Abstract
Interleukin-6 (IL-6) er involvert i lungekreft tumorigenesis, tumorprogresjon, metastase, og stoffet motstand. Tidligere studier viser at blokkering av IL-6 signal kan hemme tumorvekst og øke medikamentsensitivitet hos mus. Kliniske studier av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) viser at IL-6 rettet behandling lindrer NSCLC relatert anemi og kakeksi, selv om andre kliniske effekter krever videre studier. Vi krysset
IL-6
– /-
mus med
Kras
G12D
mutante mus, som utvikler lungesvulster etter aktivering av mutant
Kras
G12D
, for å undersøke om IL-6 hemming bidrar til tumorprogresjon og overlevelse
in vivo
.
Kras
G12D
;
IL-6
– /- mus oppviste økt tumorigenesis, men tregere tumorvekst og lengre overlevelse enn
Kras
G12D
mus. Videre, for å undersøke om
IL-6
sletting bidrar til undertrykkelse av lungekreft metastaser, vi genererte
Kras
G12D
;
p53
FLOX /FLOX
;
IL-6
– /- mus, som utviklet lungekreft med en trend for redusert metastaser og lengre overlevelse enn
Kras
G12D
;
p53
FLOX /FLOX
mus. Svulster fra
Kras
G12D
;
IL-6
– /- mus viste økt uttrykk av TNFa og redusert uttrykk av CCL-19, CCL-20 og fosforylert STAT3 (pSTAT3) enn
Kras
G12D
mus; Men disse endringene var ikke til stede mellom svulster fra
Kras
G12D
;
p53
FLOX /FLOX
;
IL-6
– /- og
Kras
G12D
;
p53
FLOX /FLOX
mus. ble observert oppregulering av pSTAT3 og fosforylert AKT (Pakt) i
Kras
G12D
svulster med
p53
sletting. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at
IL-6
sletting akselererer tumorigenesis men forsinkelser tumorprogresjon og forlenger overlevelse tid i en
Kras
-driven musemodell for lungekreft. Imidlertid kan disse effektene dempes av
p53
sletting
Citation. Tan X, Carretero J, Chen Z, Zhang J, Wang Y, Chen J et al. (2013) Tap av
p53
Demper bidrag av
IL-6
sletting på Undertrykt tumorprogresjon og utvidet overlevelse i
Kras
-Driven Murine lungekreft. PLoS ONE 8 (11): e80885. doi: 10,1371 /journal.pone.0080885
Redaktør: Victoria Lawson, Universitetet i Melbourne, Australia
mottatt: 29. mai 2013; Godkjent: 08.10.2013; Publisert: 15.11.2013
Copyright: © 2013 Tan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes av NIH (CA122794, CA140594, CA163896, CA166480, CA154303, og Lung SPORE P50CA090578), United mot lungekreft, American Lung Association, Susan Spooner forskningsfond (KKW), kinesisk National Key Program på Basic forskning (2012CB945100, 2011CB504202 National Foundation) og Natural Science of China (31030040). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Samler bevis indikerer at betennelse bidrar til tumorigenesis, tumorprogresjon, og metastase [1,2]. Onkogen-assosiert betennelse fører til produksjon av inflammatoriske cytokiner som interleukin-6 (IL-6) [3,4], er en pleiotropisk cytokin som er involvert i inflammasjon, immunitet, ben-metabolisme, neural utvikling, reproduksjon, og hematopoese [5]. Imidlertid er IL-6 også forbundet med økt risiko for lungekreft [6-8]. IL-6 kan påvises i pust kondensat av pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [9], og i serum av enkelte lungekreftpasienter, men er ikke detekterbar i pasienter med godartet lungesykdom [10]. Forhøyet IL-6 nivåer bidra til ondartet pleuravæske [11,12], postoperative komplikasjoner [13], og postoperativ tilbakefall [14] for lungekreft. Flere studier har korrelert høye sirkulerende IL-6 nivåer med dårlig overlevelse av lungekreft pasienter [15-23]. IL-6-mediert betennelse korrelerer med svekkende kreft-relaterte symptomer som tretthet, tromboembolisme, kakeksi, og anemi [3], og IL-6 signal aktivering korrelerer med lungecancer kjemoterapi motstand [16,24]. Disse studiene antyder en viktig rolle for IL-6 i flere aspekter av lungekreft.
IL-6 ekspresjon kan påvises i lungesvulster [25] og i 53% av lungecancercellelinjer [26], og IL-6 veier er aktivert i en human lungekreft stamcellelinje [27-29]. Funksjonelle analyser tyder på at IL-6 påvirker evnen av kreftceller til metastaserer til fjerne steder [30,31] og at IL-6 fremmer tumorvekst i en parakrint mote
in vivo product: [4,26,32] . Derfor er det kanskje ikke overraskende at
IL-6
knockdown, genetisk ablasjon, eller behandling med en nøytral IL-6 antistoff hemmer tumorvekst
in vivo product: [4,33]. Omvendt, aktivering av IL-6 signal bidrar til resistens overfor epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) i en musemodell av NSCLC [34,35], mens blokade øker medikamentsensitivitet i xenograft-modeller [34].
Et IL-6 monoklonale antistoffer ville bli forutsagt til å hemme den inflammatoriske mikromiljøet i lungekreft. En slik behandling, ALD518, har gjennomgått preklinisk og fase I og II kliniske studier. Det ser ut til å være godt tolerert og lindrer NSCLC relatert anemi og kakeksi [3], men totaliteten av kliniske resultater trenger videre studier.
For å vurdere bidraget av IL-6 signal hemming på tumorprogresjon og overlevelse tid
in vivo
, vi krysset
IL-6
– /-
mus med mutant
Kras
G12D
mus fordi IL-6 er en nedstrøms effektor av onkogen Ras å fremme tumorigenesis [4]. NSCLC er ofte diagnostisert med metastase og har en dårlig prognose. Behandling og forebygging av lungekreft metastaser er store udekkede behov [36]. Inaktivere mutasjoner i
p53
er funnet i minst 50% av NSCLC tilfeller [36], og
Kras
G12D
aktivering ledsaget av
p53
sletting kan forårsake lungemetastase [37]. For å studere funksjonen av IL-6 i metastase, vi også generert
Kras
G12D
;
p53
FLOX /FLOX
;
IL-6
– /- mus ..
Materialer og metoder
Mus
IL-6
– /-
mus ble kjøpt fra The Jackson Laboratory og vedlikeholdes i sterile boliger [38]. Betinget
Lox-Stop-Lox Kras
G12D plakater (heretter kalt
Kras
G12D
) mus [39] og
p53
FLOX /FLOX
mus [40] ble beskrevet tidligere.
Kras
G12D Hotell og
Kras
G12D
;
LL-6
– /-
mus ble inokulert med 5 × 10
6 PFU av adenovirus Cre (adeno-Cre) ved intranasal innånding å aktivere onkogene
Kras
G12D
i lungene.
Kras
G12D
;
p53
FLOX /FLOX Hotell og
Kras
G12D
;
p53
FLOX /FLOX
;
IL-6
– /-
mus ble inokulert med 5 × 10
5 PFU av adeno-Cre. Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Dana-Farber Cancer Institute (tillatelse nummer 04-094). Alle operasjoner ble utført under Avertin anestesi for å redusere lidelse. Etter eutanasi, organer, inkludert hjerte, lever, milt, nyre, mage, tarm, ryggrad, hjerne, bryst, hud, og testikler eller eggstokker ble gjennomgått brutto inspeksjon for metastaser. Lungesvulster følges pleura ble ansett parietal pleural metastaser. Mistenkte metastaser ble høstet og bekreftet av histologiske funksjoner.
Histologi og immunhistokjemi
Etter dødshjelp, ble lungene fjernet og fiksert i 10% nøytral bufret formalin over natten før innstøping i parafin. Fem-mikrometer deler av mus lunge vev ble kuttet. Noen deler ble farget med H E. For immunhistokjemi, varmebehandling med citrate løsning (Beijing ZhongShan Golden Bridge Bioteknologi Co, Kina) i en decloaking kammer (Biocare Medical) umaskerte antigener for fosforylert ERK (perk), BrdU, Ki67, Endomucin og caspase-3 farging. Antall lunge vevssnitt ble inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer: Perk (4370, Cell Signaling) ved 1: 100; BrdU (ab6326, Abcam) ved 1: 200; Ki67 (ab15580, Abcam) ved 1: 200; Endomucin (14-5851, eBioscience) ved 1: 100; kløyvet Caspase-3 (9661, Cell Signaling) ved 1: 300. Digest-All 2B Trypsin (Invitrogen) ble anvendt for å hente antigen for MAC2 (CL8942AP, Cedarlane) farging på 1: 5000. På 400X forstørrelse ble alle MAC2-positive makrofager i svulster telles innen 3 mikroskop felt med de MAC2-positive makrofager etter gjennomgang av hele lungen delen. Tre mus pr genotype ble analysert.
Spredningsanalyse
Ved 20 uker etter infeksjon ble musene injisert intraperitonealt med 10 ul av 10 mM BrdU i PBS pr gram kroppsvekt og avlivet etter 2 timer. Hele lunger ble høstet og bearbeidet som beskrevet ovenfor. På 400X forstørrelse ble alle BrdU-positive tumorcellekjerner telles innen 3 mikroskop felt med de BrdU-positive kjerner etter gjennomgang av hele lungen delen. Fire mus per genotype ble analysert. Samme metode ble brukt til å beregne Ki67-merkede tumorceller på seksjoner fra mus 28 uker etter infeksjon med adeno-Cre.
Western blotting
lungesvulster ble høstet fra
Kras
G12D Hotell og
Kras
G12D
;
LL-6
– /-
mus 32 uker etter smitte og fra
Kras
G12D
;
p53
FLOX /FLOX Hotell og
Kras
G12D
;
p53
FLOX /FLOX
;
IL-6
– /-
mus 15 uker etter smitte for Western blot analyse. Svulster ble lysert med en homogenisator i RIPA-buffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM natriumklorid, 1% Nonidet P-40, 0,25% natrium-deoksycholat, 1 mM EDTA) inneholdende kompmini proteasehemmere (Roche) og fosfatase-inhibitorer (5870 , Cell Signaling). Kjerne- og Cytoplasmatiske Extraction Kit (CW199B, COWIN Biotech Co., Ltd. Kina) ble brukt til å trekke cytoplasma (C) og kjernekraft (N) fraksjoner fra svulster. Lysatene (20 ug per bane) ble separert på 10% polyakrylamidgeler, overført til PVDF-filtre, og inkubert over natten ved 4 ° C med antistoffer mot p-aktin (sc-1615, Santa Cruz), Perk (4376, Cell Signaling), total-ERK (9102, Cell Signaling), Pakt (4060, Cell Signaling), total-AKT (4685, Cell Signaling), pSTAT3 (9145, Cell Signaling), STAT3 (sc-7179, Santa Cruz), p65 (SC- 372, Santa Cruz), PARP (9532, Cell Signaling), GAPDH (TA-8, Beijing ZhongShan Golden Bridge Bioteknologi Co, Kina), eller β-catenin (ab32572, Abcam). Western blot ble utsatt for X-ray filmer eller skannet med en Imagequant LAS 4000mini (GE Healthcare).
kvantitativ real-time PCR
mRNA ble ekstrahert fra svulster
Kras
G12D Hotell og
Kras
G12D
;
LL-6
– /-
mus 32 uker etter smitte og
Kras
G12D
;
p53
FLOX /FLOX Hotell og
Kras
G12D
;
p53
FLOX /FLOX
;
IL-6
– /-
mus rundt 16 uker etter infeksjonen for analyse. 2 ug total RNA ble revers transkribert til cDNA ved hjelp SuperRT cDNA syntese kit (Beijing COWIN biovitenskap Co., Ltd. Kina). Real-time PCR ble utført ved hjelp av BioRad iQ5 Realtime PCR system og StepOnePlus Realtime PCR system (ABI) med Realtime PCR Master Mix inneholder SYBR Grønn (QPK-201, Toyobo, Japan) og unike primere (Tabell S1). Tre til fire sampler for hver gruppe var detected.Gene uttrykk Resultatene ble normalisert til p-aktin mRNA.
Statistisk analyse
Studentenes
t
-test ble brukt til å evaluere lesjon nummer og antall BrdU eller Ki67- positive celler. Fishers eksakte test evalueres metastatisk rate. Kaplan-Meier-analysen evaluert overlevelsestid. Ekspresjonsplasmider forskjeller mellom fire gruppene ble analysert ved hjelp av ANOVA.
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
IL-6
sletting akselererer onkogene
Kras
G12D
indusert lunge tumorigenesis
Som tidligere beskrevet,
Kras
G12D
mus utviklet lungesvulster etter en lang ventetid [39].
IL-6
– /- mus utviklet normalt [38], og viste ikke lungesvulster gjennom 54 ukers alder (data ikke vist). Etter adeno-Cre innånding, bekreftet PCR-analyse rekombinasjon av den betingede
Kras
G12D
allel (figur S1).
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus hadde en median overlevelse på 37 uker etter adeno-Cre vaksinasjon, betydelig lengre enn
Kras
G12D
mus (
P
0,0001) (tabell 1). Mus ble avlivet etter 2, 4, 20, 28 og 32 uker etter infeksjon, og lungelesjoner i H E-fargede snitt ble analysert ved hvert tidspunkt. På 2 uker etter infeksjon (
n
= 3), begge
Kras
G12D Hotell og
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus hadde tidlig lungelesjoner. På 4 uker etter smitte,
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus hadde mer tidlige lungelesjoner enn
Kras
G12D
mus (figur 1A-C). Disse lesjonene var atypisk adenomatøs hyperplasi (AAH) og epiteliale hyperplasia (EH) av bronkiolene, som rapportert tidligere [39].
Genotype
Antall behandlede
Median overlevelse (uker) *
Survival range ( uker)
IL-6
– /-
13 54
Kras
G12D
1434.627.9 ~ 39,0
Kras
G12D; IL-6
– /-
38 37,0
a29.3 ~ 46.7
p53
FLOX /FLOX
8 52
p53
FLOX /FLOX; IL-6
– /-
9 52
Kras
G12D; p53
FLOX /FLOX
4316.311.1 ~ 19.7
Kras
G12D; p53
FLOX /FLOX; IL-6
– /-.
44 17.4
b12.7 ~ 23.4Table 1. Sammenligning av lungekreft kohorter
a
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus hadde betydelig lengre overlevelse enn
Kras
G12D
mus (
P
0,0001).
b
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX
; IL-6
– /-
mus hadde betydelig lengre overlevelse enn
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX
mus (
P
0,01). * Median ventetid vist er etter adeno-Cre behandling på 6-10 ukers alder, anslått av Kaplan-Meier analyse. CSV Last ned CSV
(A og B) representative bilder av H E-farget lunge vev seksjoner fra (A)
K Hotell og (B)
KI
mus 4 uker etter infeksjon med adeno-Cre. Pilene viser tidlige lesjoner. (C) Kvantifisering av lesjoner i
K product: (
n
= 3) og
KI product: (
n
= 5) mus 4 uker etter infeksjon med adeno-Cre. Data er vist som midlere + S.E.M. **
P
0,01. (D og E) Representative bilder av H E-farget lunge vevssnitt fra (D)
K Hotell og (E)
KI
mus 20 uker etter infeksjon med adeno-Cre. (F) Kvantifisering av små lesjoner ( 1,5 mm) i
K Hotell og
KI
mus (
n
= 6) 28 uker etter infeksjon med adeno-Cre . Data som vises er gjennomsnittet + standardavvik *
P
0,05. (G og H) Representative bilder av H E-farget lunge vevssnitt fra (G)
K Hotell og (H)
KI
mice28 uker etter infeksjon med adeno-Cre. Pil indikerer en stor svulst. (I) Kvantifisering av store svulster ( 1,5 mm) i
K Hotell og
KI
mus (
n
= 6) 28 uker etter infeksjon med adeno-Cre . Data som vises er gjennomsnittet + standardavvik **
P
0,01. (J og K) Representative bilder av Endomucin-farget lunge vev seksjoner fra (J)
K Hotell og (K)
KI
mus 28 uker etter infeksjon med adeno-Cre. Scale bar indikerer 500 mikrometer i (A, B, D, E, G og H), eller 100 mikrometer i (J og K). Forkortelser:
K
=
Kras
G12D
.
KI
=
Kras
G12D
;
IL-6
– /-.
IL-6
sletting forsinker onkogene
Kras
G12D
indusert lungetumorprogresjon
på 20 uker etter infeksjon, lungesvulster i
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus var beskjedent mindre og mindre tett enn de i
Kras
G12D
mus (figur 1D og E). På 28 uker etter infeksjon sammenlignet med
Kras
G12D
mus, flere lesjoner ble observert i
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus med flertallet av lesjoner i tidlige stadier av kreftutvikling (figur 1F). Men svulster ble observert 3-10 mm i diameter i lungene av
Kras
G12D
mus, mens flertallet av
Kras
G12D
; IL-6
– /-
lungesvulster var mindre enn 1,5 mm (figur 1G-I). Videre, selv om IL-6 signal fremmer hud tumorvekst og angiogenese i en parakrint mote [4], vi gjorde ikke oppdage noen forskjell mellom
Kras
G12D Hotell og
Kras
G12D
; IL-6
– /-.
Mus etter immunhistokjemisk farging med Endomucin, en microvessel tetthet markør for å måle angiogenese indeksen (figur 1J og K)
IL -6
sletting demper lunge svulst spredning
For å avgjøre om tumor spredning påvirkes av
IL-6
sletting
in vivo
, målte vi BrdU-merking celler i lungesvulster. Betydelig færre merkede kjerner ble observert i lunge seksjoner fra
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus 20 uker etter infeksjon med adeno-Cre sammenlignet med de som stammer fra kontroll
Kras
G12D
mus (figur 2A-C). Lignende resultater ble observert fra Ki67 flekker i lunge seksjoner fra
Kras
G12D Hotell og
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus 28 uker etter infeksjon med adeno-Cre (figur S2). Uttrykk av Perk, som fungerer nedstrøms Kras og er assosiert med kreft celleproliferasjon, ble redusert i svulster fra
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus 20 uker etter infeksjon med adeno-Cre sammenlignet med
Kras
G12D
mus (Figur 2D og E). Caspase-3 farging viste ingen forskjeller i tumorceller apoptose mellom
Kras
G12D Hotell og
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus (figur 2F og G).
(A og B) Representative bilder av BrdU-farget lunge vev seksjoner fra (A)
K Hotell og (B)
KI
mus 20 uker etter infeksjon med adeno -Cre. (C) Kvantifisering av BrdU-positive tumorceller i lungevev deler av
K Hotell og
KI
mus (
n
= 4) 20 uker etter infeksjon med adenovirus Cre. *
P
0,05. (D og E) Representative bilder av Perk farget lunge vev seksjoner fra (D)
K Hotell og (E)
KI
mus 20 uker etter infeksjon med adeno-Cre. (F og G) Representative bilder av spaltede caspase-3-farget lunge vev seksjoner fra (F)
K Hotell og (G)
KI
mus 28 uker etter infeksjon med adeno-Cre. Piler indikerer caspase-3 positive tumorceller. Målestokken viser 50 mikrometer i (A, B, F og G), eller 100 um i (D og E). Forkortelser:
K
=
Kras
G12D
.
KI
=
Kras
G12D
;
IL-6
– /-.
IL-6
sletting forlenger overlevelsen av
Kras
G12D
;
p53
FLOX /FLOX
mus
Som tidligere rapportert, ingen metastaser eller lokale invasjoner ble oppdaget i
Kras
G12D
mus [39], og lignende resultater ble observert i
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus.
Kras
G12D
aktivering ledsaget av
p53
sletting kan forårsake lungemetastase [37], derfor
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX
; IL-6
– /-.
Mus ble generert for å undersøke påvirkning av
IL-6
sletting på lungekreft metastase
p53
allelisk rekombinasjon ble bekreftet ved PCR (fig S3).
IL-6
sletting økt median overlevelse av
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX
mus (
P
0,01) (tabell 1) til tross for betydelig lungetumorbyrde i både
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX Hotell og
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX
; IL-6
– /-
mus 12 uker etter infeksjon (figur 3A og B). BrdU flekker indikerte begge grupper av lungesvulster var svært proliferative (figur 3C og D), og ekstra fordel uttrykk var høy i begge gruppene (Figur 3E og F); ingen statistiske forskjeller ble observert.
Representative bilder av lungene (A og B), BrdU flekker (C og D), perk flekker (E og F) og kreftmetastaser (G og H) fra
KP product: (A, C, E og G) og
KPI plakater (B, D, F og H) mus 12 uker etter infeksjon med adeno-Cre. Stiplede linjer (G og H) viser metastastic kreft kanter. Stjernene viser sentrum av metastatiske svulster. Målestokken viser 500 um (A, B, G og H), 50 um (C og D) eller 100 um (E og F). Forkortelser:
KP
=
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX
.
KPI
=
Kras
G12D; p53
FLOX /FLOX
;
IL-6
– /-
.
Til sammenligning 17
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX
; IL-6
– /-
mus og 19
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX
mus ble analysert for metastaser rundt 16 uker etter infeksjon med adeno-Cre (tabell 2). Histologisk metastaser ble funnet i fem av 17
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX
; IL-6
– /-
mus (29,4%) og 10 av 19
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX
mus (52,6%), men denne forskjellen var ikke signifikant (
P
= 0,19). Metastaselesjoner til parietal pleura, ble thymus (Figur S4A og B), og lymfeknuter observert i både
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX Hotell og
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX
; IL-6
– /-
mus (Figur 3G og H). Hjertemetastaser (Figur S4C) ble observert i to av 19
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX
mus (tabell 2).
Nettsteder av metastaser
Kras
G12D; p53
FLOX /FLOX
Kras
G12D; p53
FLOX /FLOX; IL-6
– /-
Lymph node10 av 19 (52,6%) 5 av 17 (29,4%) Thymus1 av 19 (5,3%) 1 av 17 (5,9%) Heart 2 av 19 (10,5 %) 0 av 17Table 2. nettstedet og hyppigheten av metastaser fra primærlungesvulster.
CSV ned CSV
IL-6
sletting endrer, men
p53
sletting demper, noen inflammatoriske cytokiner
For å undersøke om
IL-6
sletting påvirket betennelse, vi målte makrofag tetthet ved hjelp MAC2 flekker [41]. Det ble ikke observert signifikante endringer i makrofagen blandt svulster fra
Kras
G12D
, Kras
G12D
; IL-6
– /-
, Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX
, og
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX
; IL-6
– /-
mus (figur 4A-E). Vi målte dessuten ingen endring i CD3 ekspresjon, en T-celle-markør, på en hvilken som helst av de fire tumor gruppene (figur S5b).
(AD) Representative bilder av MAC2-fargede lunge vevssnitt fra (A)
K Kjøpe og (B)
KI
mus 28 uker etter smitte og fra (C)
KP
og (D)
KPI
mus 12 uker post- infeksjon med adeno-Cre. (E) Kvantifisering av MAC2-positive makrofager i lungesvulster fra
K
,
KI, KP
, og
KPI
mus (
n
= 3 ). Ingen statistisk signifikant forskjell ble observert. (F og G) Gene ekspresjon av IL-1β, TNFa, CCL-7, CCL-19, CCL-20, CXCL-5, CCL-8 og CCL-24 i tumorer fra
K
,
KI, KP
, og
KPI
mus ble bestemt ved real-time PCR. Tre til fire tumorer i hver gruppe ble detektert og triplikate PCR ble utført. Genekspresjon ble normalisert til p-aktin mRNA. *
P
0,05 vs.
K
svulster. Forkortelser:
K
=
Kras
G12D
.
KI
=
Kras
G12D
;
IL-6
– /-
.
KP
=
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX
.
KPI
=
Kras
G12D; p53
FLOX /FLOX
;.
IL-6
– /-
Flere cytokiner spiller viktige roller i den inflammatoriske prosess. Listen inkluderer IL-1, TNFa og IL-6. Kjemokiner utgjør den største familien av cytokiner og er klassifisert i grupper polypeptid av plasseringen av cysteinrester nær aminoenden (for eksempel C-C, C-X-C, eller CX3C) [42]. Onkogene Ras induserer sekresjon av ELR1 + CXC kjemokin familie for å fremme tumorgenese [43]. Noen kjemokiner og vekstfaktorer som er involvert i tumorprogresjon [42], så vi skjermet inflammatoriske cytokin endringer i svulster med real-time PCR. Tre prøver hver tumor gruppe ble brukt til å utføre real-time PCR uten replikere. Det var ingen signifikante forskjeller ble funnet for IL-1α, CXCL-1, CXCL-5, CXCL-9, CXCL-12, CXCL-16, TGF-B2, BNIP2, BMP4, CCL-2, CCL-7, CCL-8 , CCL-9, CCL-22, CCL-28 og CX3CL-1 uttrykk blant fire grupper av svulster (figur S5). Screening Resultatene viste noen skiftende trender i noen inflammatoriske cytokiner (figur S5). Vi bekreftet endringene ved hjelp tredoble real-time PCR reaksjoner med 3 til 4 prøver i hver gruppe. Forhøyet uttrykk for TNFa og redusert uttrykk av CCL-19 og CCL-20 ble påvist i svulster fra
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus sammenlignet med
Kras
G12D
mus. Men disse endringene var fraværende mellom svulster fra
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX Hotell og
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX
; IL-6
– /-
mus. Selv om ingen statistiske forskjeller i IL-1β, CCL-7, CCL-8, CCL-24 og CXCL-5 genuttrykk ble bekreftet blant fire kreftgrupper (figur 4F og G).
Vi har også undersøkt den nukleære lokalisering av NF-kB-subenhet p65, noe som er viktig i kreft-relaterte inflammasjon og ondartet progresjon [44,45]. Men ingen signifikant lokalisering endring ble observert blant svulster fra de fire genotyper (figur S6). Og ingen dramatisk endring ble observert i β-catenin ekspresjon i kjernen (fig S6), som er relatert til utvikling av lungekreft [46]. Uttrykk av pSTAT3, som er den viktigste nedstrøms målet for IL-6, ble redusert i noen
Kras
G12D
; IL-6
– /-
tumorer (figur 5), men økte i
p53-
slettet svulster. Disse data indikerte at
IL-6
sletting endret svulst uttrykk for noen inflammatoriske cytokiner, selv om disse endringene ble svekket av
p53
sletting.
Kreftlysatene ble hentet fra
K Hotell og
KI
mus 32 uker etter smitte og fra
KP Hotell og
KPI
mus 15 uker etter infeksjonen for Western blot analyse. Western blot resultatene av pSTAT3 og total-STAT3 ble skannet av en Imagequant LAS 4000mini (GE Healthcare). Andre resultater ble eksponert for røntgenfilmer. Forkortelser:
K
=
Kras
G12D
.
KI
=
Kras
G12D
;
IL-6
– /-
.
KP
=
Kras
G12D
; p53
FLOX /FLOX
.
KPI
=
Kras
G12D; p53
FLOX /FLOX
;
IL-6
– /-
Diskusjoner
Forrige. studier har vist at kreftfremkallende-indusert tumordannelse i
IL-6
– /-
mus er forsinket med 1-2 uker [4,47]; men vi fant ingen forskjell i
Kras
G12D
indusert tumor utbruddet uavhengig av
IL-6
mangel. En mulig forklaring er at
Kras
G12D
aktivering kan indusere lunge tumorigenesis mer robuste enn andre kreftfremkallende.
Noen inflammatoriske cytokiner er assosiert med tumorprogresjon [42]. TNFa kan fungere som en svulst promoter ved å regulere en kaskade av cytokiner, kjemokiner, sammenvoksninger, matriksmetalloproteinaser (MMP) og pro-angiogene aktiviteter [2,48]. I denne studien
IL-6
sletting i
Kras
G12D
svulster oppregulert TNFa uttrykk. Forhøyet ekspresjon av TNFa kan kompensere for tapet av IL-6 og dermed øke tumorigenesis. Imidlertid er tumorprogresjon forsinket i
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus, i samsvar med tidligere resultater [4,47]. Disse data indikerer at
IL-6
er viktig for tumorprogresjon
in vivo
og foreslår at IL-6-inhibering kan ha bifasiske stadium-spesifikke effekter i lungekreft, styrke tumorigenesis tidlig mens undertrykke tumor progresjon senere. Følgelig kan dette utgjøre en risiko for lungekreft pasienter behandlet med IL-6-rettet behandling.
CCL-20 (eller makrofag pro-inflammatorisk kjemokin-3α, MIP-3α), en C-C kjemokin motivet, blir overuttrykt i pankreas karsinom celler og stimulerer veksten av kreftceller [49]. CCL-19 (eller makrofag inflammatoriske proteiner-3-beta, MIP-3β), spiller en viktig rolle i migrasjon av modne dendrittiske celler og T-celler [50]. Både dendrittiske celler og T-celler er dobbelt-egget sverd i svulsten mikromiljøet, i tillegg til å initiere potente antitumorimmunresponser, kan disse cellene også stimulere kreftcellevekst og spredning [51,52]. Vedvarende aktivert eller tyrosin-fosforylert STAT3 (pSTAT3) er funnet i 50% av lungekreft adenokarsinomer [53,54]. pSTAT3 kan forbedre tumor spredning og tap av pSTAT3 arrestasjoner vekst av premaligne lesjoner, nesten abrogere utvikling av avanserte svulster [55]. I denne studien
IL-6
sletting i
Kras
G12D
svulster resulterte i nedregulering av pSTAT3, CCL-19 og CCL-20. Perk uttrykk ble redusert i
Kras
G12D
; IL-6
– /-
svulster 20 uker etter infeksjon (figur 2), men økte i de fleste
Kras
G12D
; IL-6
– /-
svulster 32 uker etter infeksjon (figur 5). Disse dataene antyder at tidlig stadium, tumorvekst kan bli forsinket ved lav uttrykk for Perk, pSTAT3 og CCL-20. Under senere stadier, kan tumorvekst induseres ved oppregulering av Perk og TNFa, selv om disse mekanismene trenger videre studier.
Våre data viser at
p53
sletting mer dramatisk påvirket
Kras
G12D
indusert lungekreft enn
IL-6
sletting. p53
flox/flox
;
IL-6
-/-
.
doi:10.1371/journal.pone.0080885.s001
(TIF)
Figure **
P
0,01. p53
flox/flox
;
IL-6
-/-
.
doi:10.1371/journal.pone.0080885.s003
(TIFF)
Figure p53
flox/flox
;
IL-6
-/-
.
doi:10.1371/journal.pone.0080885.s004
(TIF)
Figure . p53
flox/flox
;
IL-6
-/-
.
doi:10.1371/journal.pone.0080885.s005
(TIF)
Figure p53
flox/flox
;
IL-6
-/-
.
doi:10.1371/journal.pone.0080885.s006
(TIFF)
Table S1.
