Abstract
CDK /Rb /E2F veien er ofte forstyrret i lungekreft, og dermed er det spådd at blokkering av E2F veien ville ha terapeutisk potensiale. For å teste denne hypotesen har vi undersøkt aktiviteten til HLM006474 (et lite molekyl pan-E2F hemmer) i lungekreft cellelinjer som monoterapi og i kombinasjon med andre forbindelser. HLM006474 reduserer levedyktigheten til både SCLC og NSCLC linjer med en biologisk IC
50 som varierer mellom 15 og 75 pM, men med ingen signifikant forskjell mellom gruppene. Kombinasjon av HLM006474 med cisplatin og gemcitabin demonstrere lite synergi; Men synergizes HLM006474 med paclitaxel. Overraskende, oppdaget vi at kort behandling av celler med HLM006474 ført til en økning av E2F3 protein nivåer (på grunn av de-undertrykkelse av disse promoter nettsteder). Siden paclitaxel følsomhet har vist seg å korrelere med E2F3 nivåer, hypotese vi at HLM006474 synergi med paclitaxel kan være mediert ved induksjon av forbigående E2F3. For å teste dette, ble H1299 celler utarmet av E2F3a og E2F3b med siRNA og behandlet med paclitaxel. Analyser av spredning viste at begge sirnas betydelig redusert paclitaxel følsomhet, som forventet. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at HLM006474 kan ha effekt ved lungekreft og kan være nyttig i kombinasjon med taxaner
Citation. Kurtyka CA, Chen L, Cress WD (2014) E2F Hemming synergizes med paclitaxel i Lung Cancer cellelinjer. PLoS ONE 9 (5): e96357. doi: 10,1371 /journal.pone.0096357
Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center i Dallas, USA
mottatt: 18 desember 2013; Godkjent: 04.04.2014; Publisert: May 15, 2014
Copyright: © 2014 Kurtyka et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Cancer Institute (CA119997), Bankhead Coley Cancer Research Program of Florida Department of Health (FDH 08BB-05) og Moffitt kreftsenter. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. WDC er en oppfinner på amerikanske patent 8,202,886 B2 holdt av University of South Florida. Ellers forfatterne har ingen interessekonflikt. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
retinoblastom protein (vanligvis kalt Rb) er anerkjent som en av de viktigste kreftdempere hos mennesker. Sammen med tilsvarende «lomme» proteiner p107 og p130, er det ansvarlig for å regulere cellesyklusprogresjon [1]. Rb-familien regulerer cellesyklusen ved binding og hemme transkripsjonen aktivitet av tidlige 2 faktorer (E2Fs) og dens tumor suppressor aktivitet er tett knyttet til denne funksjonen [2]. Når fosforylert (typisk ved hjelp av CDK 2, 4 og 6 i G1), blir Rb inaktivert, og dermed frigjøre E2Fs og at cellesyklusprogresjon [3]. For å unngå avvikende cellesyklus inngang, CDK-inhibitorer så som CDKN2A (vanligvis kjent som p16) hindrer CDK fra fosforylerende Rb og tvinge celler til å forbli i G1 [4].
Avhengig av sammenhengen, kan E2F-familiemedlemmer tjene som transkripsjonelle aktivatorer som øker cellesyklusprogresjon eller transkripsjonelle repressorer som hemme cellesyklusprogresjon [5]. Som aktivatorer, er E2Fs anerkjent som viktig i spredning gjennom deres transcriptional aktivering av S-fase gener. E2Fs aktivere transkripsjon via samarbeid med histon acetyltransferase (HAT) aktivitet [6], [7]. Som repressorer, E2Fs hemme transkripsjon av gener som anvendes i S-fasen adgang ved å binde seg til sine promotorer og undertrykker transkripsjon gjennom deres evne til å binde til Rb og andre lomme proteiner, som i sin tur rekruttere kromatin modifiserende midler så som histon deacetylases (HDACs) [6] – [8]. Av alle E2F-familiemedlemmer er E2F3 den eneste individuelt er nødvendig for cellulær proliferasjon å oppstå [9] – [13]. E2F3 er viktig for transkripsjon av en rekke gener for S-fasen oppføring og har vist seg å ha roller i transkripsjon av gener som er nødvendige for G2 /M-faser (for eksempel Aurora-kinase A [14], CDC2 [15], og cyklin B1 [15], [16]). Det er to E2F3 isoformer, E2F3a og E2F3b, hver som følge av transkripsjon ved to forskjellige arrangører. E2F3b nivåer forblir konstant gjennom cellesyklus, mens E2F3a nivåer svinge og nå maksimal ekspresjonsnivåene rundt G1 /S overgang [17] – [19]. Muse knockout studier avslører at E2F3a og E2F3b er generelt kompensatorisk til hverandre [20], [21], men delesjon av begge isoformer er dødelig [9], [20]. Endelig E2F3 er mer høyt uttrykt i flere kreftformer (se [5] for en gjennomgang), inkludert lunge [22] og dens aktivitet er korrelert med økt følsomhet for taxan behandling i eggstokkreft [23] og ER-negativ brystkreft [ ,,,0],24].
CDK /Rb /E2F veien blir forstyrret i nesten hvert tilfelle av menneskelig lungekreft, den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [25]. I småcellet lungekreft (SCLC), som står for ca 15% av lungekrefttilfellene, den vanligste mekanismen for Rb pathway avbrudd er mutasjon av Rb protein i seg selv. Faktisk er omtrent 90% av småcellet lungekreft mangler et funksjonelt RB-protein [26], [27]. I motsetning til dette, i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), Rb mutasjons står for 15-30% av disse kreftformene [26], [28], og dereguleringen av CDK /Rb /E2F sti forekommer hyppigere via stanse av den CDK-inhibitor p16 [29] – [32]. I de fleste tilfeller av NSCLC der
RB1
genet er intakt, hemmere av CDK4 og 6 ville representere en potensiell måte å målrette denne veien. Denne hypotesen har blitt undersøkt i flere kliniske studier og foreløpige resultater i brystkreft er svært lovende [33] -. [35], noe som tyder på at CDK /Rb /E2F pathway hemmere kan ha en viktig rolle å spille i behandlingen av ulike kreftformer
fordelen med CDK-inhibitorer kan være begrenset til tumorer hvori Rb-proteinet forblir WT og funksjonelt, og således, reagenser som kan målrettes mot denne reaksjonsvei nedstrøms for Rb kan være nyttig i kreftformer hvor Rb er ofte mutert (for eksempel lungekreft). For å teste denne hypotesen har vi undersøkt aktiviteten til HLM006474 mot et panel av lungekreftcellelinjer. HLM006474 (også omtalt her som 6474) er et lite molekyl pan-hemmer av E2F-DNA-binding [36]. Selv om IC
50 av HLM006474 er forholdsvis høy (30 uM), har den funnet anvendelse som et verktøy for forbindelse [37] – [40].
In vivo
studier indikerer at effekten av 6474 behandling på forskjellige cellelinjer inkluderer en reduksjon i celleformering og en økning i apoptose og redusert invasjon i en tre-dimensjonal vevskultur modell system [36]. HLM006474 kan være nyttig i forebygging av cancer som fører til en økning i apoptose og reduksjon av proliferasjon i tumorigen humane embryonale stamceller [39], så vel som fører til en reduksjon i tumordannelse hos mus embryo utsatt for retinoblastom [40]. Sammen antyder disse resultatene at interferens med E2F-aktivitet ved hjelp av små molekyler som kan ha klinisk anvendelse i kreftterapi. I dagens arbeid, tilbyr vi en grundigere karakterisering av 6474 i sammenheng med lungekreft. HLM006474 reduserer levedyktigheten til et bredt spekter av cellelinjer med en biologisk IC
50 som varierer mellom 15 og 75 mikrometer. Kombinasjon av HLM006474 med vanlige kjemoterapeutika cisplatin og gemcitabin demonstrerer lite synergi; Men synergizes HLM006474 med paclitaxel. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at HLM006474 kan ha effekt mot kreft hvor E2F er deregulert og kan være nyttig i kombinasjon med andre legemidler som er rettet mot cellesyklusen.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kjemiske forbindelser
lungekreft~~POS=TRUNC ble hentet fra ATCC eller opphavsmenn og ble gitt av Moffitt SPORE i Lung Cancer Cell Kjerne anlegget. Alle linjer er godkjent av genotyping og holdes fri for
Mycoplasma
. SCLC-cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 med 10% FBS og 1% pen /strep. NSCLC-cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 med 10% FBS uten antibiotika. HLM006474 ble syntetisert og validert av Moffitt kjemi Kjerne som tidligere beskrevet [36]. Gemcitabin (Gemzar, Eli Lilly) ble kjøpt gjennom Moffitt Pharmacy og oppløst i vann. Cisplatin og paclitaxel ble kjøpt fra Sigma og konsentrerte stamløsninger ble utarbeidet i dimetylsulfoksid.
siRNA knockdown
Celler platet med -50% konfluens i seks-brønns plater ble transfektert hjelp Lipofectamine 2000 (Livet Technologies) i henhold til leverandørens instruksjoner med 200 pmol av enten siGENOME Non-targeting siRNA # 2 (Dharmacon) eller siRNA rettet mot E2F3a eller E2F3b som beskrevet i en artikkel av Hurst
et al product: [41]. Cellene ble høstet fire timer etter transfeksjon for cellelevedyktighet analyse (som beskrevet nedenfor). De resterende cellene ble re-belagt og høstet for Western blot analyse 24 timer etter transfeksjon.
Levedyktighet analyser
Den antiproliferative aktivitet av forbindelser og kombinasjoner ble evaluert ved hjelp av en høy gjennomstrømming CellTiter-Blue celleviabilitet assay (Promega), som tidligere beskrevet [42]. For analysene, ble 1000-celler i 24 pl sådd ut i 384-brønns plater og inkubert over natten ved 37 ° C, 5% CO
2. Neste dag, stoffet ble fortynnet i media og 6 pi disse fortynninger lagt til passende brønner ved hjelp av en automatisert pipettering stasjon. Fire replikate brønner ble brukt for hver medikamentkonsentrasjon. Cellene ble inkubert med legemiddel i 120 timer, og på dette tidspunkt ble 5 ul CellTiter-Blue-reagens (Promega Corp., Madison, WI) ble tilsatt. Cellelevedyktigheten ble bedømt ved evnen av de gjenværende behandlede celler til bioreduce resazurin til resorufin (579 nm Ex /Em 584 nm). Fluorescens ble lest med en Synergy HT mikroplateleser (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT). IC
50 ble bestemt ved anvendelse av en sigmoidal likevektsmodell regresjon ved hjelp XLfit versjon 4.3.2 (ID Business Solutions Ltd.) og er definert som den konsentrasjon av medikament som er nødvendig for en 50% reduksjon i vekst /levedyktighet. For 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazoliumsalter (MTS) celleviabilitet analyser, CellTiter 96 Aqueous One Solution fra Promega ble tilsatt i henhold til leverandørens instruksjoner til cellene i 2 timer etter behandling med medikament ved bemerket dose i 72 timer. Alle forsøk ble utført in triplo og gjentas minst tre ganger.
Kombinasjonsindeksene
IC
50-verdier oppnås fra enkeltmedikament cellenes levedyktighet analyser ble anvendt for å konstruere kombinasjons eksperimenter. For 6474 kombinasjoner med cisplatin, gemcitabin og paklitaxel disse forholdene var 01:01, 500:1 og 4000:1 hhv. For medikamentkombinasjons forsøk ble cellenes levedyktighet analysene ble utført, og resultatene analysert med hensyn på synergistisk, additiv eller antagonistisk effekt ved bruk av kombinasjonsindeksen (CI) metode som er utviklet av Chou og Talalay [43]. Kombinasjon indekser CI 1, CI = 1, og CI 1 indikerer synergisme, additive effekter, og antagonisme, henholdsvis
Antistoffer og Western blotting
Vest-blotter ble utført som tidligere beskrevet [36. ], [44], [45]. Kort sagt ble helcellelysater underkastet SDS-PAGE og overført til PVDF-membran. Påvisning av proteiner ble gjennomført ved hjelp av pepperrot-konjugert sekundære antistoffer og forbedret chemiluminescence (ECL) kjøpt fra Amersham eller Thermo Scientific. Ulike antistoffer som brukes inkludert E2F1 (C-20, SC-193, Santa Cruz), E2F3 (C-18, SC-878, Santa Cruz), PARP (# 9542L, Cell Signaling Technology), og monoklonale β-aktin (klone AC -15, katt no: A5441, Sigma). Adobe Photoshop CS ble brukt til å kvantifisere vestlige blot bandet intensitet målinger direkte fra eksponerte filmer ved hjelp av den rektangulære markeringsverktøyet /histogram og det inverterte skannet film bilde. Denne samme kvadrat ble brukt for alle ytterligere båndavlesninger for å sikre at det samme område, ble analysert for hvert bånd. Avlesningene ble deretter justert for å ta hensyn til aktin og bakgrunn og vilkårlig normalisert til cellelinjen H23 (gitt en verdi av 1).
Sanntids polymerasekjedereaksjon
RNA ble høstet fra cellene bruker RNeasy mini kit fra Qiagen. Revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (PCR) ble deretter utført ved anvendelse av iScript cDNA syntesesett (Bio-Rad). Dette cDNA ble deretter benyttet i real-time PCR ved hjelp av enten iQ SYBR Grønn Supermix (Bio-Rad) eller Perfecta SYBR Grønn SuperMix (Quanta biovitenskap, VWR). E2F1, E2F3, E2F4, tubulin, MCM2, MCM10, CCNE2, og GAPDH primere ble bestilt fra Integrerte DNA Technologies. Primersekvenser er som følger: E2F1 F (5′-GCTGGACCACCTGATGAATATC-3 «), E2F1 R (5′-TCTGCAATGCTACGAAGGTCCTG-3′), E2F3a /b F (5»-CGTCTCTTGGTCTGCTCAC-3 «), E2F3a /b R (5 «-CACTTCTGCTGCCTTGTTC-3′), E2F4 F (5»- CTGAAGAGTGTGAGTGGTC -3 «), E2F4 R (5′- GCAGAGGTGGAGGTGTAG -3′), tubulin F (5»-GGGGCTGGGTAAATGGCAAA-3 «), tubulin R (5»- TGGCACTGGCTCTGGGTTCG-3 «), MCM2 F (5′-CTGTGTGTGGTGAGGGACAC-3′), MCM2 R (5»-CTTGTCCTGGTCCATCTGGT-3 «), MCM10 F (5′-CGTCAGTGAGCAGCATGAAT-3′), MCM10 R (5»-TCCCGTTCCCATTTGTAGAG- 3 «), CCNE2 F (5′-CAGGTTTGGAGTGGGACAGT-3′), CCNE2 R (5»-ACTTCCTCCAGCATAGCCAA-3 «), GAPDH F (5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′), og GAPDH R (5»-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3- «).
Statistisk analyse
for real-time PCR-analyse for tidspunktet eksperiment, forskjellen mellom uttrykket av hver eksperimentelle genet (E2F1, E2F3, E2F4, CCNE2, MCM2, og MCM10) og ekspresjon av kontroll-genet (tubulin) ble beregnet for hver cellelinje ved hvert tidspunkt. Forskjellen mellom hver av de ikke-0 timers tidspunkter og de 0-timerstidspunktet avlesninger for hvert gen i hver cellelinje ble beregnet ved bruk av t-tester med Welch korreksjon. Paclitaxel IC
50 ble log-transformeres til å forbedre normalitet. Korrelasjonen av E2F3 mRNA og protein uttrykk med log paclitaxel IC
50-tallet ble beregnet ved bruk av Pearson korrelasjonskoeffisient. Wilcoxon rank-sum-tester ble brukt til å utforske forskjellen på cellen levedyktighet i kontroll siRNA behandling med enten E2F3a eller E2F3b siRNA behandling.
Resultater
HLM006474 har bred antiproliferativ aktivitet
for å undersøke potensialet i 6474 i behandlingen av lungekreft, bestemt vi 6474 IC
50 i sytten lungekreft cellelinjer (tabell 1). Denne analysen inkluderte åtte ikke-småcellet lungekreft linjer (NSCLC) og ni småcellet lungekreft linjer (SCLC). I dette assay levedyktighet, ble cellene sådd ut ved lav tetthet på dag null og ble dyrket i nærvær av forskjellige konsentrasjoner 6474 i fem dager. Etter fem dager ble den relative levedyktigheten av celler bestemt ved farving med CT-Blue (Promega). Resultatene viser at 6474 IC
50 varierer fra ~15 til ca 75 mikrometer på tvers av de sytten cellelinjer. Den gjennomsnittlige biologisk IC
50 av alle cellelinjer ble 31,4 (6,1) pM, som er i det vesentlige identisk med den biokjemiske IC
50 29,8 (± 7,6 uM, tidligere rapportert [36]. Det var ingen statistisk signifikant forskjell mellom SCLC og NSCLC.
Korte behandlinger med HLM006474 fører til økt uttrykk av flere kjente E2F-regulerte gener
Som en del av vår analyse av HLM006474, undersøkte vi uttrykket av E2F-familiemedlemmer etter behandling ved Western blotting. NSCLC-cellelinjene H292 og H1299 ble behandlet med 60 uM HLM006474 for 0, 3, 6, 9, 12 og 24 timer og analysert via Western blot (figur 1 A). Overraskende, protein nivåer av både E2F3a og b isoformer økt i tidlig tidspunkt (typisk rundt 6-9 timer). nivåer av E2F1 protein økte mer beskjedent etter behandling, med en topp mellom 6 og 12 timer og tilbake til utgangsnivået etter 24 timer. i real- time PCR-analyse med tubulin som en kontroll, E2F3 mRNA-nivåer økte signifikant etter 3 timers behandling og deretter redusert i hvert påfølgende tidspunkter (figur 1 B), mens E2F1 mRNA-ekspresjonsnivåer ble signifikant økt etter korte behandlingstider i H292 alene (figur 1C ) og E2F4 nivå holdt seg konstant eller reduseres ved hvert tidspunkt (figur 1D). Det var også registrert at noen gener som vanligvis regulert av E2Fs; MCM10 (figur 1E), MCM2 (figur 1F), og CCNE2 (figur 1G); ble mer sterkt uttrykt i tidlige tidspunkter på en måte som kan sammenlignes med de endringer sett i E2F3 mRNA-ekspresjon. Resultatene er vist i figur 1 viser at behandling med en inhibitor av E2F-DNA-binding kan resultere i aktivering av E2F-regulerte mål, inkludert autoregulert E2F-familiemedlemmer. E2F-familien er kjent for aktivt å undertrykke transkripsjon [46] – [49], og dermed foreslår at behandling med HLM006474 kan fortrenge E2F-undertrykkende komplekser og derved aktiverer transkripsjon av E2F-regulere gener som hovedsakelig undertrykt av E2F komplekser. For å utforske denne muligheten, brukte vi siRNA spesielt mot E2F1, E2F3a, E2F3b, E2F4 og Rb å utarme to NSCLC cellelinjer av ulike E2F komplekser. Mikroarray ble utført for å undersøke effekten av disse siRNAs på ekspresjon av et E2F signatur tidligere definert basert på E2F3 overekspresjon [50]. Resultatene, som vil bli publisert andre steder, viser at utarming av individuelle E2Fs resultater i mange E2F signatur gener aktiveres, som ville forventet fra en de-undertrykkelse modell.
A
. NSCLC cellelinjer H1299 og H292 ble behandlet med 60 uM HLM006474 for 0, 3, 6, 9, 12 og 24 timer, deretter høstet og undersøkt ved Western blot. Beskjedne økninger i E2F1 og mer dramatiske økninger i E2F3a og b proteinnivåer ble observert ved tidlig tidspunkt i begge cellelinjer.
B-D
. mRNA ble høstet fra celler som ble behandlet som beskrevet i 1A, omdannet til cDNA ved hjelp av RT-PCR, og analysert for ekspresjonsnivåene av E3F3 (
B
), E2F1 (
C
), og E2F4 (
D
) ved hjelp av real-time PCR og tubulin som en kontroll. Korte behandlinger med 6474 endret mRNA uttrykk nivåer av E2F3 og E2F1, men ikke E2F4.
E-G.
MRNA ekspresjon av kjente gener som vanligvis reguleres av E2Fs ble analysert på en måte i likhet med den foregående beskrivelsen i 1B-D. Expression nivåer av MCM10 (
E
), MCM2 (
F
), og CCNE2 (
G
) mRNA ble analysert med tubulin som en kontroll og ble alle kjent for å være mer sterkt uttrykt følgende korte behandlinger med 6474. Merknader: ns representerer ikke signifikant, * representerer p 0,05, ** representerer p. 0,01
HLM006474 synergizes med paclitaxel
Etter å ha slått fast at 6474 har anti-proliferative effekter på lungekreftcellelinjer , men kan påvirke E2F-regulerte gener i en kompleks måte, forsøkte vi å finne ut om 6474 ville synergize med cellegiftene som vanligvis brukes i lungekreft behandling. H1299-celler ble behandlet med 6474 alene og i kombinasjon med cisplatin, gemcitabin og paclitaxel. Kombinasjoner ble valgt basert på IC
50 av cellene til de enkelte forbindelser og kombinasjonsindeksene beregnet [43]. Figur 2 viser at det er motsetninger mellom 6474 og cisplatin (panel 2A, CI gjennomsnitt 1,40) og gemcitabin (panel 2B, CI gjennomsnitt 1,39). I motsetning til dette, 6474 svakt synergizes med paclitaxel (panel 2C, CI gjennomsnitt 0,98). For ytterligere å undersøke naturen av synergi mellom 6474 og paclitaxel, ble H1299-celler behandlet med moderate doser av hvert medikament alene eller i kombinasjon, og anvendes i Western blot-analyse. Utseendet av PARP spaltet i celler behandlet med medikamentkombinasjonen bekrefter at kombinasjonen av 6474 og paclitaxel induserer apoptose mer enn noen av midlene alene (figur 2D). For å undersøke om denne synergi ville være observert i flere cellelinjer, vi også undersøkt NSCLC cellelinje H292. Som i tilfellet av H1299-celler, 6474 synergized med paklitaxel (panel 2G, CI gjennomsnitt 0,96), men viste ingen synergi med cisplatin (panel 2E, CI gjennomsnitt 1,51) eller gemcitabin (panel 2F, CI gjennomsnitt 1,46).
A-C.
H1299-celler ble underkastet analyser levedyktighet i nærvær av 6474 (HLM) i kombinasjon med cisplatin (
A
, CisPt), gemcitabin (
B
, Gem) og paclitaxel (
C
, Pac), som angitt (se metoder). Resultatene viser synergi med paclitaxel (CI gjennomsnitt 0,98) og antagonisme med cisplatin og gemcitabin (CI gjennomsnittlig 1,40 og 1,39, henholdsvis).
D
. Western blotting viser at i H1299-celler behandlet i 72 timer med 20 uM 6474 alene, 5 nM paclitaxel alene, eller en kombinasjon av de to, 6474 og paclitaxel synergistisk til induksjon av PARP spaltning.
E Anmeldelser –
G
. H292-celler ble testet i lignende levedyktighet analyser for å fastslå effekten av 6474 (HLM) kombinert med cisplatin (
E
, CisPt), gemcitabin (
F
, Gem) og paclitaxel (
G
, Pac). Som sett i H1299 celler, 6474 synergizes med paclitaxel (CI gjennomsnitt 0,96), men er antagonistisk med cisplatin (CI gjennomsnitt 1,51) og gemcitabin (CI gjennomsnitt 1,46).
E2F3 nivåer innvirkning følsomhet for paclitaxel
observasjonene som et E2F-inhibitor kan virke synergistisk med paklitaxel og den tidligere omtalte økning i E2F3 nivå etter begynnelsen av tidspunkt behandlinger med HLM006474 foreslått at E2F3 aktivitet kan spille en rolle i paclitaxel følsomhet. Sanntids-PCR ble benyttet for å analysere den endogene ekspresjon av E2F3 (med GAPDH tjener som en intern kontroll), og deretter disse verdiene ble korrelert til paclitaxel logikken
50 av hver cellelinje (figur 3A). Lysater fra ti NSCLC-cellelinjer ble kjørt i Western blot (Figur 3B) og densitometrically analysert ved bruk av β-actin som en kontroll. Disse E2F nivåene ble deretter plottet mot den tilsvarende paclitaxel logikk
50 verdier (Figur 3C). I både sanntids-PCR og Western blot-analyser, en sterk invers korrelasjon mellom E2F3 og paclitaxel IC
50 ble notert. Til mer formelt teste denne hypotesen, brukte vi siRNA å utarme H1299 celler E2F3a og E2F3b og deretter bestemmes deres følsomhet for paclitaxel målt i MTS analyser. Western blotting avslører en nesten komplett knockdown av målrettede E2Fs i H1299 celler (figur 4A). Kontroll sirnas påvirket ikke E2F uttrykk. Som ventet viser figur 4B at cellene med redusert E2F3 nivåene var mindre følsomme for paclitaxel.
A
. cDNA fra ti NSCLC-cellelinjer ble anvendt i sanntid PCR for å påvise endogene E2F3 uttrykk nivåer (sammenlignet GAPDH som en kontroll). Uttrykket nivåer ble deretter sammenlignet med paclitaxel logikken
50 i hver linje og fremstilles grafisk som vist.
B
. Lysates fra ti NSCLC cellelinjer ble utarbeidet og kjørte i en Western blot å oppdage endogene E2F3 nivåer.
C
. Densitometrically analyserte verdier av proteinet uttrykket nivåer (sammenlignet med p-aktin som en kontroll) ble deretter fremstilt grafisk mot paclitaxel logikken
50 for hver linje slik som vist.
A
. H1299 celler ble transient transfektert med 200 pmol kontroll, E2F3a, eller E2F3b siRNA og høstet etter 24 timer. Western blot av disse lysater demonstrere omfanget av E2F knockdown.
B
. MTS-analyser ble anvendt for å bestemme sensitiviteten til hver cellelinje til 50 nM paclitaxel. Celler med forminskede E2F3 nivåer var mer levedyktig i nærvær av paclitaxel enn kontrollceller. Merknader: * representerer p 0,05, ** representerer p 0,01
Konklusjoner
CDK /Rb /E2F sti representerer et godt mål for behandling av ulike solide svulster.. Selv om det har vært utvikling treg på grunn av giftigheten av tidlig forbindelsene, CDK-inhibitorer begynner å få trekkraft i kliniske forsøk [33], [51], [52]. Vi foreslår at målretting CDK /Rb /E2F sti enda lenger nedstrøms, på E2F-nivå, kan også være av verdi. Dermed har vi undersøkt mulighetene for et pan-E2F inhibitor, HLM006474, i behandling av lungekreft.
Vi foreslår modellen i figur 5 for å forklare våre resultater. For det første ser vi at behandling med 6474 fører til en forbigående økning i ikke bare E2F3 protein og mRNA-ekspresjonsnivåene, men også en økning i mange andre E2F-regulerte transkripter. Disse bakvendt observasjoner er rimelig basert på den lange kjente observasjon at E2Fs er aktive repressors av transkripsjon [46] – [49]; Men de heve bekymringer som pan-E2F kompleks hemming kan ha uønskede konsekvenser. Derfor bør fremtidige E2F målrettede forbindelser selektivt blokkere transkripsjonsaktive E2F komplekser og reserve transcriptional repressing E2F komplekser. For det andre mener vi at de økte nivåer av E2F3 (og sannsynligvis andre E2F-regulerte gener) øke følsomheten av cellene til paclitaxel. Vi baserer denne konklusjonen på sammenhengen observert mellom normale E2F3 nivåer og paclitaxel følsomhet, samt resultatene av E2F3 siRNA eksperimenter. Dette dokumenterer den første koblingen mellom nivåer av E2F3 og paclitaxel i NSCLC, selv om en sammenheng mellom høye nivåer av E2F3 aktivitet og økt følsomhet for paclitaxel har tidligere blitt observert i eggstokkene [23] og ER-negativ brystkreft [24]. Den mekanisme ved hvilken E2F3 genererer følsomhet for paclitaxel er ukjent. En mulighet er at det er relatert direkte til E2F3 rolle i cellesyklusen. For eksempel, i celler med høy E2F3 nivåer, ville det være forventet at cellene ville spre seg mer, og dermed gi cellene en større mulighet til å gå inn M fase (hvor paclitaxel vil være mest effektivt). Imidlertid ville denne forklaringen alene antyder at disse cellene bør være mer følsom for gemcitabin så vel på grunn går inn i S-fasen oftere. Det kan være mer sannsynlig at større følsomhet overfor paclitaxel skyldes apoptose-regulerende gener som blir høyt uttrykt på grunn av økningen i E2F3. Dessuten har det tidligere blitt bemerket at overekspresjon av E2F3 fører til en anrikning av gener som er mikrotubulus-relaterte [23], slik at dette kan kanskje forklare korrelasjoner vi ser mellom E2F3 nivåer og paclitaxel følsomhet. På samme måte som nevnt tidligere, E2F3 har blitt notert å ha en rolle i G2 /M sjekkpunkt gjennom regulering av ekspresjon av Aurora-kinase A [14], CDC2 [15], og cyklin B1 [15], [16], hvilken kan også vise til høyere nivåer av E2F3 fører til en økning i celler som kommer inn at fasen av cellesyklusen, og kanskje vil en økning av paclitaxel følsomhet.
i ubehandlede celler, E2F /dimerisering partner (DP) /Rb komplekser dominerer, og dermed E2F3 nivåene er relativt lav (så vel som mange andre E2F-regulerte gener). Behandling med HLM006474 forstyrrer E2F /DP /Rb undertrykkende komplekser fra binding DNA, noe som resulterer i økt transkripsjon av E2F3 (så vel som mange andre E2F-regulerte gener). I denne modellen, er forhøyede nivåer av E2F3 sensibilisere celler for å taxan behandling, som tidligere vist, gjennom en ukjent mekanisme.
Vi har vist at HLM006474 er effektiv i lungekreft cellelinjer. Videre har vi vist at 6474 synergizes godt med paclitaxel, potensielt på grunn av 6474 er effekter på E2F3 nivåer. Tatt sammen tyder disse resultater på at potente, spesifikke aktivatoren E2F-inhibering kan være anvendbar ved behandling av NSCLC i fremtiden (spesielt i kombinasjon med andre midler), og at E2F3 nivåer kan være en god indikator av paclitaxel følsomhet i NSCLC.
Takk
de mange generøse gaver av reagenser er anerkjent i Materialer og metoder.
Dr. Fumi Kinose av Moffitt sin SPORE i Lung Cancer Cell kjernefasilitet validert cellelinjer, inkludert de ber donert av laboratoriet av John D. Minna ved University of Texas sørvestre i Dallas. Dr. Dung-Tsa Chen og Jimmy Fulp av Moffitt er biostatistikk Kjerne utført statistisk analyse. Drs. Christopher L. Cubitt og Shumin Zhang of Experimental Therapeutics Kjerne Moffitt er utført levedyktighet analyser og dataanalyse.
