Abstract
Protein kinase CK2 har ulike funksjoner fremme og opprettholde kreft fenotyper. Vi undersøkte effekten av CK2-inhibering i lungekreftceller med T790M-mediert resistens mot EGFR-TK-inhibitor. Resistente underlinjer av PC-9 til gefitinib (PC-9 /GR) og erlotinib (PC-9 /ER) ble etablert av tidligere studie, og T790M sekundær mutasjonen ble funnet i begge resistente underlinjer. En reduksjon av EGFR ved siRNA behandling effektivt kontrollert vekst av resistente celler, og dermed tyder på at de fortsatt har EGFR-avhengighet. CX-4945, en potent og selektiv CK2 inhibitor, indusert autofagi i PC-9 /GR og PC-9 /ER, og som ble støttet av induksjon av autophagic vakuoler og microtubule-assosiert protein en lett kjede 3 (LC3) uttrykk, og økningen av punktat fluorescerende signaler i resistente celler pre-transfektert med grønt fluorescerende protein (GFP) -tagged LC3. Men tilbaketrekning av CX-4945 førte til utvinning av kreftceller med autofagi. Vi har funnet at induksjon av autophagy ved CX-4945 i begge resistente celler ble CK2 avhengig ved hjelp av små interfererende RNA mot CK2. Behandlingen med CX-4945 alene induserte en minimal veksthemming i resistente celler. Imidlertid kombinert behandling av CX-4945 og EGFR-TKI effektivt hemmet kreft-celleproliferasjon og apoptose. CX-4945 økte translokasjon av EGFR fra celleoverflaten inn i autophagosome, deretter fører til reduksjon av EGFR, mens hemming av autophagy ved 3mA eller Atg7 målrettet siRNA forbehandling reduserte reduksjon av EGFR ved CX-4945. Følgelig, apoptose ved en kombinasjon av CX-4945 og EGFR-TKI ble undertrykket ved 3mA eller Atg7 målrettet siRNA forbehandling, således som tyder på at autophagosome-mediert EGFR nedreguleringen vil ha en viktig rolle med hensyn apoptotisk celledød av EGFR-TKI. Kombinert behandling av CK2 hemmer og EGFR-TKI kan være en lovende strategi for å overvinne T790M-mediert motstand
Citation:. Så KS, Kim CH, Rho JK, Kim SY, Choi YJ, Song JS et al . (2014) Autophagosome-mediert EGFR nedregule indusert av CK2 Inhibitor Forbedrer effekten av EGFR-TKI på EGFR-Mutant Lung Cancer Celler med Resistance av T790M. PLoS ONE 9 (12): e114000. doi: 10,1371 /journal.pone.0114000
Redaktør: Spencer B. Gibson, University of Manitoba, Canada
mottatt: 02.08.2014; Godkjent: 02.11.2014; Publisert: 08.12.2014
Copyright: © 2014 Så et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av et stipend av den koreanske Health Technology R D Project, Ministry of Health Velferd (HI12C1146000013) og et tilskudd (2011-0529) fra Asan Institute for Life Science, Seoul, Sør-Korea. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Målrette epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) med små-molekyl, tyrosinkinasehemmere har blitt en viktig terapeutisk strategi for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) med EGFR mutasjon. Etter å ha bekreftet overlevelsesgevinst sammenlignet med konvensjonelle cytostatika [1], [2], EGFR-TKI er godkjent som første-linje agenter. Men til tross for utgangspunktet bemerkelsesverdig respons, ervervet resistens slutt utvikler seg, og dermed begrense median responsvarighet på under ett år [3], [4]. Omtrent halvparten av motstanden er forårsaket av en andre stedet mutasjon i posisjon 790, nemlig T790M [5], [6]. Den plasskrevende metioninrest i T790M kan hindre binding av medikamentet eller den økte ATP affinitet på ATP-bindende lomme, og således minimalisere legemidlets effekt [5], [7].
Andre generasjon EGFR-TKI , slik som BIBW2992 (afatinib) og PF00299804 (dacomitinib), har blitt anbefalt for å overvinne den T790M-mediert resistens med tanke på at disse potente, irreversible EGFR-TKI ikke lenger konkurrere med ATP etter at de er blitt kovalent bundet til kinasedomenet [ ,,,0],8], [9]. Det er imidlertid usikkert om irreversible EGFR-TKI kan overvinne motstanden skyldes T790M som noen foreløpige resultater fra pågående kliniske studier har vært ganske skuffende i forhold til å overvinne motstanden, men mer vellykket, progresjonsfri overlevelses kunne oppnås når det brukes som første-linje agent i forhold til reversibel EGFR-TKI [10], [11]. Derfor vil ytterligere klinisk undersøkelse være nødvendig for å tilveiebringe mer effektive strategier Vinne.
Proteinkinase CK2 er en konstitutivt aktiv og svært konservert, allestedsnærværende serin /treonin-kinase som er involvert i en rekke cellesignalisering relatert til cellesyklus, proliferasjon, apoptose og [12] – [14]. Avvikende CK2 uttrykk og aktivitet er rapportert i mange menneskelige sykdommer, inkludert kreft [15]. Overekspresjon av CK2 demper apoptose av kreftceller, mens dens nedregulering forbedrer celledøden forårsaket av medikament eller bestråling, og således antyder dens viktige regulerende rollen til fastsettelse av kreftcelle skjebne [16] – [19]. CK2-avhengig fosforylering av Cdc37 er nødvendig for chaperoning funksjon av HSP90 på en rekke klient oncoproteiner, inkludert CK2, selv [20]. Fordi HSP90 er essensiell for modning oncoproteinet og stabilitet, er overlevelsen av kreftceller kritisk avhengig av sin rette funksjon, således som tyder på at kontrollen av HSP90 direkte eller indirekte gjennom hemming av CK2 ville være lovende for behandling av kreft. I tillegg kan CK2 regulere EGFR og dens nedstrøms signalering, spesielt aktiviteten av medlemmer av PI3K-Akt-mTOR veien [21] – [24]. Inhiberingen av denne reaksjonsvei er blitt vist å forsterke virkningen av EGFR-inhibitorer [25].
I denne studien undersøkte vi aktiviteten av CX-4945, en selektiv og potent CX-2-inhibitor, på EGFR mutante lungekreftceller med T790M mutasjon fører til motstand mot EGFR-TKI. Det ble også undersøkt om det kan forsterke effekten av EGFR-TKI for å overvinne motstanden.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
Gefitinib /Erlotinib- resistente cellelinjer (PC-9 /GR og PC-9 /ER) ble etablert i en tidligere studie [26]. Celler ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) inneholdende 10% føtalt bovint serum, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære. Den MTT løsningen ble kjøpt fra Sigma (St Louis, MO, USA). Gefitinib, Erlotinib, 17-DMAG, CX-4945, og 3mA ble kjøpt fra Selleck Chemicals Co. Ltd (Houston, Texas, USA).
Cell overlevelsesanalyser
For å utføre MTT-analyse ble cellene sådd ut i 96-brønners sterile plastplater. Celler ble utsatt for varierende doser av CX-4945. Etter 72 timer og 15 ul av MTT-løsning (5 mg /ml) ble tilsatt til hver brønn og platene ble inkubert i 4 timer. Krystallinsk formazan ble oppløst med 100 mL av en 10% (vekt /volum) SDS-løsning i 24 timer. Absorbans ved 595 nm ble avlest spektrofotometrisk ved anvendelse av en mikroplateleser. For å validere den kombinerte effekten av CX-4945 eller EGFR avhengighet, ble cellene behandlet med CX-4945, EGFR-TKI, en kombinasjon av CX-4945 og gefitinib eller erlotinib eller EGFR målrettet siRNA i de angitte tidsrom. Celleviabilitet ble bestemt ved hjelp av en ADAM-MC automatisk celleteller (NanoEnTek, Seoul, Korea) i henhold til produsentens instruksjoner.
Western blot analyse
Hele cellelysater ble utarbeidet etter EBC lysis buffer ( 50 mM Tris-HCl [pH 8,0], 120 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA og 0,3 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 0,2 mM natriumortovanadat, 0,5% NP40, og 5 U /ml aprotinin) og ble deretter sentrifugert. Den resulterende supernatant (20 pg) ble separert på 8% til 12% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Invitrogen). Membranene ble blokkert ved anvendelse av 5% skummet melk-PBS-0,1% Tween 20 i en time ved romtemperatur før de ble inkubert over natten med primære antistoffer som er spesifikke for p-CK2α som ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO, USA) og CK2α hvilken ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, UK). p-EGFR (Tyr1173), EGFR, Caspase-3, Akt, p-Erk, Erk, og β-aktin ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). P-Akt (Ser473), kløyvde PARP (Asp214), Atg7 og LC3 ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Berverly, MA, USA). Pepperrot-peroksidase-konjugert antistoff ble brukt som sekundære antistoffer. Membraner ble utviklet ved hjelp av ECL-sett (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).
Acridine oransje flekker
Autophagy ble analysert ved farging celler med vital fargestoff, acridinoransje (Sigma, St. Louis, MO). Cellene ble trypsinert og ble inkubert med akridinorange ved en endelig konsentrasjon på 5 pg /ml i 30 minutter ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære. Analyser ble utført på en FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Dataene ble analysert ved hjelp av Cellquest-programvare (Becton Dickinson). Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter, og at feilfeltene betegne standardavvik (SDS).
LC3-GFP uttrykk
Celler ble transfektert med et plasmid, pEGFP-LC3 vektor (Addgene Inc., Cambridge, MA, USA) og ble dyrket i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med CX-4945 i 24 timer. De punctate mønstre av LC3 i transfekterte celler ble undersøkt ved fluorescens mikroskopi.
apoptose analysen
Apoptose ble kvantifisert ved hjelp av Annexin V-FITC apoptose kit (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) i samsvar med produsentens anvisninger. I korte trekk ble cellene trypsinert, pelletert ved sentrifugering, og resuspendert i Annexin V bindingsbuffer (150 mM NaCl, 18 mM CaCl
2, 10 nM HEPES, 5 mM KCI, 1 mM MgCl
2). FITC-konjugert Annexin V (1 pg /ml) og propidiumjodid (50 ug /ml) ble tilsatt til cellene som ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur i mørke. Analyser ble utført på en FACScan (Becton Dickinson). Dataene ble analysert ved hjelp av Cellquest-programvare (Becton Dickinson). Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter, og at feilfeltene betegne standardavvik (SDS).
Små interfering RNA transfeksjon
Liten interfering RNA (siRNA) oligonukleotider spesifikke for EGFR, Atg7, CK2α og siRNA kontroll ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz). Celler ble sådd ut i en 60 mm skål, som deretter fikk stå i 24 timer. En 2 mL alikvot av siRNA-løsning (10 uM) og 5 ul av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ble hver blandet med 100 ul serumfritt RPMI 1640 medium. De ble inkubert i 20 minutter ved værelsestemperatur etter å kombinere de to blandinger, og dette ble deretter tilsatt til cellene som var blitt sådd på fatet. Etter 24 timer ble cellene høstet underkastet Western blot-analyse. Celler ble også behandlet for cellenes levedyktighet og apoptose analyse.
Konfokalmikroskopi
Cellene ble dyrket i et kammer lysbilde i nærvær eller fravær av CX-4945 i 48 timer. De ble fiksert i 10 minutter med kald metanol og deretter vasket tre ganger med PBS. Cellene ble inkubert med anti-EGFR (Santa Cruz, 01:50) og LC3 (cellesignalisering, 1:100) over natten ved 4 ° C. Sekundær antistoff inkubasjon inkludert 1:100 fortynning av enten Alexa Fluor 488 anti-mus eller Alexa Fluor 568 anti-kanin antistoffer. Kjerner ble farget med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), og ble deretter vasket og dekk-gled. Lysbilder ble vist under en LSM710 konfokal laser scanning mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland), og bildene ble fotografert.
Resultater
CX-4945 induserer autofagi i gefitinib /erlotinib fast PC -9 celler
Noen studier har rapportert at CX-4945 førte til en hemming av spredning i humane kreftceller [15], [24]. For å undersøke hvorvidt CX-4945 kan hemme veksten av lungekreftceller med T790M-mediert resistens mot EGFR-TKI, ble cellene behandlet med CX-4945 på en doseavhengig måte. Som vist på fig. 1A, gjorde CX-4945 behandlingen ikke viser en betydelig veksthemming i gefitinib /erlotinib-resistente celler. Men vi fant ut at CX-4945 behandling utløst opphopning av autophagic vakuoler (AV), mens disse cellene ble restaurert til sin tidligere tilstand etter seponering (Fig. 1B). For ytterligere å bekrefte induksjon av autophagy ved CX-4945, analyserte vi ekspresjon av autophagy markør, LC3-II, og antallet celler farget med acridin oransje ved å utføre Western blotting og FACS-analyse. I samsvar med induksjon av autophagic vaculoles viste CX-4945 behandling en sterk økning i mengden av endogen LC3-II og i prosentandelen av akridinorange-positive celler (Fig. 1C og D). I tillegg CX-4945 behandling utstilt karakteristisk punctate mønster av LC3, mens kjøretøy-behandlede celler viste diffus og svak LC3-assosiert grønn fluorescens (fig. E). Dette CX-4945-indusert autofagi ble også observert i foreldre PC-9 celler (data ikke vist). Disse resultatene viste at cx-4945 har evnen til å utløse induksjon av autophagy i parentale celler, så vel som gefitinib /erlotinib-resistent PC-9-celler.
A, Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av CX-4945 i 72 timer, og graden av inhibering ble bestemt ved MTT-analyse. B, Celler ble behandlet med eller uten CX-4945 (5 mM) i 48 timer og ble deretter inkubert i 24 timer med et medikamentfritt medium inneholdende 10% FBS. Bilder som viser autophagic vakuole formasjonen (AVOS) ble tatt ved × 20 forstørrelse. C og D, Celler ble behandlet med CX-4945 i 48 timer. Cellelysater ble utsatt for Western blot-analyse. Kvantitativ påvisning av sure vesikulær organeller ved akridin orange farging av celler ble bestemt ved FACS-analyse. * P 0,01 og ** p 0,001 sammenlignet med kontrollgruppen. E, Celler ble transfektert med et plasmid for å uttrykke LC3-GFP. Etter 24 timers transfeksjon, ble cellene behandlet med CX-4945 (5 mM) i 24 timer. Punktat mønster av LC3 lokalisering analysert ved immunfluorescens mikroskopi. F og G, Celler ble inkubert med CX-4945 (5 pM), 17-DMAG (100 nM) eller rapamycin (20 uM) i 48 timer. Bildene ble tatt ved × 20 forstørrelse. Induksjon av LC3-I /II ble vist ved Western blot analyse.
HSP90 er viktig for mange teinene modning og stabilitet inkludert CK2α [20]. I tillegg chaperoning funksjon av HSP90 kreves fosforylering av Cdc37 ved CK2α [27], [28]. For ytterligere å vurdere om HSP90 var involvert i CX-4945-indusert autofagi, ble cellene behandlet med 17-DMAG, HSP90 inhibitor. Som vist på fig. 1F og G, gjorde hemming av HSP90 ikke vise induksjon av autophagy. Selv om celler ble behandlet med samme dose av hvert medikament, CX-4945-indusert autofagi var mer potent enn rapamycin, en mTOR-hemmer.
Selv om CX-4945 har selektivitet for CK2, kan det hemme andre kinaser, slik som FLT3, PIM1, og CDK1. Derfor undersøkte vi om CX-4945-indusert autofagi er avhengig av CK-2. I samsvar med resultatet av CX-4945 behandling, undertrykkelse av CK2α induserte bare en minimal vekst-inhibering, mens det resulterte i økning av autophagic vaculoles og endogen LC3-II (fig. 2). Dette resultat antydet at CX-4945-indusert autofagi kan være CK2-avhengig.
A og B, ble celler transfektert med kontroll eller CK2α siRNA (100 nM) i 48 timer. Celle tall ble bestemt med en ADAM-MC automatisk celleteller. Bilder som viser autophagic vakuole formasjonen (AVOS) ble tatt ved × 20 forstørrelse. * P 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen. C, etter 48 timer transfeksjon, CK2α og LC3-I /II ble vist ved Western blot analyse.
CX-4945 forsterker effekten av EGFR-TKI i gefitinib /erlotinib-resistente celler
forholdet mellom induksjon av autophagy og sensitiviteten til EGFR-TKI har vært kontroversielt [29] – [32]. Bestemme hvorvidt CX-4945-indusert autofagi kan påvirke følsomheten til EGFR-TKI, ble cellene behandlet med CX-4945, EGFR-TKI eller en kombinasjon av begge i 48 timer. Kombinasjonen av CX-4945 og gefitinib eller erlotinib ført til betydelig veksthemming, mens CX-4945-indusert autofagi ble redusert i kombinert behandling (fig. 3A). Videre er kombinert behandling med EGFR-TKI og CX-4945 indusert caspase-3 og PARP-1-spaltningssetet, og dermed fører til økt celledød (fig. 3B og C).
Celler ble behandlet med CX-4945 ( 5 uM), gefitinib (1 uM), og erlotinib (1 uM), eller en kombinasjon av CX-4945 og gefitinib eller CX-4945 og erlotinib i 48 timer. A, Cell tallene ble bestemt ved hjelp av en celleteller (øvre panel). Kvantitativ påvisning av sure vesikulær organeller ved akridin orange farging av celler ble bestemt ved FACS-analyse (nedre panel). † p 0,01 sammenlignet med CX-4945 alene. B, Apoptose ble bestemt ved Annexin V-FITC /propidiumjodidfarging og flowcytometri. Diagrammer av Annexin V-FITC /propidiumjodid- flowcytometri i et representativt eksperiment presenteres på venstre panel. Resultatene er representative for minst 3 uavhengige eksperimenter, og feilstolpene betegne ± standardavvik (SDS). C, Spalting av PARP-1 og caspase-3, ble vist ved Western blot-analyse. * P 0,01 og ** p. 0.001 sammenlignet med kontrollgruppen
For å undersøke mekanismen som CX-4945 restaurert antitumor aktiviteter EGFR-TKI i resistente celler, vi først undersøkte avhengighet av EGFR-signalisering i begge typer av resistente celler. Selv om effekten for å ned-regulere EGFR var forskjellig, var veksten av både resistente celler inhiberte signifikant siRNA ved behandling, og således antyder at de vedvarende EGFR avhengighet til tross for T790M-mediert resistens (fig. 4A og B). Vi neste observerte aktivitetene til EGFR og nedstrøms molekyler når cellene ble utsatt for hvert medikament. Den hemmende effekten av en enkelt behandling med CX-4945, gefitinib eller erlotinib på EGFR og Akt aktiviteter var beskjeden, mens kombinasjonen av CX-4945 og gefitinib eller erlotinib helt redusert EGFR og Akt aktivitet (fig. 4C). Behandling med CX-4945 indusert den nedregulering av den totale EGFR som sett i siRNA behandling. Disse resultater antyder at tilsetningen av CX-4945 til EGFR-TKI kan overvinne T790M-mediert motstanden gjennom økt aktivitet av EGFR-TKI å undertrykke EGFR signaler ved nedregulering av EGFR.
A og B, kontroll og EGFR sirnas (100 nM) ble innført i paren eller resistente celler, og EGFR undertrykkelse ble bekreftet ved Western blot-analyse. Cellelevedyktigheten ble målt ved anvendelse av en celleteller 72 timer senere. * P 0,01 og ** p 0,001 sammenlignet med kontrollgruppen. C, Cellene ble behandlet med medikamenter som i fig. 2. Cellene ble høstet, og modulering av EGFR-signalering i de angitte cellelinjer ble oppdaget av Western blot analyse.
Hemming av CX-4945-indusert autofagi demper apoptose i gefitinib /erlotinib bestandig celler
Vi observerte at CX-4945 behandling førte til nedregulering av EGFR. For å bestemme hvorvidt induksjon av autophagy er assosiert med nedregulering av EGFR, ble endringene i EGFR lokalisering bekreftet ved konfokal mikroskopi ved bruk av anti-EGFR og anti-LC3 antistoff konjugert til fluoroforen. Som vist på fig. 5A, CX-4945 behandling viste en økning inLC3 /EGFR samlokalisering. Disse resultater viser at CX-4945-indusert autofagi kan innfange EGFR fra plasmamembranen inn i autophagosome og at fanget proteiner kan bli degradert ved lysosomet.
A, PC-9 /ER-celler ble behandlet med CX-4945 ( 5 uM) i 48 timer og deretter ble fiksert med metanol, immunofarget med anti-LC3 (rød), anti-EGFR (grønn), og DAPI (blått), og analysert ved konfokal mikroskopi for å bestemme den intracellulære lokalisering av EGFR. B, Den undertrykkelse av Atg7 ved siRNA behandling ble påvist ved Western blot-analyse. PC-9 /ER-celler ble behandlet med CX-4945 (5 mM) i 48 timer i nærvær eller fravær av 3mA (2 mM) og Atg7 siRNA (100 nM). Modulering av EGFR ble påvist ved Western blot-analyse. C og D, Celler ble behandlet med medikamenter som i fig. 2 under nærvær eller fravær av 3mA og Atg7 siRNA. Spalting av PARP-1 og caspase-3, ble vist ved Western blot-analyse. Apoptose ble bestemt ved Annexin V-FITC /propidiumjodidfarging og flowcytometri. Resultatene er representative for minst 3 uavhengige eksperimenter, og feilstolpene betegne ± standardavvik (SDS). * P 0,01 og ** p. 0.001 sammenlignet med kombinasjonen av CX-4945 og gefitinib eller erlotinib
For ytterligere å undersøke om CX-4945-indusert autofagi fører direkte til nedregulering av EGFR, evaluerte vi nivået av EGFR i nærvær eller fravær av autophagic inhibitor (3-metyladenin, 3mA) og Atg7 siRNA behandling. Antallet autophagosomes var betydelig lavere i pre-behandlede celler med 3 mA (data ikke vist), og 3mA eller Atg7 siRNA behandling restaurert aktiviteter samt det totale nivået av EGFR (Fig. 5B). Videre er inhiberingen av autophagy ved 3mA eller undertrykkelse av Atg7 redusert caspase-3 og PARP-1-spaltningssetet og dermed ført til reduksjon av celledød ved apoptose (Fig. 5C og D). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at induksjon av autophagy av CX-4945 kan ha en viktig rolle i å overvinne T790M-mediert resistens mot EGFR-TKI.
Diskusjoner
Undersøkelser for å gi effektive strategier for vinne T790M-mediert resistens er meget viktig, ettersom de fleste av pasientene som ble behandlet med EGFR-TKI ervervet resistens og T790M var årsaken til motstanden i halvparten av disse pasientene [5], [6]. Som andre generasjon, irreversible EGFR-TKI, som afatinib og dacomitinib, klarte ikke å overvinne motstanden skyldes T790M [33], [34], andre tiltak, som for eksempel EGFR dual målretting med cetuximab og afatinib [35] og tredje -geneneration, mutant-selektiv EGFR-TKI [36] – [38] blir aktivt vurdert. De foreløpige rapporter om effekten av mutant-selektive EGF-TKI er ganske lovende [39]. Disse nye stoffer forventes å være klinisk tilgjengelige i nær fremtid for pasienter med T790M-mediert resistens. Men på grunn av tumor heterogenitet og genomiske ustabilitet, synes utvikling av resistens mot disse medikamenter for å være uunngåelig å kreve andre terapeutiske strategier.
Chen et al. viste at EGFR-spesifikke sirnas sterkt hemmet cellevekst og induserte apoptose i H1975 celler som både L858R og T790M [40]. Selv knock-down av T790M transkripsjon av sirnas, når kombinert med afatinib, var effektiv i å kontrollere T790M-mutant, lungekreft celler. I tråd med dette, også fikk vi bekreftet utholdenhet av EGFR avhengighet i T790M-mutant, lungekreft celler. Dette er teoretisk sannsynlig med tanke på at T790M reduserer bare biding affinitet av EGFR-TKI, men aktiverer ikke den overflødige mekanisme for kreft-celle overlevelse bortsett fra i sjeldne tilfeller har annen samtidig, resistente mekanismer. Derfor kan nedregulering av EGFR utøve anti-kreft-effekter på kreftceller med EGFR avhengighet så vel som å øke effekten av EGFR-TKI i innstillingen av et redusert nivå av EGFR-ekspresjon. Vår undersøkelse for det første vist at EGFR nedregulering forårsaket av CX-4945 forsterket effekten av EGFR-TKI på EGFR-mutant lungekreftceller med T790M-mediert resistens.
Til nå har det vært kontroversielt hvorvidt forblitt autophagy er assosiert med sensitivitet eller resistens mot EGFR-TKI. Men noen papirer nylig foreslått at induksjon av autophagy er nødvendig for den cytotoksiske effekt av EGFR-TKI i primære og resistente celler med mutant EGFR [29], [32], [41]. De viste også at økt autofagi er nødvendig for å overleve i EGFR-uavhengig EGFR-mutant lungekreft cellen [41]. I vår studie begge resistente celler hadde fortsatt EGFR-avhengighet og inhibering av autophagy førte til reduksjon av celledød. I overensstemmelse med tidligere studier, Våre resultater viste at induksjon av autophagy har en viktig rolle for å overvinne ervervet resistens mot EGFR-TKI selv om mekanismene for å indusere autofagi kan være forskjellig.
EGFR-ekspresjon på celleoverflaten er kontrollert av et kompleks, endocytiske mekanisme [42]. Etter at den ligand-mediert aktivering og internalisering, er EGFR enten resirkuleres tilbake til celleoverflaten eller transporteres for lysosomal degradering [42] – [44]. Endring av denne delikate balansen kan endre nivået av EGFR på celleoverflaten. Økt autophagosomes i cytoplasma kan fusjonere med endosomes inneholder EGFR, og dermed forårsaker dannelsen av amphisomes. Deretter kan autolysomes utviklet av fusjon med lysosomet føre til degradering EGFR (fig. 6). I vår studie, CX-4945 indusert autophagosomes mer potent enn rapamycin, en velkjent mTOR-hemmer i EGFR-mutant, lungekreft celler med T790M. Redusert EGFR-ekspresjon i disse cellene ved CX-4945 ville være forårsaket av fremgangsmåten nevnt ovenfor. Dette støttes av resultater som viser at økt internalisert EGFR på autophagosomes av CX-4945 kan bli visualisert i fluoriserende cytokjemiske farging og hemming av autofagi av 3mA eller Atg7 siRNA behandling restaurert EGFR nivå. Derfor induksjon av autofagi fører til økt EGFR degradering, når kombinert med EGFR-TKI, kan være en av de lovende behandlingsalternativer for EGFR-TKI-resistente kreftceller med EGFR avhengighet.
EGFR er levert fra plasmamembranen til tidlige endosomer i endocytiske vesikler. Disse vesiklene er tilbake til plasmamembranen gjennom resirkuleringsveien. Imidlertid kan vesikler også smelte sammen med authophagosomes, og deretter direkte med lysosomer som fører til nedbrytning av EGFR.
CX-4945-indusert autofagi kan ikke formidles av hemming av chaperoning funksjon av HSP90 fordi 17-DMAG kunne ikke indusere autofagi. Tidligere studier har vist at undertrykkelse av CK2 induserer autophagic celledød gjennom modulering av mTOR og MAPK signal i menneskelige glioblastom celler [45]. I tråd med dette, fant vi at nedregulering eller hemming av CK2α kan føre til induksjon av autofagi i lungekreftceller med EGFR mutasjon. Imidlertid gjorde celledød ikke oppstå når resistente celler ble behandlet med CX-4945 eller CK2α siRNA. Dette resultatet kan være forårsaket av karakteristikken for EGFR-mutant kreftceller. Nedstrøms signalings (PI3K /AKT og MAPK) av celler med EGFR mutasjon er svært avhengig av EGFR aktivitet. Således kan inhibering av bare CK2 ikke være tilstrekkelig for modulering av mTOR og MAPK signalering i disse cellene. Videre detaljerte mekanismer bør utforskes ved følgende studier.
Likevel, vi foreslo at CX-4945 kan være nyttig for behandling av EGFR-mutant lungekreft med T790M-mediert motstand. Imidlertid, for den kliniske anvendelse, sikkerheten problemet relatert med dette nye legemidlet synes å være løst fordi det kan hemme funksjonen til HSP90, som er viktig i modning og stabilitet i både normale proteiner og oncoproteiner. Derfor er det usikkert om det kan nå effektivt serumkonsentrasjon uten signifikante bivirkninger med tanke på at vi for det meste brukt 5um av CX-4945 i vår studie. Derfor er ytterligere undersøkelser er nødvendig for å ta riktig dose av CX-4945 og sikkerhetsprofil.
I sammendraget, autophagosome-mediert EGFR nedregule indusert av CX-4945, en potent og selektiv CK2 inhibitor, forbedrer effekten av EGFR-TKI på EGFR-mutant lunge-kreftceller med motstand ved T790M.
