Abstract
Den anti-kreft aktiviteter berberine (BBR) har blitt rapportert i stor utstrekning i ulike kreftcellelinjer. Men de minimale hemmende konsentrasjoner av BBR varierte sterkt mellom ulike cellelinjer og svært få studier har vært viet til å belyse dette aspektet. I denne studien anvendte vi tre cancercellelinjer, HepG2, HeLa og SY5Y, for å sammenligne den transport og distribusjon av BBR. HPLC-resultater viste at BBR var i stand til å trenge inn i alle cellelinjene, mens de kumulative konsentrasjoner var signifikant forskjellig. HepG2 celler samlet høyere grad av BBR for lengre varighet enn de andre to cellelinjene. Molekylære docking studier avslørte BBR-bindingssetet på P-glykoprotein 1 (P-gp). I tillegg er belyst vi at BBR regulert P-gp i både mRNA og proteinnivåer. BBR indusert transkripsjon og translasjon av P-gp i HeLa og SY5Y celler, mens BBR hemmet P-gp-ekspresjon i HepG2-celler. Videre studier viste at BBR regulerer P-gp uttrykk avhengig av ulike mekanismer (eller påvirkes av ulike faktorer) i ulike cellelinjer. For å oppsummere, vår studie har avdekket flere mekanistiske aspekter ved BBR forskrift om P-gp i ulike kreftcellelinjer og kanskje felle noen nyttig innsikt i bruk av BBR i anti-kreft narkotika utvikling
Citation. Pang YN, Liang YW, Feng TS, Zhao S, Wu H, Chai YS, et al. (2014) Transport av Berberine inn HepG2, HeLa og SY5Y celler: en sammenheng til sin anti-kreft effekt. PLoS ONE 9 (11): e112937. doi: 10,1371 /journal.pone.0112937
Redaktør: Dragana Nikitovic-Tzanakaki, Universitetet i Kreta, Hellas
mottatt: 21 juni 2014; Godkjent: 17 oktober 2014; Publisert: 17.11.2014
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering: Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (81374006 og 81073092) og National S T Major Spesial Project for New Drug R D Program. Kina (2012ZX09103-201-041, 2012ZX09102-201-008 og 2011ZX09101-002-11). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser. Hao Wu er ansatt av NGM Biopharmaceuticals, Inc. Det er ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Berberine (BBR), en isokinolin alkaloid kan bli isolert fra medisinplanter som
rhizoma coptidis
,
Scutellaria baicalensis Hotell og
Phellodendron amurense
. Selv om det er i hovedsak brukes til å behandle smittsomme sykdommer i tradisjonell medisinsk praksis har BBR nylig blitt undersøkt for lipidsenkende, anti-diabetes, immunmodulering, beskyttelse av iskemisk hjertemuskelen, anti-hypertensjon, anti-arytmi og anti-kreft formål i flere studier [1], [2].
Den anti-kreft effekt av BBR har blitt rapportert av mange cancercellelinjer, inkludert PC12-celler [3], melanomceller [4], bryst-kreftceller [5] , humane tarmkreftceller [6], 3T3-L1 celler [7], ikke-småcellet humane lungekreftceller [8], prostatakreftceller [9], leverkreftceller [10], cervikale kreftceller [11], etc. det er rapportert at den minimale inhiberende konsentrasjon av BBR varierte betydelig mellom forskjellige kreftcellelinjer fra 10 nM (3,73 ng /ml) i colon carcinoma celle til 400 um (149,2 ug /ml) i MHCC97-L-celler, gjennom en ukjent mekanisme [12], [13]. Tidligere studier har også vist at BBR, en klasse av alkaloid DNA interkalatorer, ble importert via en kationisk transportør. Men den intracellulære fordeling av BBR er fortsatt uklart [14]. P-gp, den mest omfattende studert medlem av ATP-bindende kassett (ABC) membran efflux transportører, er blitt identifisert som en hovedtransportør som er ansvarlig for utstrømning av BBR. Inhiberingen av P-gp ble funnet å øke den intracellulære konsentrasjonen av BBR [15]. Nyere studier har rapportert at BBR regulerer P-gp på ulike strekker seg i forskjellige cellelinjer [16]. Imidlertid har regulering av P-gp på mRNA og proteinnivåer ved BBR ikke blitt rapportert ennå.
I denne studien valgte vi tre mest brukte kreftcellelinjer, HepG2, HeLa og SY5Y å evaluere den intracellulære transport, distribusjon og utstrømming av BBR, med formål å forstå mekanismen bak de ulike reaksjoner på BBR mellom ulike cellelinjer.
Materialer og metoder
Cell kultur og cytotoksisitet analysen
HepG2 cellene gitt av Dr. Li Cao, institutt for medisinsk plante Development (IMPLAD). HeLa-celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) (Rockvill, Maryland, USA). Begge cellelinjer ble dyrket i DMEM supplementert med 10% FBS, penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 mg /ml). SY5Y celler ble gitt av Cell Bank of Institute of Fundamental Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing, Kina), dyrket i RPMI medium 1640 supplert med 10% FBS, penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 mg /ml). Celler ble dyrket ved 37 ° C under 5% CO
2 og 90% fuktighet. The IACUC (Institutional Animal Care og bruk Committee) av Tsinghua University godkjent alle protokollene som brukes i denne studien (Godkjenning ID: 2013-DuLJBBR001).
cytotoksisitet av BBR i de tre cellelinjer ble vurdert av en MTT ( 3- (4,5-dimetyl-lthiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) assay. MTT-assay ble utført i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Chai et al. [17].
Konfokalmikroskopi
Celler ble behandlet med BBR (0,5 ug /ml i vann) eller vann alene etter å ha nådd 70% konfluens [14]. Etter behandling i 12 timer ble cellene anvendt for mikroskopi avbildning. Fluorescensen av intracellulær BBR ble observert med eksitasjon ved 405 nm og emisjon ved 520 nm. Bilder ble tatt under en Zeiss LSM Meta 710 konfokalmikroskop utstyrt med argon og helium-neon laser (Carl Zeiss, Tyskland) og videre analysert av Zen 2011 Software.
Høy ytelse væskekromatografi (HPLC) analyse
et HPLC-system inneholdende et Agilent 1260 HPLC-system (1260 Quat Pumpe, 1260 DAD, 1260 ALS), og en C-18 HPLC-kolonne (150 mm x 3,9 mm, 5 um partikkelstørrelse silika, Waters, Irland) ble anvendt for å bestemme den intracellulære konsentrasjonen av BBR. En mobil fase bestående av acetonitril /vann (28/72, v /v) inneholdende 0,5% trietylamin ble pumpet gjennom kolonnen ved 0,8 ml /min. BBR ble påvist ved UV-absorbans ved en bølgelengde på 347 nm [18]. Under disse betingelser er retensjonstiden for BBR var 6,8 min. Den kvantitative lineære området var 0-5000.0 ng /ml for BBR. Standard-kurver av BBR ble trukket ved hjelp av vektet lineær regresjon av topparealet forholdsverdier for kalibreringsstandardene. Korrelasjonskoeffisienten (R
2) var 0,999.
Væskekromatografi-massespektrometer (LC /MS) analyse
En Agilent 1200/6340 LC /MS ble brukt til å kvantifisere intracellulær BBR . Intracellulær BBR ble ekstrahert ved anvendelse av metanol og ført gjennom en C-18 HPLC-kolonne (150 mm x 3,9 mm, 5 um partikkelstørrelse silika, Waters, Irland) med en hastighet på 0,2 ml /min ved 25 ° C. Den mobile fasen besto av løsningsmiddel A (10 mM ammoniumacetat, 0,1% metan- syre i vann og justere pH til 3) og oppløsningsmiddel B (acetonitril) ble anvendt for å ekvilibrere kolonnen i den følgende gradient: 15% løsningsmiddel B i 2 min, 30% løsningsmiddel B i 11 min, 90% løsningsmiddel B i 12 min, og til slutt 15% løsningsmiddel B i 5 min. Under disse betingelser er retensjonstiden for BBR var 12,6 min. BBR ble overvåket på masse /ladning ratio (m /z) fra 336,0.
Datamaskin basert docking studie
Den rapporterte krystallstrukturen av P-gp, ned fra Protein dataene Bank webside (PDB kode : 2YL2, https://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=2YL2) ble valgt som docking mal. elektrontettheten data Den ble kjøpt fra elektrontettheten Server nettsiden (https://eds.bmc.uu.se/cgi-bin/eds/uusfs?pdbCode=2YL2). Strukturen filer av protein og BBR-molekylet ble analysert ved AutoDockTools-1.5.4. Rutenettet boksen inkludert hele transmembrane domene.
nukleotid syre manipulasjon og transformasjon
Byggingen av P-gp promoter smeltet GFP uttrykk (P-gp promoter-GFP) ble generert ved hjelp av generell molekylær teknikk . Slik bytter du
Spel Hotell og
XbaI
fragment av pEGFP-N1 vektor, en 1 kb P-gp promoter ble forsterket av PCR fra en omvendt PCR av HepG2 cellen [19]. Primere som ble brukt var: 1 kB-ASEI-F: 5′-TTTATTAATCTGCAGAAAAATTTCTCCTAG og 1 kb-BamHI-R. 5′-CGCGGATCCCTGCAGGGGCTTTCCT
Denne P-gp promoter smeltet GFP konstruksjonen ble verifisert ved sekvensering og utsatt for transfektere inn HepG2 HeLa og SY5Y celler ved elektroporering separat. Celler i serumfritt medium inneholdende 20 ug DNA ble elektroporert i et electroporator (modell ECM 630, BTX). Elektroporeringsmetoden Parametrene var 250 V spenning (lav spenning modell), 1575 Ω motstand og 1000 uF kondensatorer. Celler ble pulset to ganger med 1 min intervall. Etter elektroporering ble cellene overført til 10 ml retter med 10% serum og gjenvunnet i 24 timer, etterfulgt av medikamentell behandling [20].
Kvantitativ RT-PCR
mRNA nivåer ble bestemt med SYBR green basert kvantitativ PCR kit (Tiangen, Kina). Totalt RNA ble isolert ved Trizol Total RNA Isolation Kit (Tiangen, Kina). RNA prøve av 50 ng var omvendt transkribert ved hjelp av M-MLV First Strand cDNA Synthesis Kit (TransGen, Kina). CDNA-produktene ble bekreftet ved DNA-elektroforese. Kvantitativ PCR ble utført som beskrevet tidligere [21]. Primere brukt var 5′-GCTGGATGTTTCCGGTTTGG og 5′-TTCCGTGCTGTAGCTGTCAA for P-gp, 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC og 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT for
β
aktin. 5′-GCAGAAGAACGGCATCAAGG og 5′-CGGACTGGGTGCTCAGGTAG for GFP. Syklusbetingelsene var: 94 ° C i 3 minutter; 40 sykluser ved 94 ° C i 10 sek, 60 ° C i 10 sek, 72 ° C i 20 sekunder; 72 ° C i 10 min og avkjølt til 4 ° C. Data ble bearbeidet ved anvendelse av LC-480 II-programmet (Roche, USA).
Western blot
proteinprøver ble fremstilt og benyttet for Western blotting som beskrevet tidligere [22]. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av Bio-Rad proteinanalyse reagens. Proteinprøver ble løst på 8% SDS-polyakrylamidgeler og overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, USA). Membranene ble blokkert med 5% fettfri tørrmelk i TBST (TBS-buffer inneholdende 0,05% Tween-20) i 1 time ved romtemperatur og inkubert med det primære antistoff ble fortynnet med 3% melk i TBST ved 4 ° C over natten. De primære antistoffer som brukes var mus monoklonalt anti-P-gp (1:500, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), GFP (1:3000, Abmart, Shanghai, Kina) og β-aktin (1:2000, BOOSTER Bioteknologi Wuhan, Kina). Den andre antistoff som ble brukt var geit-anti-mus HRP-antistoff (1:1000, ZSGB-BIO, Kina), etterfulgt av kjemiluminescens som beskrevet [21].
Statistisk analyse
Alle data var representert som gjennomsnitt ± SD og statistisk analysert ved anvendelse av en-veis analyse av varians (ANOVA). F Testen ble utført ved hjelp av Excel-programvare for Office 2007 (Microsoft, USA). Etter F-test, studentens
t
-test mellom to grupper ble utført. Enveis ANOVA
t
-test ble benyttet for å analysere forskjellene mellom sett av data ved hjelp av Graph Pad Prism 5.0-programvaren (Graph Pad, San Diego, USA).
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Cellular opptak av BBR
Den intracellulære fordeling av BBR er viktig for å forstå hvilken rolle BBR som et anti-kreft legemiddel. Vi anvendte tre representative cellelinjer: HepG2, HeLa og SY5Y for å analysere fordelingen BBR [23] – [26]. En ikke-toksisk dose av BBR (0,5 ug /ml) ble anvendt gjennom hele studien, basert på resultatene av analysen cytotoksisitet og letalitet kurver (fig. 1 A-F). Den konfokalmikroskop avbildet BBR distribusjon i levende celler (fig. 2A), avsløre at BBR kan angi HepG2, HeLa og SY5Y celler innen 1 time etter behandling (fig. 2B, C). Flertallet av BBR var i cytoplasma, og ingen åpenbare atom innlegget ble observert. Tidligere rapporter har vist BBR angi kjernen og konkurrere med TBP (TATA Box Binding protein) for TATA Box i PC12 cellen [14]. Men vi kunne ikke observere kjernen fordeling av BBR i disse tre kreftcellelinjer.
(A-F) for cytotoksisitet og letalitet av BBR ved hjelp av MTT-analyse. (A, B) HepG2, (C, D) HeLa. (E, F) SY5Y. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0.005, statistisk signifikans av BBR behandlet grupper i forhold til kontrollgrupper. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. fra seks uavhengige eksperimenter (n = 6).
(A-I) Bilder av den subcellulære beliggenheten av BBR i celler før og etter 0,5 ug /ml BBR administrasjon i 1 time. (A-C) HepG2-celler; (D-F) HeLa-celler; (G-I) SY5Y celler. Fluorescens BBR vises i grønt, differensial interferens kontrast (DIC) Tallene representerer omfanget av celler og skala bar er 10 mikrometer.
Så brukte vi HPLC og LC /MS for å kvantitativt analysere intracellulære konsentrasjonen av BBR i HepG2, HeLa og SY5Y celler etter cellular oppføring. Resultatene viste at BBR effektivt kan separeres og påvises ved hjelp av HPLC under de angitte betingelser (Fig. 3A-C). Standard-kurver av BBR viste et sterkt signal-til-støy-forhold og et godt lineært forhold (R «sup> 2 = 0,999) mellom topparealet og konsentrasjonen av BBR (Fig. 3D). Det var forskjeller i opptak av BBR mellom de tre cellelinjer. HPLC-analyse viste at i HepG2 celler, BBR maksimumskonsentrasjon (C
max) var på omkring 2188,8 pmol /mg ved omtrent 12 timer etter behandlingen (fig. 3E). C
maks BBR i HeLa og SY5Y var 357,8 pmol /mg og 65,5 pmol /mg, henholdsvis (fig. 3F, G). Etter tre timer, konsentrasjonene av BBR i HeLa og SY5Y celler kom ned. Det er vist at BBR ble akkumulert i høyere nivå i HepG2 celler enn de andre.
(A-C) HPLC-kromatogrammer. (A) Standard BBR; (B) Blank prøven fra BBR behandlede celler; (C) Prøver fra celler med BBR administrering i 12 timer. (D) Standardkurver av BBR konsentrasjon vers AU intensitet ved hjelp av HPLC-analyse. (E-G) Kinetisk atferd av BBR i cellene i plottet med den administrasjonstid i 24 timer. (E) HepG2; (F) HeLa; (G) SY5Y celler. (H, I) LC /MS-kromatogrammer av BBR i HepG2-celler etter tilførsel i 24 timer. (H) massespektrum av BBR; (I) kromatogrammet av BBR. Standard BBR ble vist i grønt; ble prøven er vist i purpur farge. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. fra seks uavhengige forsøk (n = 6).
I tillegg til å forstå om høyere BBR konsentrasjon i HepG2 celler skyldes rollen HepG2 i aktivt metabolizing BBR, setter vi opp LC /MS for å analysere produktene av metabolitten BBR i cellene. Som rapportert, er det metabolitten produkter av BBR etter oral eller injeksjon opptaket hos rotter [27]. Vi har imidlertid ikke oppdage noen av dem i HepG2 celler (fig. 3 H, I), noe som tyder på BBR forble intakt i HepG2 celler [28].
P-gp er en stor effluks transportør av BBR
for å validere den rollen av P-gp i utstrømningen av BBR i HepG2, HeLa og SY5Y celler, en selektiv P-gp-hemmer, Zosuquidar (LY335979, Selleckchem, USA) ble benyttet [29], [30]. Som vist på fig. 4, Zosuquidar øket effektivt konsentrasjonen av BBR i HepG2, HeLa og SY5Y-celler, noe som antyder at P-gp er en viktig BBR sekretoriske transportøren i disse cellene. Disse resultatene var i god overensstemmelse med tidligere studier [28], [31].
Celler ble behandlet med 0,5 ug /ml BBR og 0,3 umol Zosuquidar, den inhibitor av P-gp-aktivitet, i 12 timer. De intracellulære konsentrasjonene av BBR ble bestemt ved HPLC-analyse. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3). . *
v.s
kontroll,
P
0,05. **
vs
kontroll,
P
0,005,
t
-test
Molecular dokking av BBR til P-gp.
Vi videre analysert samspillet av P-gp og BBR av databasert molekylær dokking. Krystallstrukturen til human P-gp har blitt identifisert fra databasen av NCBI. Vi utnyttet derfor den samme struktur som reseptor for å utføre molekyl dokking av BBR. Resultatene antydet at BBR var i stand til å binde til stoffet binding-lomme av P-gp (fig. 5A, B). Bindingssetet av BBR ble plassert i «nedre» del av bindende lommen (fig. 5C, D). Glide energi er -9,1 kcal /mol, noe som tyder på høy bindende affinitet BBR til P-gp.
(A) Side og (B) riss av BBR bindende lommen på P-gp. (C, D) de samlede tilkoblings utsikt over BBR i bindingen lommen på P-gp. Blå mesh: protein er elektron isodensity kartet rundt bindingssetet. Protein er representert som tegnet (transparens = 20%), små molekyler og viktige aminosyrer (som er merket) er representert som linjer (hvit og grønn, karbon. Rød, oksygen. Blå, nitrogen). Gul stiplet linje, hydrogen obligasjon.
BBR påvirker P-gp uttrykk
For å belyse hvorvidt BBR regulerer P-gp uttrykk, vi undersøkte mRNA og protein uttrykk nivåer av P-gp i HepG2, HeLa og SY5Y celler etter BBR behandling. Resultatene viste at mRNA av P-gp ble øket i HeLa og SY5Y-celler, mens redusert i HepG2-celler på en doseavhengig måte etter BBR behandling (Fig. 6A). Videre Western blot-analyse bekreftet disse resultater viser at BBR øket P-gp-ekspresjon i HeLa og SY5Y-celler, men redusert ekspresjon i HepG2-celler (fig. 6B, C).
(A) mRNA-uttrykk endogen P-gp ved hjelp av real-time PCR-analyse. (B) Western blot-analyse viste endring av P-gp-protein med BBR behandling. (C) Forholdet endringer av P-gp versus β-aktin. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. fra 3 uavhengige eksperimenter (n = 3). Konsentrasjonen av BBR var 0,5 ug /ml. *
v.s
kontroll,
P
. 0,05; . **
v.s
kontroll,
P
0,005,
t
-test. For paneler i (A) og (C), Venstre, HepG2; Middle, HeLa; Høyre, SY5Y.
Hvordan BBR regulerer P-gp uttrykket er ukjent. For å bestemme effekten av BBR på P-gp transkripsjonsinitiering, var en P-gp 1 kb-promoteren sammensmeltet GFP konstruert (fig. 7A) og transfektert inn i de tre cellelinjene [19]. Disse cellene ble behandlet med eller uten BBR og etterfulgt av flowcytometri utvalg og RT-PCR-analyse (fig. 7B-D). RT-PCR-resultater viste at BBR har ingen regulering rolle i promotoren aktiviteten av P-gp. Dessuten protein ekspresjonsnivået av GFP ble ikke påvirket av BBR i henhold til Western blotting resultater i fig. 7E-H. Siden GFP ble smeltet sammen med P-gp promoter i plasma, og det er ikke til stede i pattedyrceller, GFP protein uttrykk data viste at BBR ikke kunne handle på P-gp arrangøren på karakterutskriften nivå.
(A ) Skjematisk kart over P-gp 1 kb promoter smeltet GFP (P-gp promoter-GFP) konstruere. Svart, P-gp promoter. Green, leseramme av EGFP. (B-D) mRNA uttrykk for P-gp 1 kb-promoteren sammensmeltet GFP i nærvær eller fravær av BBR ved sanntids-PCR-analyse. (B), HepG2; (C), HeLa; (D), SY5Y. (E) Western blotting-analyse viste endring av P-gp 1 kb-promoteren sammensmeltet protein med GFP BBR behandling. (F-H) Forholdet forandringer av GFP versus β-aktin. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. fra 3 uavhengige eksperimenter (n = 3). «
ns»
betyr ingen statistisk signifikans.
Diskusjoner
Formålet med denne studien er å forstå samspillet mellom BBR, en potent anti-kreft sammensatte, og P-gp, en utbredt legemiddelutstrømningen transporter. Tidligere studier viste at ved en konsentrasjon på 0,5 ug /ml BBR var effektive i å beskytte dyrkede nerveceller fra skade etter oksygen og glukosemangel [22], og vi bekreftet det ikke føre til noen skade på HepG2, HeLa eller SY5Y-celler basert på MTT-analysen . I vår nåværende arbeid, observerte vi inngangen til BBR av konfokalmikroskop og registrert den dynamiske opphopning av BBR å bruke HPLC og LC /MS. Resultatene viste betydelige forskjeller mellom de tre cellelinjer, HepG2 samlet mer BBR for lengre varighet enn de andre to cellelinjene. Ved LC /MS-analyse, har vi funnet at det var ingen metabolitter av BBR i HepG2-celler etter BBR administrering, noe som indikerer den høye konsentrasjonen av BBR i HepG2-celler er bare BBR seg selv. Derfor konkluderte vi med at HepG2 kunne akkumulere mer BBR og holde det for en lengre tid i cellene.
Som litteraturen rapportert [15], er P-gp hovedsakelig ansvarlig for utstrømningen av BBR. Derfor anvendte vi en spesifikk inhibitor av P-gp, som effektivt blokkerte utstrømningen av BBR og økt BBR konsentrasjon i HepG2-celler. En spesifikk binding lomme av P-gp for BBR ble åpenbart i den molekylære forankrings prediksjon. Dette delvis forklares området gjennom hvilken BBR kan påvirke evnen av P-gp i mediering BBR utstrømning, selv om en detaljert mekanisme for å korrelere disse to fenomener (binding av BBR og effluks effektiviteten av P-gp) er fortsatt ukjent.
Ved å benytte molekylærbiologiske og biokjemiske metoder, vi målte nivåene av mRNA og protein av P-gp i celler etter behandling BBR. Resultatene viste at BBR indusert mRNA og protein uttrykk for P-gp i HeLa og SY5Y-celler, og følgelig fremmes utstrømningen av BBR og reduserte konsentrasjonen av intracellulær BBR. Disse resultatene kan forklare den observasjon at den intracellulære konsentrasjonen av BBR nådde en topp og redusert svært raskt i disse cellene. Imidlertid reduserte P-gp uttrykk med økende konsentrasjoner av BBR i HepG2-celler, som var i god overensstemmelse med det faktum at den intracellulære konsentrasjonen av BBR kontinuerlig bygget opp i HepG2-celler.
Som vist i fig. 6 og fig. 7, mRNA og protein uttrykk for P-gp i HeLa og SY5Y celler var oppregulert etter BBR administrasjon, mens mRNA uttrykk av P-gp i promoter transfektert i cellene ikke var oppregulert. Hvis du vil kontrollere resultatet, utførte vi en supplerende eksperiment ved hjelp GFP protein uttrykk. Resultatene viste GFP protein uttrykk ikke var oppregulert etter BBR administrasjon, støtte de mRNA uttrykk data av P-gp i promoter transfektert i HepG2, HeLa og SY5Y celler. Siden det er ingen GFP protein i pattedyrceller, GFP protein expression data sterkt støtte at BBR ikke handlet på arrangøren av P-gp.
BBR ble rapportert å øke biotilgjengeligheten av flere forbindelser ved å hemme P- gp i Caco-2 tarmceller [16]. Det også fremmet ekspresjonen av P-gp i multimedikamentresistens av cancerceller, inkludert oral (KB, OC2), mage (SC-M1, NUGC-3) og kolon (COLO 205, CT 26) cancerceller [32], [33 ], noe som tyder på kompleksiteten i forholdet mellom BBR og P-gp i forskjellige celler.
Siden BBR ikke kunne gå inn i kjernen, er det ikke sannsynlig at BBR har noen virkning på DNA /gensekvenser, som fører til ingen effekt av BBR på P-gp promoter transkripsjon. Kombiner med de forskjellige P-gp uttrykk mønstre indusert av BBR, spår vi at effekten av BBR på P-gp uttrykk bør skje etter gentranskripsjon, for eksempel mRNA og protein stabilitet, eller protein posttranskripsjonelt modifikasjon. Anvendelse av P-gp-hemmer drastisk hemmet P-gp sin oppgave å transportere BBR i de tre cellelinjer, noe som indikerer at det ikke er noen forskjeller mellom funksjonen av P-gp-protein i cellene. Dette tyder på at det kan være forskjellige cellulære faktorer for P-gp-protein ekspresjon i celler og samspill mellom BBR, P-gp og forskjellige signaloverføringsveier kan være drastisk forskjellig i forskjellige kreftcellelinjer, noe som resulterer i en annerledes responsen av tumor celler til BBR. Dette krever videre studier.
Konklusjoner
I sammendraget, er dette den første rapporten om hvordan BBR regulert P-gp-aktiviteter blant HepG2, HeLa og SY5Y kreftcellelinjer. P-gp kombinerer med BBR for å ivareta BBR, og samtidig BBR forstyrrer P-gp uttrykk for å regulere sin egen utstrømming fra cytoplasma. BBR induserte ekspresjonen av P-gp i HeLa og SY5Y-celler, men inhiberte ekspresjon av P-gp i HepG2 celler, sannsynligvis forårsaket av forskjellige mønstre av P-gp proteintranslasjon. Det var ikke noe direkte regulering av P-gp-promoteren transkripsjon, hvilket indikerer forskjeller i regulering og /eller mekanismer som finnes i HepG2-celler og HeLa og SY5Y-celler. Forskjellene mellom de tre cellelinjer som er angitt i denne studien kan hjelpe oss å forstå kreftceller evner til opptak og transport anti-kreft narkotika, også hjelpe i kunnskapen om mulige narkotika resistensmekanismer.
Takk
Vi takker alle kolleger i vårt laboratorium. Vi takker Dr. Yu Tian, Drug Discovery Facility av Tsinghua University, for ved hjelp av LC /MS deteksjon.
