Abstract
Gitt de viktige rollene miRNA i post-transkripsjonsregulering og dens implikasjoner for kreft, karakterisering av miRNA letter for oss å avdekke molekylære mekanismene bak utviklingen av androgen-uavhengig prostatakreft (PCA). Fremveksten av neste generasjons sekvensering teknologi har dramatisk endret hastigheten på alle aspekter ved sekvensering i en rask og kostnadseffektiv måte, noe som kan tillate en objektiv, kvantitativ og grundig undersøkelse av små RNA transkriptom. I denne studien brukte vi high-throughput Illumina sekvense omfattende representerer omfattende tilbud av enkelte små RNA og å karakter miRNA uttrykk profiler i både androgen avhengige og uavhengige Pca cellelinje. I det minste 83 mirnas er betydelig forskjellig uttrykt, hvorav 41 er oppregulert og 42 er nedregulert, indikerer disse mirnas kan være involvert i overgangen av LNCaP til en androgen-uavhengig fenotype. I tillegg har vi identifisert 43 nye mirnas fra androgen avhengige og uavhengige PCa bibliotek og tre av dem er spesifikke for androgen-uavhengig PCa. Funksjon annotering av målgener indikerte at de fleste av disse forskjellig uttrykt mirnas tendens til å målrette gener involvert i signaloverføring og cellekommunikasjon, epically MAPK signalveien. De små RNA transcriptomes oppnådd i denne studien gi betydelig innsikt i en bedre forståelse av ekspresjon og funksjon av små RNA i utviklingen av androgen-uavhengig prostatacancer
relasjon:. Xu G, J Wu, Zhou L, Chen B, Sun Z, Zhao F et al. (2010) Karakterisering av små RNA Transcriptomes av androgen avhengige og uavhengige prostatakreft cellelinje ved Deep Sequencing. PLoS ONE 5 (11): e15519. doi: 10,1371 /journal.pone.0015519
Redaktør: Patrick Ling, Queensland University of Technology, Australia
mottatt: 1 august 2010; Godkjent: 06.10.2010; Publisert: 30.11.2010
Copyright: © 2010 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen i Kina (No. Y2100902), Wenzhou Science and Technology Project (Y20100011), Zhejiang Provincial Science and Technology Platform of Analyse og testing av teknologi prosjekter (2009F82G2090045) og National High Technology Research and Development Program Kina (2006AA02A304). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste kreftformen av den mannlige urogenitalsystem og den tredje største årsaken til kreftdød [1], [2]. Som PCa veksten er i utgangspunktet avhengig av androgener for å overleve, har androgen deprivasjon terapi (ADT) vært bærebjelke i behandling for PCa. Imidlertid vil disse svulstene etter hvert utvikle seg til en androgen-uavhengig fenotype og ikke klarer å svare på ADT behandling, og ble den største hinderet for klinisk behandling. Forstå de molekylære mekanismene som ligger bak utviklingen av androgen-uavhengig PCa vil kaste betydelige lysene på mulige behandlingsstrategier for PCa. mirnas (microRNAs) er små, ikke-kodende RNA (~20-22 nukleotider) som negativt regulerer genekspresjon på post-transkripsjonsnivået [3]. Akkumulerende bevis indikerer at mirnas kan fungere som tumor-suppressorer og onkogener [4], [5]. Gitt de viktige rollene mirnas i post-transkripsjonsregulering, vil identifisering av disse forskjellig uttrykt og romanen mirnas lettere for oss å avdekke de molekylære mekanismene bak utviklingen av androgen-uavhengig prostatakreft.
For å karakterisere små RNA transkriptom , den nye «deep-sekvense «teknologier, for eksempel Roche 454 og Illumina Solexa, har vært ansatt som har betydelige fordeler i forhold til tidligere hybridisering baserte metoder, slik som microarray og PCR-baserte analyser [6], [7]. For det første gir det et mer helhetlig syn på miRNAs transkriptom. High-throughput-sekvensering har evnen til å identifisere små, eller til og med lave rikelig mirnas oppviser ekspresjonssystemer forskjeller mellom forskjellige prøver, i en grad som tidligere ikke kunne bli effektivt påvises. For det andre, direkte sekvensering gir også mulighet for å detektere den lengde variant av modne miRNA og mulige enzymatiske modifikasjoner. For det tredje tillater high-throughput sekvense den vellykkede oppdagelsen av nye mirnas, som trenger ikke avhengig av spørring kandidat regioner av genomet men snarere kan oppnås ved direkte observasjon og validering av folding potensialet av flankerende genomisk sekvens. Til sammen neste generasjons sekvensering teknologi tilbyr et svært robust, nøyaktig og skalerbart system som setter en ny standard for rask, produktiv og kostnadseffektiv undersøkelse av miRNA transkriptomet.
Til nå er det seks genom-wide miRNA uttrykket studier i prostatakreft som gjennomgås av Gandellini et al. [8]. Den første miRNA uttrykket profilering av prostatakreft ble utført av Lu og kolleger [5], hvor de brukte en perle-basert flowcytometrisk teknikk for å evaluere miRNA profilering i ulike krefttyper. De resterende fem studier brukt microarray eller perle basert hybridisering metode for å undersøke miRNA uttrykk signaturer i prostatakreft sammenlignet med normalt vev, og identifisert en rekke avvikende uttrykt miRNAs i tumorceller. Men disse studiene kun fokusert på sammenligningen av miRNA ekspresjonsprofiler mellom PCA prøver og omkringliggende ikke-tumorvev, mens ikke avsløre hva slags miRNA kan være korrelert med overgangen fra androgen-følsomme for androgen uavhengig prostatakreft. Nå nylig, Sun et al. funnet at flere mirnas, spesielt MIR-221 og MIR-222, var betydelig over-uttrykt i androgen-uavhengig prostatacancerceller sammenlignet med de i androgen-avhengige cellelinje, og antydet involvering av begge mirnas i utvikling og progresjon av androgen-uavhengighet av prostatakreft [9]. Devere White et al. (2009) identifisert et lite sett med miRNAs ble abnormt uttrykt i androgen-uavhengig PCA cellelinjer ved hjelp av mikromatriseteknologi [10]. En detaljert sammenligning av miRNA uttrykk profiler mellom androgen-avhengige og androgen-uavhengig kreftformer kan avdekke hvordan miRNA veien er involvert i utviklingen av prostatakreft til androgen uavhengighet. Ved hjelp av neste generasjons sekvensering, har vi fått miRNA uttrykket signaturer i androgen-uavhengig prostatakreft og identifisert 83 mirnas forskjellig uttrykt i LNCaP-AI cellelinjer, samt mulige mål for disse miRNAs. Så vidt vi vet er dette studiet er det første eksempel på små RNA transkriptomet ved high-throughput-sekvensering i prostata kreft og har vist at dype sekvensering kan tjene som en ideell, hurtig og kostnadseffektiv plattform for karakterisering av små RNA ekspresjonsprofiler.
Materialer og metoder
Cell Culture
androgen-avhengige LNCaP cellelinjen ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville, MD) og ble rutinemessig opprettholdt i en vanlig medium: fenol rød-positiv F-12 medium (Gibco) med 10% FBS (BioWest) ved 37 ° C i 5% CO
2. Celler ble matet to ganger per uke og delt en gang per uke med trypsinering (definert som en passasje). For å etablere en androgen-uavhengig cellelinje, LNCaP ble først holdt i fenolrødt-fritt DMEM /F-12 medium (Gibco) med 10% trekull /dekstran-behandlede FBS (BioWest). Etter dyrket i 5 uker, ble cellene overført til ovennevnte medium med 1,0 × 10
-7 mol /L flutamide (Schering Plough) og dyrket i ytterligere 105 passasjer.
Cell Proliferation Assay
celler ble sådd ut ved en tetthet på 3 x 10
3 celler /brønn i en 96-brønners dyrkingsplate i 90 ul faste medier. Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C i 5% CO
2, ble kulturmediet forandret med halvparten av brønnene som fikk vanlig medium og halvparten mottok androgen fritt medium (fenol rød-fritt medium med 5,0 x 10
-6 mol /l flutamid). Cellene ble inkubert i 5% CO
2 ved 37 ° C i 72 timer, ble 10 ul av CCK-8-løsning (Dojindo) ble tilsatt til hver brønn, fulgt av inkubering i 3 timer ved 37 ° C, og absorbansen ble endelig avgjort ved 450 nm ved hjelp av mikroplateleser (Bio-Rad).
Western blotting ble utført av metodene beskrevet tidligere [11]. Følgende antistoffer ble brukt: kanin anti-BCL-2 (1:200, Cell Signaling), kanin anti-Bax (1:100, Cell Signaling) og mus anti-β-aktin (1:1000, Cell Signaling)
Cell Cycle Assay
celler ble suspendert i hormon-fritt og vanlige medium, henholdsvis, og ble deretter plantet i tre 24-brønners plater med et antall på 3,3 x 10
5 celler per godt. Etter inkubering i 5% CO
2 ved 37 ° C i 24 timer, ble det tilsatt flutamide inn i hullene. Cellene ble høstet etter inkubering i 5% CO
2 ved 37 ° C i 72 timer. Forbehandling prosedyre av cellesyklus analyse fulgte bruksanvisningen til Cycle Test
plusDNA Reagent Kit (Becton Dickinson). Cellesyklus analyse ble utført ved hjelp av en FACScan flowcytometer (BD Company)
Real-time RT-PCR
Små RNA ( 200 nt). Ble isolert med
Mirvana
™ PARIS ™ Kit (Ambion) i henhold til produsentens instruksjoner. For RT-reaksjoner, ble 1 pg av små RNA brukt for revers transkripsjon med miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen), utført ved 37 ° C i 60 minutter og en endelig inkubering ved 95 ° C i 5 min. MiRNA sanntids RT-PCR ble utført ved hjelp av miScript SYBR grønn PCR-kit (Qiagen) på en Applied Biosystems 7000 real-time PCR maskin (ABI). PCR-reaksjonen ble utført ved 95 ° C i 15 min, etterfulgt av 40 sykluser med inkubasjon ved 94 ° C i 15 s, 55 ° C i 30 s, og 70 ° C i 30 sek. Hver PCR ble gjentatt minst tre ganger. Den relative uttrykk nivået for hver miRNA ble normalisert ved U6 mot snRNA nivåer. Fold-endringen ble beregnet i henhold til 2
-ΔΔCt metode.
Små RNA Bibliotek Bygg og High-throughput sekvense
Den isolerte total RNA ble størrelse-fraksjonert på en 15% tris -borate-EDTA (TBE) urea polyakrylamidgel å berike for molekyler av 15-30 nt. Den lille RNA ble ligert med 3 «(5′-pUCGUAUGCCGUCUUCUGCUUGidT-3») og 5 «(5′-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3) kort ved bruk av T4-RNA-ligase og ble igjen størrelses-fraksjonert på en 15% TBE-urea-polyakrylamid gel. Det resulterende RNA ble transkribert til cDNA omvendt med Solexa lille RNA RT-primer (5»-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3 «). CDNA ble anvendt som et templat for PCR-amplifisering ved å bruke Solexa lille RNA primersett (5»-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3 «, 5′-AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3»). Til slutt, ca 20 mikrogram av små RNA ble brukt for sekvensering ved hjelp av Illumina en G Genome Analyzer i henhold til produsentens protokoller.
Les Filter og små RNA Stempler
For dyp-sekvensering leser produsert av Illumina Genome Analyzer, lav kvalitet lesninger ble filtrert ut for å utelukke de som er mest sannsynlig å representere sekvenseringsfeil og 3/5 «adaptersekvenser ble deretter trimmet til ren i full lengde leser formatert inn i en ikke-redundante Fasta format. Forekomster av hver unike sekvens leser ble regnet som sekvens tags (antall leser for hver tag reflekterer relative uttrykk nivå) og bare små RNA-sekvenser av 18-30 nt ble beholdt for videre analyse.
Alle unik sekvens koder som passerer over filtre ble kartlagt på referansen menneskelige genom hjelp av SOAP 2.0 programmet med høyst to uoverensstemmelser [12]. Deretter ble unik sekvens koder innrettet mot miRBase14.0, beregnings spådd menneskelig ncRNAs og Rfam 9.1 (https://rfam.sanger.ac.uk/), den RepeatMasker merknaden fra RepBase 14.09 (http: //www.girinst. org /), den menneskelige gener UCSC merknad hg18 (https://genome.ucsc.edu/) å klassifisere kjent miRNA, degraderings fragmenter av ikke-kodende RNA, genomisk gjentar og mRNA, henholdsvis. Sekvenser som ikke overlapper med noen av disse kommentarene, men kan bli justert til referanse genomet ble kalt «kategorier».
Differensial Expression Detection og Novel miRNA Tippe
For å sammenligne forskjellig uttrykt mirnas mellom LNCaP og LNCaP-AI, lese tellinger av hver identifiserte mirnas var normalisert til det totale antall miRNA leser. Den statistiske signifikans (P-verdi) ble utledes basert på Bayesiansk metoden, som ble utviklet for analyse av digitale genuttrykk profiler og kunne gjøre rede for sampling variasjon av koder med lave teller [13]. En spesifikk miRNA ble ansett å være signifikant forskjellig uttrykt hvis
P
verdi gitt ved denne metoden var ≤0.001 og det var minst to ganger endring i normalisert sekvens teller. Målgenene for hver forskjellig uttrykt miRNA ble beregnet med TargetScan (https://www.targetscan.org/), Miranda (https://www.microrna.org/), PicTar (http: //pictar.mdc-berlin .de /) og RNAhybrid (https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/). Gitt at miRNA mål forutsigelse ofte lider av høyt nivå av falske positiver, bare målgenet understøttet ved hjelp av minst tre uavhengige verktøy ble tatt hensyn til. The Gene ontologi (GO) vilkårene og KEGG trasé av målrettede gener ble kommentert ved hjelp av DAVID genet merknad verktøyet (https://david.abcc.ncifcrf.gov/UTH).
Umerket sekvenser som kan kartlegges til det humane genom ble ansett for å detektere kandidat nye miRNA gener. I korte trekk ble 100 nukleotider av genomisk sekvens som flankerer hver side av disse sekvenser ekstrahert og RNA sekundære strukturer ble forutsagt ved hjelp av RNAfold (https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi). Kandidat roman miRNA ble identifisert ved hjelp av MIREAP etter standardinnstillinger, som har blitt mye vedtatt i relaterte studier [14], [15]
Alle sekvense data sammen med merknads resultatene kan være tilgjengelig på http:. //59.79. 168,90 /PCA.
Resultater
Etablering av en androgen-uavhengig LNCaP cellelinje
Basert på de rapportene som androgen sensitive LNCaP celler (fig. 1a) kan omdannes til androgen-uavhengige celler [16], [17], vi forsøkte å generere en androgen-uavhengig cellelinje ved kontinuerlig dyrkning av LNCaP-celler
in vitro
. Etter tre ukers kultur initiering i hormon-belastede medium, proliferasjonen av cellene gradvis avta, og et betydelig antall celler (ca. 40-50%) gjennomgikk apoptose (Fig. 1B). De gjenværende endret i morfologi for å vise et neuroendocrine-lignende fenotype (Fig. 1B). Med økende passasje nummer, cellene først med åpenbare morfologiske variasjoner og blir små og flate, utvikle evnen til å vokse i en androgen-uavhengig måte (en fenotype som vi betegnet LNCaP-AI) (Fig. 1C). For å estimere effektene av androgen-fritt miljø på LNCaP-AI-celler vekst, undersøkte vi kontinuerlig celleformeringshastigheten av den cellelinje på forskjellige passasjer. Det er vist at celleveksthastigheten av LNCaP-AI-celler viste en gradvis nedadgående trend fra passasjen 1, 2, 5, 10 til 20, men som passasjen antall økes, celleproliferasjon ble øket gradvis og nådde nesten til 100% ( fig. 1D). Etter 110 passeringer i løpet av 2 år med kultur, ble cellevekst stabilisert og kan vokse godt i androgen-utarmet miljø.
(A) Morfologi av paren LNCaP-celler, som ble dyrket i vanlig medium i 3 dager. (B) Nevroendokrine fenotype av LNCaP celler. LNCaP-celler ble opprettholdt i androgen-utarmet medium og dyrket i 3 passasjer. (C) Morfologi av LNCaP-AI celler. LNCaP-celler ble dyrket med flutamid i androgen-utarmet medium for 110 passasjer. (D) De celle vekstrater av androgen-utarmet dyrkede LNCaP celler på ulike passasjer når dyrket i androgen deprivasjon miljø. (E-F) Virkningen av androgen fattig miljø og flutamid på LNCaP-AI (E) og LNCaP-FGC (F) cellesyklusen. (AI: androgen fattig medium, Flu: 1,0 × 10
-7 mol /L av flutamide, norm: vanlig medium). (G) Bcl-2 og Bax uttrykk i LNCaP og LNCaP-AI celler.
For ytterligere å bevise at de LNCaP-AI celler har tilegnet seg evnen til å tilpasse seg hormonfritt miljø, flere studier er nødvendig for innsikt i virkningene av flutamid eller androgen-fritt miljø for cellesyklus av LNCaP-celler ved flow-cytometri, og androgen-avhengige LNCaP-celler ble inkludert som en kontroll. Som forventet, flutamid eller androgen-fritt miljø hadde ingen signifikant effekt på cellesyklusfordelingen i LNCaP-AI-celler (fig. 1E). I motsetning til dette ble denne behandlingen i LNCaP-celler indusert en akkumulering av celler i G0 /G1 fase og sammen med en reduksjon i S-fasen, og inhiberingen virkning var mye sterkere når begge ble slått sammen (fig. 1F). Tidligere studie har avdekket at BCL-2 er overuttrykt i progresjon til androgen-ildfast prostatakreft [1]. For å karakterisere ekspresjon av både Bcl-2 og Bax (Bcl-2-assosiert protein X) proteiner i de to cellelinjer (LNCaP og LNCaP-AI), ble utført Western blot-analyse (fig. 1G). Vi har funnet en økt ekspresjon av Bcl-2-protein i LNCaP-AI-celler sammenlignet med LNCaP-celler. I mellomtiden, LNCaP-celler uttrykte et tilsvarende nivå av Bax protein. Disse resultater antyder at LNCaP-AI-celler oppnådd en forbedret anti-apoptotiske aktivitet. Basert på ovennevnte observasjoner, har vi opprettet en androgen-uavhengig LNCaP cellelinje gjennom langsiktig kultur LNCaP celler.
Små RNA Transcriptomes og merknader
For å undersøke små RNA transcriptomes, Illumina high-throughput sekvenseringsteknologi ble ansatt for å både LNCaP og LNCaP-AI små RNA-biblioteker. Innledningsvis, totalt 9.107.833 og 10.083.251 rå sekvens lesninger ble fremstilt for LNCaP og LNCaP-AI, respektivt. Etter filter og trimming av lyder med lav kvalitet og adapter, 3.978.524 og 4.734.866 sekvens leser ble oppnådd tilsvarende 302 325 (LNCaP) og 416924 (LNCaP-AI) unike koder. Observasjon lengden fordeling av små RNA, har vi funnet at de fleste av dem fra begge bibliotekene var 22 nt i størrelse (Fig. 2A), som er konsistent med den typiske størrelse av miRNA fra dicer fordøyelsesprodukter. Samtidig var det en høy andel av identiske sekvens tags (88,90%) mellom LNCaP og LNCaP-AI. Resultatene indikerte at mirnas har blitt suksessivt beriket fra begge bibliotekene.
(A) Lengde fordeling av sekvensert leser. Begge biblioteker akkumulert 22-nukleotid små RNA, som er i samsvar med den typiske størrelse av miRNAs. B) Andelen av ulike klasser av små RNA oppdaget i LNCaP og LNCaP-AI. Det er antydet at de fleste leser i begge bibliotekene som tilhører de miRNA familier.
Deretter 18-30 nt sekvenser fra begge bibliotekene ble valgt til å kartlegge det menneskelige genom, og totalt 3,747,159 (94,18%) og 4,433,423 (93,63%) sekvenser ble funnet å matche genomet med høyst to uoverensstemmelser, henholdsvis (fig. 2B). Basert på menneskelige genom merknader og en rekke godt karakterisert RNA databaser (se Materialer og metoder), ble disse små RNA-sekvenser kommenterte som kjent miRNA, degraderings fragmenter av ikke-kodende RNA (tRNA, rRNA, snRNA /snoRNA et al.) , genomisk gjenta, mRNA eller kategorier. Som forventet ble den mest tallrike RNA kategori fra begge bibliotekene kjent mirnas: 65,22% for LNCaP og 62,33% for LNCaP-AI. De resterende mindre rike kategoriene var ikke-kodende RNA og genomiske gjentar. I tillegg kan en liten andel av lyder bli kartlagt til kodende sekvenser, som sannsynligvis vil være RNA nedbrytningsprodukter. Samle bevis indikerte at noen genomer kan også transkribere korte funksjonelle ikke-koding transkripsjoner, for eksempel endogene små interfererende RNA eller gjenta-forbundet interfererende RNA, som har vært preget å regulere av retrotransposition undertrykkelse [18]. For eksempel, er det avslørt at L1 retrotransposition undertrykkes av endogent kodede små interfererende RNA i humane dyrkede celler. Dermed er det verdt å merke seg at disse små RNA kan også inneholde viktig biologisk funksjon som fortjener mer oppmerksomhet.
uttrykt forskjellig miRNA Mellom LNCaP og LNCaP-AI
Basert på miRBase, 360 mirnas (285 mirnas og 75 mirnas *) og 380 mirnas (282 mirnas og 98 mirnas *) ble påvist i LNCaP og LNCaP-AI, henholdsvis (tabell S1). For det første har vi funnet at forskjellige mirnas viste signifikant forskjellige ekspresjonsnivåer som målt ved frekvensen av lese tellinger, noe som indikerer en bemerkelsesverdig funksjonell divergens av disse miRNAs. I LNCaP-AI, for eksempel om 8,99% av miRNAs og miRNA * s har høy lese tellinger ( 1000), hvorav de HSA-la-7 familien (HSA-la-7c, HSA-la-7F, HSA-la-7a, HSA-la-7d, HSA-la-7b og HSA-la-7e) er en av de mest tallrike mirnas i datasettet, bidrar 8,94% av den totale miRNA leser. miRNA telle innenfor de områder av middels 100-1000 leser var opp til 17,4%, og de resterende miRNA teller ca 73,7%.
Den relative telling av sekvensering leser kunne brukes til å kvantifisere miRNA uttrykket nivåer mellom LNCaP og LNCaP -Ai. Basert på den normaliserte antall leser per prøve (specifc miRNA /totalsekvense koder i biblioteket), de fleste av miRNAs (256) ble uttrykt omtrent likt mellom de to bibliotekene. Men 83 av dem ble identifisert til å være forskjellig uttrykt med en fold endringer 2,0 og
P
-verdi 0,001 (. Tabell 1, figur 3A og tabell S1). Blant dem, 41 ble oppregulert og 42 ble nedregulert. For ytterligere å validere disse forskjellig uttrykt mirnas, ble 29 individuelle mirnas valgt å utføre kvantitativ RT-PCR analyse fra uavhengige biologiske replikater. Disse 29 utvalgte mirnas dekket både høyt uttrykte mirnas (MIR-222, MIR-30a *, MIR-100, MIR-10b, MIR-148b, MIR-1323, MIR-221, MIR-7, MIR-223, MIR-374b , MIR-486-5p, MIR-7a *, MIR-125b-2, MIR-27a og MIR-423-5) og lavere uttrykt mirnas (MIR-15b, MIR-21, MIR-17, MIR-28-5p , MIR-532-3p, MIR-200c, MIR-93, MIR-96, MIR-200b *, MIR-331-3p, MIR-200b, MIR-106a, MIR-301B og MIR-301 a). Som vist på fig. 3B, en sterk korrelasjon (Pearsons korrelasjon = 0,91) ble avdekket mellom Illumina dypt sekvense data og de kvantitative RT-PCR målinger indikerer robustheten av dype sekvense basert uttrykk analyse.
(A) Expression nivå LNCaP og LNCaP-AI miRNAs. Antallet hver miRNA ble plottet etter normalisering. Rød farge sirkelen viser forskjellig uttrykt mirnas mellom LNCaP og LNCaP-AI med minst to ganger endring og
p
-verdi under 0.001. (B) Solexa vs. QRT-PCR av miRNA fold-endringer.
Novel miRNA gener
En av de viktigste fordelene for high-throughput sekvensering av små RNA transkriptomet er at det gjør det mulig å oppdagelsen av potensielle nye miRNAs. For å identifisere kandidat nye mirnas i LNCaP og LNCaP-AI, vi først filtrert ut Illumina sekvens koder som er klassifisert i kommenterte kategorier, for eksempel kjente mirnas, ikke-kodende RNA, genomiske repetisjoner eller sekvenser. Vi fant ut at 235 058 og 259 454 av de små RNA sekvensen koder i LNCaP og LNCaP-AI, henholdsvis, ble avledet fra Umerket regioner av det menneskelige genom. Disse Uklassifisert kodene sammen med 100 bp flankerende sekvenser ble analysert ved MIREAP, et sofistikert verktøy som vanligvis brukes til å identifisere nye mirnas fra high-throughput sekvense data [14], [15]. På denne måten identifiserte vi 43 antatte nye mirnas fra begge bibliotek (Tabell 2 og Tabell S2): 22 i LNCaP og 31 i LNCaP-AI (Tabell 2 og Tabell S2), og bare 10 av dem er felles for begge bibliotekene
Vi har også observert at disse 43 mirnas ha et størrelsesområde på 20 til 24 nt, og lengdene av de predikerte hårnålstrukturer variere 65-98 nt, som er lik kjente humane mirnas (tabell S2) . De minste frie energier av deres forløpere varierer fra -18,20 til -67,40 kcal /mol med en gjennomsnittlig verdi på -52,70 kcal /mol. For ytterligere å validere disse nye mirnas, utførte vi sanntids RT-PCR-analyse på alle 10 nye miRNA kandidater med en normalisert sekvense frekvens større enn 10 (de andre ble ekskludert på grunn av deres lave ekspresjonsnivå og følsomheten av sanntids RT-PCR-analyse). Som et resultat, har vi lykkes validert åtte av dem (tabell 2), noe som indikerer at 80% kan valideres av en sekvenseuavhengig metode.
I sammenligning med andre mirnas i vår studie, disse nye miRNAs har en mye lavere ekspresjon nivå med en gjennomsnittlig normalisert sekvense frekvens på 45, noe som indikerer at de fleste av dem ikke kan utvise vesentlige funksjoner i prostata kreft. Blant dem, tre LNCaP-AI spesifikke mirnas utstilt relative rekkefølgen teller stort enn 10 og validert av real-time RT-PCR, impliserer deres sannsynlige engasjement i utviklingen av LNCaP-AI, og dermed fortjener ytterligere funksjonell evaluering.
Forut Mål av forskjellig uttrykt mirnas
for å utforske den biologiske funksjonen til forskjellig uttrykt mirnas identifisert i vår analyse, vi utført beregningsanalyse ved hjelp av fire uavhengige algoritmer, inkludert TargetScan, Miranda, RNAhybrid og PicTar, for identifikasjon av forventet messenger RNA mål for hver miRNA å være vesentlig forskjellig uttrykt. Tabell S3 lister spådd mål som ble støttet av minst tre av de ovennevnte fire algoritmer, der totalt 6902 gener var potensielle mål for disse miRNAs. Interessant, blant disse spådd målene, ble akt3 involvert i 11 betydelig ned uttrykt miRNAs. Akt3 koder for et medlem av serin /treonin proteinkinase-familien, som er kjent for å være involvert i en rekke forskjellige biologiske prosesser, inkludert celleproliferasjon, differensiering, apoptose, og tumorigenesis. Opp-uttrykk for akt3 i androgen-uavhengig prostatakreft cellelinjer viser at det kan bidra til mer aggressive fenotype av androgen-uavhengig prostata karsinom [19].
For å evaluere mål genet funksjoner, vi kommentert disse betinget miRNA mål med genet ontologi (GO) og KEGG ordninger med David. Forut miRNA mål befolket mange store GO kategorier, og for noen av dem, ble antall gener mål betydelig anriket (
P
0,001, med Benjamini korreksjon). De tre GO klassifikasjoner, molekylær funksjon, biologisk prosess og cellulære komponenter ble evaluert av nivå, men bare vesentlige vilkår på nivå 5 av biologisk prosess er oppført i tabell S3. Som forventet, var de fleste av de betydelige GO vilkårene knyttet til regulering av transkripsjon (f.eks GO: 0045449, GO: 0006351 og GO: 0006357). Det finnes også en rekke betydelig beriket GO kategorier, inkludert cellen morphogenesis (GO: 0000902), intracellulær transport (GO: 0046907), og apoptose (GO: 0006915). Å analysere rollen som mirnas spille i regulatoriske nettverk, tildelt vi antatte miRNA mål i KEGG trasé, og identifisert 14 av dem var betydelig anriket (
P
0,001, med Benjamini korreksjon). De fleste av disse mirnas har en tendens til å målrette gener som er involvert i signaltransduksjon og celle-kommunikasjon (tabell S4). For eksempel har vi funnet at 130 målgener (2,3%) kan være tilordnet MAPK signalveien, som er involvert i en rekke cellulære responser, inkludert genekspresjon, differensiering, proliferasjon og apoptose [20]. I prostatakreft, er MAPK signalveier generelt ansett for å fremme tumorvekst og fremveksten av hormon-refraktær sykdom [21], [22], [23].
Diskusjoner
I denne studien har vi identifisert et stort sett med mirnas som er forskjellig uttrykt underliggende utviklingen av androgen-uavhengig prostatakreft, som også ble bekreftet av QRT-PCR. Noen av disse miRNAs er godt støttet av nylig publiserte studier. Et slående eksempel kommer fra over-uttrykk for MIR-221 og MIR-222 i LNCaP-AI prøven ved en 10-20 gangers økning, hvor begge er blant de mest tallrike mirnas i LNCaP-AI cellelinje. Overekspresjon av MIR-221 eller MIR-222 i LNCaP kan redusere nivået av dihydrotestosteron indusert oppregulering av prostata-spesifikt antigen ekspresjon og øke androgen-uavhengig vekst av LNCaP-celler [9]. Flere linjer av bevis antydet at MIR-221 og MIR-222 kan ned-regulere tumor suppressor p27 i LNCaP celler og deres overekspresjon kan være en av faktorene som bidrar til utviklingen av prostata kreft [24]. Videre økt uttrykk av MIR-125b, MIR-30c, MIR-100 som vi observerte i LNCaP-AI cellelinjer ble også identifisert til å være oppregulert i fem AI Cap cellelinjer [25], og
in vitro
forsøket viste at Mir-125b kan stimulere AI vekst og ned-regulere uttrykk for BaK1 [25]. Reduksjonen av MIR-141, MIR-19b, MIR-22, MIR-29a, og Mir-29b identifisert her ble også bemerket blant de 15 mirnas som ble redusert i fire hormon-refraktær prostata karsinomer som beskrevet i Porkka et al. s microarray-basert studie [26].
Vi har også identifisert et sett av forskjellig uttrykt miRNAs, som ikke er dokumentert i prostata tumorigenesis eller AI utvikling. For eksempel, MIR-124, MIR-148b, MIR-320a og MIR-423-5p var oppregulert ved 2-14 ganger, mens MIR-29a, MIR-93, MIR-200 og MIR-1277 var ned- reguleres med 2 til 10 ganger, noe som tyder på at disse mirnas kunne utøve en rolle som tumorsuppressorgener eller onkogener i prostata kreftutvikling. Det er av interesse å merke seg at alle fem medlemmene av miRNA-200 familien (MIR-200a, MIR-200b, MIR-200C, MIR-141 og MIR-429) var signifikant nedregulert i LNCaP-AI celler. Alle disse mirnas ble også identifisert til å være ned-uttrykkes i celler som hadde gjennomgått epiteliale til mesenchymal overgang [27], som blir sett på som en viktig tidlig trinn i utviklingen av ikke-invasiv tumorceller i pasienter med metastatisk karsinom [28]. Målene for disse microRNAs ble funnet å være E-cadherin transkripsjonelle repressorer ZEB1 og SIP1, faktorer som tidligere er involvert i tumormetastase [27]. En siste studie viste at ZEB1 uttrykket kan forbedre transendothelial migrasjon i prostatakreftceller [29].
