Abstract
mikroRNA (miRNA eller MIR) hemming av onkogene relaterte veier har vist seg å være et lovende terapeutisk tilnærming for kreft. Avvikende lipid og kolesterol stoffskiftet er involvert i prostata cancer utvikling og progresjon til ende-stadium sykdommen. Vi har nylig vist at en nøkkel transkripsjonsfaktor for lipogenese, sterol regulatorisk element-bindingsprotein-1 (SREBP-1), induserte fettsyre og lipidakkumulering og androgenreseptoren (AR) transkripsjonen aktivitet, og også fremmet prostatacancer cellevekst og kastrering motstand . SREBP-1 ble overuttrykt i human prostata cancer og kastreringsbestandig pasientprøver. Disse eksperimentelle og kliniske resultater indikerer at SREBP-1 er en potensiell onkogen transkripsjonsfaktor i prostata kreft. I denne studien identifiserte vi to mirnas, MIR-185 og 342, som styrer lipogenese og kolesterol-i prostatakreftceller ved å hemme SREBP-en og to uttrykk og ned-regulere deres målrettede gener, inkludert fettsyre syntase (FASN) og 3- hydroksy-3-metylglutaryl CoA reduktase (HMGCR). Både MIR-185 og 342 hemmet tumorigenicity, cellevekst, migrasjon og invasjon i prostatakreft cellekultur og xenograft modeller sammenfallende med sin blokade av lipogenese og kolesterol-. Intrinsic MIR-185 og 342 uttrykk ble betydelig redusert i prostatakreftceller sammenlignet med ikke-kreft epitelceller. Restaurering av MIR-185 og 342 førte til caspase-avhengige apoptotisk død i prostatakreftceller. Den nylig identifiserte mirnas, MIR-185 og 342, representerer en ny målgruppe mekanisme for prostatakreft behandling
Citation. Li X, Chen Y-T, Josson S, Mukhopadhyay NK, Kim J, Freeman MR, et al. (2013) mikroRNA-185 og 342 Hemme tumorgenisiteten og indusere apoptose gjennom blokade av SREBP Metabolsk Pathway i prostata kreft celler. PLoS ONE åtte (8): e70987. doi: 10,1371 /journal.pone.0070987
Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 18 februar 2013, Godkjent: 25 juni 2013; Publisert: 09.08.2013
Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Department of Defense (W81XWH-08-1- 0321) og Cedars-Sinai Garber Awards for Cancer Science (WCH). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mikroRNA (miRNA eller MIR) er en kort (gjennomsnittlig 22 nt), singel strandet og endogent forekommende ikke-kodende RNA som regulerer post-transcriptional genuttrykk ved komplementær baseparing på 3 «uoversatt regioner (UTR) av mål mRNA [1], [2]. MiRNA styrer ekspresjon av anslagsvis en tredjedel av humane protein-kodende gener involvert i fundamentale cellulære prosesser, herunder metabolisme, differensiering, vekst og apoptose [2] – [5]. Mirna har også vist seg å spille viktige roller i sykdom, spesielt kreft [6] – [8]. Visse miRNA arter, for eksempel MIR-20a, 23b, 34a, 126, 145, 146a, 221 og 222, blir avvikende uttrykt i prostata cancer [9], [10]. Et antall mirnas har vist seg å bidra til startfasen, vekst og dødelig progresjon [11] – [15]. Disse funnene gir en begrunnelse for å vurdere effekten av miRNA-baserte erstatning terapi, med mål om å hemme onkogener og tilhørende veier, eller gjenopprette tumorsuppressorgener.
Sterol regulerende element-bindende protein (SREBP) er en grunnleggende helix-loop-helix leucine glidelås transkripsjonsfaktor med viktige metabolske roller i lipogenese og kolesterol-[16], [17]. Tre store SREBP isoformene er identifisert, SREBP-1a, SREBP-1c og SREBP-2 [18]. SREBP-1 regulerer gener involvert i fettsyre, lipid og kolesterol-biosyntese [16], [17], mens SREBP-2 mer spesifikt regulerer kolesterolmetabolisme og homeostase [19]. Feilregulering av SREBPs og deres nedstrøms målrettede gener assosiert med lipogenese og kolesterol-har vært innblandet i kreft. Eksempler inkluderer fettsyre syntase (FASN), et metabolsk oncogen [20], [21], og 3-hydroksy-3-metylglutaryl CoA reduktase (HMGCR), det hastighetsbegrensende trinn i kolesterolbiosyntesen; begge proteiner har blitt rapportert å være involvert i utvikling og progresjon av prostatacancer [20], [22] – [24]. Overekspresjon av SREBP-1 ble observert i humane prostatacancerprøver, sammenlignet med normale /benign prostata-vev [22], og dette kan være mekanistisk forbundet med progresjon til androgen-ildfaste /kastrerings-resistent sykdom [22], [25]. Målrette det avvikende SREBP-lipogenese-kolesterol-veien kan føre til nye tilnærminger til behandling av prostatakreft.
Rollen miRNAs i SREBP-lipogenese-kolesterol-in prostatakreft er fortsatt uklart. I denne studien har vi identifisert og karakterisert to viktige mirnas, MIR-185 og 342, som SREBP-lipogenese-kolesterol-regulatorer i prostatakreftceller. Både MIR-185 og 342 hemmet uttrykk for SREBP-en og SREBP-2 og deres nedstrøms gener, FASN og HMGCR, og ytterligere redusert nivåene av fettsyrer og kolesterol i prostata kreft celler. I tillegg har begge mirnas redusert ekspresjon av androgenreseptoren (AR), en kjent vekst og overlevelsesfaktor. Videre MIR-185 og 342 undertrykt tumorigenicity og cellevekst og induserte apoptose gjennom aktivering av et caspase /PARP-mediert apoptotiske sti i prostatakreftceller og mus med xenograft menneskelige prostatakreft. Lavere nivåer av MIR-185 og 342 ble funnet i prostatakreftceller sammenlignet med normal /ikke-kreft prostata epitelceller. Tatt sammen, vi viser for første gang at MIR-185 og 342 spille en tumor suppressor rolle via blokade av en sentral lipogenese-kolesterol-mekanisme.
Materialer og Metoder
Prostate Cancer Cell Lines, celle~~POS=TRUNC og reagenser
Menneskelig prostata kreft cellelinjer LNCaP (androgen-avhengige) og C4-2B, en LNCaP avstamning-avledet androgen-uavhengig underlinjen [26], ble dyrket i T-medium (Life Technologies, grand Island, NY) supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS), 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. En ikke-kreft human prostata epitelcellelinje, RWPE-1 (ATCC, Manassas, VA), ble opprettholdt i keratinocytt-medium inneholdende bovint hypofyseekstrakt og human rekombinant epidermal vekstfaktor (Life Technologies). Alle celler ble opprettholdt i 5% CO
2 ved 37 ° C. Menneskelige miRNA forløpere, ble miRNA-hemmere, TaqMan miRNA analyse, Mirvana ™ miRNA isolasjon kit og Lipofectamine 2000 kjøpt fra Life Technologies. De 3 «UTR luciferase reporter DNA-konstruksjoner av SREBP-1 (HmiT017704-MT05) og SREBP-2 (HmiT017705-MT05) ble kjøpt fra GeneCopoeia (Rockville, MD). CellTiter 96® vandige løsning Cell Proliferation Assay (mitokondrie MTS analyse) og caspase-Glo® 3/7 analysesystemer ble oppnådd fra Promega (Madison, WI).
Mirna Transfeksjon
Transient transfeksjon av miRNA forløpere eller hemmere ble gjennomført ved hjelp Lipofectamine 2000 i henhold til produsentens protokoll. Menneskelig MIR-185 (PM12486) og 342 (PM13066) forløpere, anti-MIR-185 (AM12486) og 342 (AM13066), og negativ kontroll (MIR-NC; AM17110) ble brukt for analyser
Kvantitativ. sann~~POS=TRUNC tids~~POS=HEADCOMP revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR)
Totalt RNA ble preparert fra cellene ved bruk av RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) og utsatt for revers transkripsjon ved å SuperScript® III revers transkriptase ( life Technologies) i henhold til produsentens instruksjoner. Primersekvensene som benyttes for PCR-analyse er oppført i tabell S1. En varm start ved 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder, annealing av primerne ved 60 ° C i 30 s og forlengelse ved 72 ° C i 30 s ved bruk av ABI 7500 Fast Fast -Tid PCR System (Life Technologies). Data ble normalisert til 18S rRNA eller GAPDH og representert som gjennomsnittet fold av tre uavhengige duplikater. For å bestemme egen MIR-185 og 342 uttrykk, ble miRNA forberedt fra cellene ved hjelp av Mirvana ™ miRNA isolasjon kit (Life Technologies). Moden miRNA ble kvantifisert ved TaqMan miRNA analyse (Life Technologies) i henhold til produsentens instruksjoner. Dataene ble normalisert ved RNU6B.
Western Blot analyse
Cellelysater ble fremstilt fra MIR-185, 342, North Carolina (MIR-negativ kontroll) -transfected eller ikke-transfekterte prostatakreftceller ved hjelp en lyseringsbuffer [50 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl, 0,02% NaN
3, 0,1% SDS, 1% NP-40 og 0,5% natriumdeoksycholat] inneholdende 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, og protease-inhibitor cocktail (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bradford assay hjelp Coomassie Plus Protein Reagens (Thermo Scientific, Rockford, IL). Western blot ble utført ved anvendelse av Novex systemet (Life Technologies) som tidligere beskrevet [27], [28]. Primære antistoffer anti-SREBP-en, SREBP-2, FASN, HMGCR, AR og β2-mikroglobulin (β2M) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), og sekundære antistoffer som ble konjugert med pepperrot peroksidase (GE Healthcare, Piscataway, NJ) ble anvendt. Påvisning av proteinbånd ble gjort ved hjelp av Enhanced Chemiluminescence Western blotting Detection Reagenser (GE Healthcare).
Cell Proliferation, Clonogenicity, migrasjon og invasjon Analyser
LNCaP eller C4-2B celler (6000 celler /brønn ) ble sådd ut på 96-brønners plater og transfektert med MIR-185, 342 eller NC. Celleproliferasjon ble målt 3 dager etter transfeksjon med MTS-analyse (Promega) ifølge produsentens instruksjoner. For clonogenicity analysen, LNCaP eller C4-2B-celler transfektert med MIR-185, 342 eller NC ble sådd ut på 6-brønners plater (500 celler /brønn). Celler ble dyrket ved 37 ° C med 5% CO
2 til 14 d. Koloniene ble fiksert med formalin og farget med krystallfiolett [27]. Numrene på utviklede kolonier ble talt opp og analysert med hensyn til signifikante forskjeller.
In vitro
cellemigrering eller invasjon, ble bestemt i Boyden kammere pre-belagt med kollagen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, for migrering analyse) eller vekstfaktor-utarmet Matrigel matrise (BD Bioscience, San Jose, CA, for invasjonen assay). Celler (1,5 × 10
5 celler /brønn) transfektert med MIR-185, 342 eller NC ble sådd på innsiden av de forhåndsbelagt øvre kammer. Etter inkubering ved 37 ° C med 5% CO
2 i 48 timer, ble antallet migrerte eller invaderende celler målt ved hjelp av en krystall-fiolett merkemetode [27].
fettsyrer og kolesterol Kvantifisering
de mengder langkjedete fettsyrer og cholesterols ble bestemt ved hjelp av Free fatty Acid Kvantifisering Kit og Kolesterol /Cholesteryl Ester Detection Kit (Abcam, Cambridge, MA) i celler transfektert med MIR-185, 342 eller NC. Mengdene av fettsyrer og kolesteroler ble normalisert ved å totale celletall. Den relative fettsyre eller kolesterol (%) ble bestemt å være 100% i NC-celler.
apoptose Assays
For Annexin V-farging, ble en fluorescens-aktivert cellesortering prostatacancer analyse utført 72 timer post-transfeksjon av miRNAs bruker Annexin V-FITC apoptose Detection Kit i (BD Biovitenskap) og en FACScan flowcytometer med Cellquest-programvare (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ). For caspase aktivitetsanalysen, ble celler transfektert med mirnas til 24 timer målt for caspase 3/7 enzymatiske aktiviteter av Caspase-Glo® 3/7 Assay System (Promega). Data ble normalisert ved totale proteiner. For kaspase-Western blot-analyse, ble hele cellelysater fremstilt fra celler transfektert med mirnas i 72 timer og utsatt for Western blot. Anti-caspase 9, 3 og PARP primære antistoffer (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) ble brukt.
Etikk erklæringen
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Cedars-Sinai Medical Center (IACUC Protocol # 004252) og ble fulgt for musestudier.
In vivo
Animal Experiments
for å undersøke anti-tumor effekt av MIR-185 og 342
in vivo
, seks uker gammel mannlig atymiske nakne mus (Harlan Laboratories, Placentia, CA) ble inokulert subkutant med 2 × 10
6 C4-2B celler per mus. Den tumorbyrden ble overvåket ved tumorvolum (ved hjelp av formelen V = 4 /3π x (d /2)
2 x D /2, hvor d er de mindre tumor akse og D er den største tumor akse). Etter seks uker inokulering, 100 pmol av miRNA kompleksdannet med 3 mL av Lipofetamine 2000 i 50 ul PBS ble levert intratumorally hver 3 d for en 21-behandling. Dosen og tidsplan for miRNA injeksjon ble endret av en tidligere rapport [29]. Ved opphør av dyret studien ble tumorvev høstet fra avlives mus og fiksert i 10% formalin, dehydrert i etanol, i parafin og seksjonert for lysbilder. De tomme vev lysbilder ble utsatt for immunhistokjemisk farging (IHC) [30] med anti-SREBP-en, SREBP-2, FASN, HMGCR, AR, PSA, Ki67 og spaltes PARP primære antistoffer. For kvantifisering av Ki67 (celledeling) og spaltet PARP (apoptose) ekspresjon, ble 100 tumorceller ved 5 tilfeldig utvalgte områder telles og positivt å merke celler ble registrert. I tillegg ble delvis frisk tumorvev oppsamlet for å bestemme ekspresjonen av MIR-185 eller 342 ved QRT-PCR. miRNA ble fremstilt fra tumorvev ved hjelp av Mirvana ™ miRNA isolasjonskit.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført som beskrevet tidligere [31]. Studentens
t
-test og to-tailed distribusjon ble brukt for analyse av statistisk signifikans.
Resultater
MiR-185 og 342 Hemmer uttrykk for SREBPs og deres nedstrøms Genes i prostata kreft celler
for å undersøke om mirnas regulere SREBP-lipogenese-kolesterol-metabolismen i prostatakreftceller, vi først brukt TargetScanHuman 6,2 online programvare (https://www.targetscan.org/) for å forutsi om en eller flere mirnas målretter både SREBP-1 og SREBP-2, to viktige transkripsjonsfaktorer som regulerer fettsyre, lipid- og kolesterol-biosyntese og homeostase. To mirnas, MIR-185 og 342, ble hentet som potensielt co-målrettede 3 «UTR av SREBP-en og SREBP-2 mRNA (fig. S1 A). For ytterligere å kontrollere om MIR-185 og 342 direkte bind med 3 «UTR av SREBP-en og SREBP-2, utførte vi 3» UTR luciferase reporter analysen og fant at de relative 3 «UTR luciferasepreparater aktiviteter både SREBP-en og SREBP- 2 ble betydelig redusert i MIR-185 og 342 transfekterte prostatakreftceller (fig. S1B). Resultatene bekrefter at SREBP-en og SREBP-2 mRNA er direkte mål av MIR-185 og 342. For å validere hvorvidt disse to mirnas kontrollere SREBP-lipogenese-kolesterol-banen i prostatakreftceller, vi utførte QRT-PCR, Western blot, og fettsyrer og kolesterol kvantifisering analyser. Både MIR-185 og 342 hemmet ekspresjon av mRNA (fig. 1A), så vel som forløper (125 kDa) og moden (68 kDa) proteiner (Fig. 1B) av SREBP-1 og SREBP-2 i LNCaP og C4-2B prostata kreft celler. Uttrykk for FASN [32] og HMGCR [33], [34], som er SREBP nedstrøms regulert gener, ble redusert med MIR-185 og 342 (fig. 1A og 1B). MiR-185 og 342 også redusert AR mRNA og protein uttrykk i prostatakreftceller (Fig. 1A og 1B). Fordi FASN og HMGCR er viktige enzymer for
de novo
syntesen av fettsyrer og kolesterol individuelt, vi deretter undersøkt nivåene av fettsyrer og kolesterol i celler. Som vist i tabell 1, ble mengdene av intracellulær fettsyrer og kolesterol i betydelig grad redusert i MIR-185 og 342-transfekterte LNCaP og C4-2B celler sammenlignet med kontrollgruppene. For ytterligere å teste spesifisitet av MIR-185 og 342 for SREBP-lipogenese-kolesterol-, ble antisensoligonukleotider mot MIR-185 og 342 brukes som MIR-185 og 342-hemmere. Ved å blokkere endogen MIR-185 og 342 i prostata kreft celler, både MIR-185 og 342 hemmere økt SREBP-en, SREBP-2 og deres nedstrøms genuttrykk (Fig. 1C). Disse resultater antyder at MIR-185 og 342 sperret SREBP signalisering gjennom reduksjon av SREBP mRNA og protein og reduserte nivåer av fettsyrer og kolesterol i prostata kreftceller.
A, Både MIR-185 og 342 hemmet mRNA-ekspresjon av SREBP-en, SREBP-2, FASN, HMGCR og AR i LNCaP og C4-2B prostatakreftceller bestemt ved QRT-PCR. -: Ikke-transfektert; NC: MIR-negativ kontroll. Den relative mRNA-ekspresjon (fold) ble bestemt å være 1,0 i ikke-transfekterte celler. Data ble normalisert til 18S rRNA og representerer gjennomsnittet ± SD av tre uavhengige forsøk in duplo. **
P
0.005 signifikante forskjeller fra NC. B, MiR-185 og 342 hemmet forløper (125 kDa) og moden (68 kDa) former SREBP-en og SREBP-2, FASN, HMGCR og AR uttrykk i LNCaP og C4-2B celler analysert ved Western blot. β2-mikroglobulin (β2M) ble anvendt som en kontroll lasting. C, MiR-185 og 342-hemmere (Antisenseoligonukleotider mot MIR-185 og 342) økte SREBP-en, SREBP-2, FASN, HMGCR og AR uttrykk i LNCaP og C4-2B celler bestemt ved QRT-PCR. Den relative mRNA-ekspresjon (fold) ble bestemt å være 1,0 i ikke-transfekterte celler. Data ble normalisert til 18S rRNA og representerer gjennomsnittet ± SD av tre uavhengige forsøk in duplo. **
P
0.005 signifikante forskjeller fra NC. D, Expression of iboende MIR-185 og 342 i RWPE-en, LNCaP og C4-2B celler. QRT-PCR resultater viste at relative uttrykk for MIR-185 og 342 ble betydelig redusert i prostatakreftceller sammenlignet med normal /ikke-kreft RWPE-en. Lavere uttrykk for både miRNAs ble observert i aggressive C4-2B sammenlignet med LNCaP celler. Den relative miRNA uttrykket (fold) ble bestemt å være 1,0 i RWPE-1-celler. **
P
0.005 signifikante forskjeller fra RWPE-en. Data ble normalisert til RNU6B kontroll og representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter utført i fire eksemplarer.
Deretter bestemmes vi uttrykk for iboende MIR-185 og 342 i ulike cellelinjer med klinisk relevans, inkludert en human normal /ikke-kreft prostata epitelcellelinje, RWPE-1, og LNCaP (androgen-avhengige) og C4-2B (androgen-uavhengig prostata kreftceller). Mirna ble fremstilt av disse cellene. Relativ ekspresjon av både MIR-185 og 342 ble signifikant redusert i kreftceller sammenlignet med ikke-kreft RWPE-1 (Fig. 1D) som analysert ved QRT-PCR. I tillegg er lavere MIR-185 og 342-ekspresjon ble observert i de mer aggressive C4-2B linje i forhold til LNCaP. Videre undersøkte vi uttrykket av SREBPs, FASN og HMGCR å korrelere med iboende MIR-185 og 342 i disse cellelinjene. Relativ ekspresjon av SREBP-1, SREBP-2, FASN og HMGCR var høyere i LNCaP og C4-2B enn i RWPE-1-celler (fig. S2). Disse dataene indikerer at MIR-185 og 342 er negative regulatorer for SREBP signalisering i prostatakreftceller.
MiR-185 og 342 Dempe Cell Proliferation, Clonogenicity, migrasjon og invasjon i prostata kreft celler
for å vurdere potensialet for biologiske konsekvenser fremkalt av MIR-185 og 342, vi re-uttrykt MIR-185 og 342 i LNCaP og C4-2B celler og utført en rekke funksjonelle analyser er relevante for tumorigenicity og kreft progresjon. Når LnCap og C4-2B-celler ble transfektert med MIR-185 og 342, ble spredning av begge celletyper inhiberes i sammenligning med MIR-NC og ikke-transfekterte celler (Fig. 2A). Både MIR-185 og 342 også redusert clonogenicity sammenlignet med (Fig. 2B) kontrollgruppene. Ett av kjennetegnene ved progressive og metastatiske celler er deres evne til å invadere omkringliggende vev og migrere effektivt [35]. MiR-185 og 342 vesentlig hemmet
in vitro
migrasjon (Fig. 2C) og invasjon (Fig. 2D) i LNCaP og C4-2B celler. Motsatt, ved å blokkere MIR-185 og 342 i prostata kreft celler, MIR-185 og 342-hemmere økt celledeling, kolonidannelse, migrasjon og invasjon (Fig. S3). Disse dataene tyder på at både MIR-185 og 342 undertrykk de veier som er relevante for tumordannelse og progresjon av kreft
A, Mir 185 og 342 hemmet celleproliferasjon i LNCaP og C4-2B celler sammenlignet med ikke-transfekterte. (-) og MIR-negativ kontroll (NC) transfekterte celler tre dager etter miRNA transfeksjon. Den relative celleformering (%) ble bestemt å være 100% i ikke-transfekterte (-) celler. **
P
0.005 signifikante forskjeller fra NC. Data representerer gjennomsnittet ± SD av to uavhengige eksperimenter kvadruplikat. B, Mir 185 og 342 undertrykkes kolonidannelse i LNCaP og C4-2B celler sammenlignet med kontrollgruppene etter 14 d miRNA transfeksjon. *,
P
0,05 og **,
P
0.005 signifikante forskjeller fra NC. Data representerer gjennomsnittet ± SD av to uavhengige eksperimenter triplikat. C, Cellemigrering og D, invasjon ble signifikant redusert ved MIR-185 og 342 i LNCaP og C4-2B celler sammenlignet med kontrollgruppene. **
P
0.005 signifikante forskjeller fra NC. Data representerer gjennomsnitt ± SD av to uavhengige kvadruplikeres eksperimenter.
MiR-185 og 342 Frem caspase-avhengige apoptotisk død i prostata kreft celler
For å finne ut om MIR-185 og 342 indusere apoptose i prostatakreftceller, ble Annexin V-FITC /propidiumjodid (PI) farging måling, caspase aktivitetsanalysen og Western blot av caspase og PARP uttrykk utført. Resultatene av Annexin V-FITC /PI farging og flowcytometrisk analyse viste at MIR-185 og 342 økte apoptotiske cellefraksjoner (både tidlig og sent apoptotiske cellefraksjoner,
P
0,005) i LNCaP og C4 -2b celler sammenlignet med kontrollgruppene (fig. 3A). Caspase 3/7 aktiviteter ble også betydelig indusert av MIR-185 og 342 i LNCaP og C4-2B celler (fig. 3B). Videre viste Western blot resultater som pro-caspase 9 og 3 ble redusert med MIR-185 og 342 (fig. 3C). Dessuten spaltes caspase-3 og PARP, en nedstrøms faktor av kaspaser, ble påvist i MIR-185 og 342 transfekterte celler (Fig. 3C). Disse resultater antyder at MIR-185 og 342 indusere prostatakreft celledød gjennom aktivering av en caspase-avhengig apoptotisk mekanisme.
A, An Annexin V-FITC /PI beising apoptotisk assay og flow-cytometri ble utført i LNCaP og C4-2B celler transfektert med miRNAs. Både MIR-185 og 342 økte apoptotiske celle fraksjoner (både tidlig og sent apoptotiske cellefraksjoner;
P
0,005) sammenlignet med kontrollgruppene. B, caspase 3/7 aktiviteter ble betydelig økt med MIR-185 og 342 i LNCaP og C4-2B celler. Caspase 3/7 aktiviteter (fold) ble tildelt som 1.0 i ikke-transfektert (-) celler. **
P
0.005 signifikante forskjeller fra NC. Data representerer gjennomsnittet ± SD av to uavhengige eksperimenter triplikat. C, Mir 185 og 342 redusert pro-kaspase 9, 3 og PARP, og aktivert spaltet caspase 3 og PARP ekspresjon i LNCaP-celler som bestemt ved Western blot. β2M ble anvendt som en kontroll lasting. C:. Kløyvet
intratumorale Levering av MIR-185 og 342 fører til regresjon av prostatakreft i en mus xenograft modell
Fordi
in vitro
data demonstrert anti-tumorigen og apoptotiske roller MIR-185 og 342 i prostata kreft celler, vi deretter undersøkt det terapeutiske potensialet i MIR-185 og 342 ved hjelp av en mus subkutan prostata svulst xenograft modell. Etter en 21-behandling ved intratumoral levering hver 3 d, både MIR-185 og 342 vesentlig redusert subkutan C4-2B tumormengde sammenlignet med kontrollgruppen (Fig. 4A). Å relatere den terapeutiske responsen med levering av miRNA, ble miRNA isolert fra friske C4-2B svulster og nivåene av MIR-185 og 342 ble vurdert ved QRT-PCR. Svulster injisert med MIR-185 eller 342 inneholdt omtrent 116 ± 30 ganger (MIR-185,
P
0,05) eller 278 ± 59 ganger (MIR-342,
P
0,05; **
P
0,005 signifikante forskjeller fra NC-behandlede tumorer (N = 5 for hver gruppe). B, Den relative uttrykk for MIR-185 eller 342 i C4-2B svulster. QRT-PCR resultater viste at de relative MIR-185 eller 342 nivåene ble betydelig økt i de subkutane C4-2B svulster injisert med MIR-185 eller 342 sammenlignet med kontroll svulster. Den relative miRNA uttrykket (fold) ble tildelt som 1,0 i NC. *,
P
0.05 signifikante forskjeller fra NC. Data ble normalisert til RNU6B og representerer gjennomsnittet ± SD. C, IHC Resultatene viste at nedregulering av SREBP-en, SREBP-2, FASN, HMGCR, AR og PSA ble observert i MIR-185 og 342-behandlet subkutane C4-2B svulster i sammenligning med NC-behandlede svulster. Skala barer = 25 mikrometer
Kvantifisering av A, Ki67 (celledeling) og B, kløyvde PARP (C-PARP, apoptose). Positive celler i subkutane C4-2B vevsprøver hentet fra speil NC, 185 og 342 behandlede grupper. Ett hundre celler ved 5 tilfeldig utvalgte områder ble talt opp og positivt flekker celler ble registrert. **
P
0,005 betydelige forskjeller mellom kontrollgruppen NC gruppen. Data representerer gjennomsnittet ± SD. Pilspisser angir C-PARP positive celler. Skala barer = 100 mikrometer.
Diskusjoner
Aberrant lipid og kolesterol anabolisme er sterkt knyttet med prostatakreft [36], [37]. Oppregulering av lipogenese og kolesterol-i kreftceller er assosiert med økt behov for cellemembrankomponenter og aktivering av lipid flåten relaterte intercellulære signalomforming i løpet av ukontrollert celleformering og divisjon, samt kreftutvikling og progresjon [24], [38] – [41]. Blokkering av unormal lipogenese og kolesterol-gir et lovende terapeutisk metode for forhindring eller behandling av prostatisk kreft. Mirna er blitt rapportert å regulere flere viktige biologiske prosesser, inkludert metabolismen [3], [5] og er av potensiell anvendelse i kreftterapi [42] – [44]. Men hvordan miRNA formidler avvikende fettstoffskiftet og homeostase i prostata kreft celler er fortsatt uklart. I denne studien identifiserer vi to mirnas som spiller en viktig rolle i reguleringen av lipogenese og kolesterol-i prostatakreftceller. MiR-185 og 342 hemmet fettsyrer og kolesterol biosyntese gjennom nedregulering av nøkkel lipogenic og cholesterogenic transkripsjonsfaktorer, SREBP-en og SREBP-2, og deres nedstrøms regulert gener inkludert FASN og HMGCR. SREBP-1 og FASN har vist seg å være et potensielt onkogene transkripsjonsfaktor [22] og en metabolsk oncogen [20], [21], respektivt. MiR-185 og 342 redusert celleproliferasjon, clonogenicity, migrasjon og invasjon, og indusert caspase-avhengig apoptose i prostatakreftceller. Disse data tyder på at MIR-185 og 342 spille en tumor-undertrykkende rolle ved å hemme SREBP-en og SREBP-2 uttrykk, og dermed omprogrammering lipogenese og kolesterol-.
En rekke miRNAs har blitt identifisert til å være knyttet til prostatakreft utvikling og progresjon til dødelig sykdom. MiR-20a ble rapportert å regulere celledeling og progresjon gjennom hemming av gap junction protein connexin 43 uttrykk i prostata kreft [45]. Redusert uttrykk for MIR-143 og 145 ble funnet i prostatakreft pasienter med benmetastaser [46]. Også, både MIR-143 og 145 mediert epitelial-mesenchymale overgang (EMT) og undertrykt metastatisk evnen til PC3 prostatakreftceller
in vitro Hotell og
in vivo product: [46]. MiR-203 nedregulert en kohort av metastaserelaterte gener og hindret beinmetastase i prostata kreft [47]. Ved å blokkere CD44 uttrykk, MIR-34a hemmet migrasjon og invasjon i prostata kreft stamceller [48]. MiR-la-7c redusert AR uttrykk og aktivitet i prostatakreftceller ved å målrette en onkogen transkripsjonsfaktor, c-myc [49]. Analyse av kliniske kreftprøver innsamlet fra beinmetastatisk kastrering resistent prostatakreft (CRPC) pasienter viste at avvik Mir-23b /27b uttrykk kan være involvert i progresjon til kastrering motstand [50]. I tillegg har MIR-221 og 222 er vist for å styre utviklingen av CRPC [12]. I denne studien, oppdaget vi to nye lipid- og kolesterol anabolisme regulert mirnas, MIR-185 og 342, som blokkerte den SREBP-lipogenese-kolesterol-, redusert AR uttrykk, hemmet tumorigenitet og indusert apoptotisk død i prostatakreftceller. En kombinasjon av MIR-185 og 342 viste ikke signifikant additiv eller synergistisk effekt på genekspresjon, vekst, migrering og invasjon i forhold til enkelt miRNA i prostatakreftceller (data ikke vist). Videre uttrykk for iboende MIR-185 eller 342 var betydelig lav i prostatakreftceller i forhold til normal /ikke-kreft epitelceller. Videre undersøkelser av uttrykket profiler av MIR-185 og 342 i menneskelige prostata vevsprøver er berettiget.
