn i cytosol, noe som utløser en caspase-avhengig apoptose. Det var en åpenbar økning i grønn fluorescens av JC-1 monomere i LZ-207 behandlede HCT116-celler, noe som indikerer depolarisering av mitokondrie transmembrane potensial (ΔΨm) (fig 3 H og 3I). Vi fant også at uttrykket av Cyt-c gått ned i mitokondriene mens økt i cytosol i LZ-207 behandlede HCT116-celler (fig 3J og 3K). I mellomtiden har liten nedbrytning av procaspase-8 antydet at en ytre apoptose sti kanskje også korrelerer med LZ-207-indusert apoptose (Fig 3G).
Hemmende effekt av LZ-207 på LPS-indusert NF-kB p65 aktivering i HCT116 cellene
NF-kB familie av transkripsjonsfaktorer regulerer uttrykket av flere gener, inkludert betennelse-assosiert gener. Dermed blir feilregulering av NF-kB-signalering er en markør for kreftutvikling. Ved hjelp av immunfluorescens konfokalmikroskopi (fig 4A), observerte vi at LZ-207 behandling hemmet NF-kB p65 kjernefysisk trans i HCT116 cellene. Vi kvantifisert mengden av NF-kB p65 i den nukleære fraksjonen av LZ-207-behandlede HCT116-celler via Western blot-analyse, ekspresjonen av atom NF-kB øket med 10 ug /ml LPS behandling i HCT116-celler, som vist i fig 4B og 4C; men dette LPS-indusert NF-kB nukleær translokasjon ble undertrykket av LZ-207 behandling. Ved hjelp av EMSA assays, vi også demonstrert at LZ-207 trykkes LPS-indusert NF-kB-DNA-bindende aktivitet på en doseavhengig måte i HCT116-celler (figur 4D).
HCT116-celler behandlet med eller uten LZ- 207 i nærvær av LPS i 1 time. Etter isolering av de nukleære og cytoplasmiske ekstrakter, (A) NF-kB p65-nivåer ble bestemt ved immunofluorescens, og (B-C) NF-kB p65 trans ble målt via Western blotting. (D) LZ-207 trykkes LPS-indusert NF-kB-DNA-bindende aktivitet i et konsentrasjonsavhengig måte, detektert som via EMSA assay. (E-H) Western blotting-analyse av fosforylering av IicB og IKK i HCT116-celler behandlet med eller uten LZ-207 i nærvær av LPS i 1 time. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 3). *
P
0,05, **
P
0,01, signifikant forskjell sammenlignet med kontrollen.
Ettersom NF-kB aktivering resulterer fra den hurtige fosforylering, ubiquitinering, og til slutt proteolytisk nedbrytning av IkB, undersøkte vi effekten av LZ-207 på ekspresjon av fosforylert IκBα i LPS-indusert HCT116 cellene via Western blot. LZ-207 hemmet signifikant IκBα fosforylasjon sammenlignet med kontrollen, men hadde ingen virkning på IκBα protein ekspresjon (Fig 4E og 4F). Fordi IkB degradering er primært avhengig av IKK-aktivering, ved, undersøkte vi effekten av LZ-207 på ikk aktivering og funnet at LZ-207 signifikant undertrykt LPS-indusert IKKα /β fosforylering i HCT116-celler (figur 4G og 4H).
LZ-207 hemmer signalveier oppstrøms av NF-kB i HCT116 cellene
celler forstand endringer i deres miljø via aktivering av signaloverføringsveier som direkte biokjemiske programmer for å megle spredning og overlevelse. Den mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) familie og Akt signalveier kan regulere disse fundamentale celleprosesser gjennom induksjon av IKK-avhengige NF-kB-aktivering. Vi undersøkte ekspresjon av faktorene oppstrøms av NF-kB-aktivering, inkludert p38 MAPK, ERK1 /2, JNK og Akt, etter LZ-207-behandling i LPS-induserte HCT116-celler. Som vist i figur 5A og 5B, LZ-207 inhiberte LPS-indusert fosforylering av p38 MAPK, ERK1 /2, JNK og Akt, mens uttrykket nivåer av p38 MAPK, ERK1 /2, ble JNK, og Akt ikke endret.
HCT116-celler behandlet med eller uten LZ-207 i nærvær av LPS i 1 time. (A) Western blotting-analyse av p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, Akt, p-Akt proteinekspresjon. *
P
0,05, **
P
β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. *
P
0,05, **
P
*
P
0,05, **
P
*
P
0,05, **
P
*
P
0,05, **
P
