Abstract
kreft stamcelle (CSC) teori forutsier at en liten brøkdel av kreftceller besitter unik selvfornyelse aktivitet og megle startfasen og forplantning. Men de molekylære mekanismene som er involvert i CSC regulering er fortsatt uklart, treffer på effektiv målretting av cscs i kreftbehandling. Her har vi undersøkt hypotesen om at Rac1, en Rho GTPase innblandet i kreftcelle spredning og invasjon, er avgjørende for startfasen og metastasering av menneskelig ikke-småcellet adenokarsinom (NSCLA). Rac1 knockdown av shRNA trykt de tumorigene aktiviteter på menneske NSCLA cellelinjer og primære pasient NSCLA prøver, inkludert effekter på invasjon, spredning, forankringsuavhengig vekst, sfære formasjon og lunge kolonisering. Isolert side befolkningen (SP) celler som representerer mulige cscs fra menneskelige NSCLA cellene inneholdt forhøyede nivåer av Rac1-GTP, forbedret
in vitro
migrasjon, invasjon, økt
in vivo
kreft initiere og lunge koloniserende aktiviteter i xenopodet mus. Imidlertid CSC-aktivitet ble også påvist i den ikke-SP befolkning, hvilket antyder viktigheten av terapeutisk målretting av alle celler i en tumor. Videre farmakologisk eller shRNA målretting av Rac1 hemmet tumorigen aktiviteter både SP og ikke-SP NSCLA celler. Disse studiene viser at Rac1 representerer et nyttig mål i NSCLA, og blokaden kan ha terapeutisk verdi i å undertrykke CSC spredning og metastase
Citation. Akunuru S, Palumbo J, Zhai QJ, Zheng Y (2011) Rac1 Targeting undertrykker human ikke-småcellet Adenocarcinoma Cancer Stem Cell aktivitet. PLoS ONE 6 (2): e16951. doi: 10,1371 /journal.pone.0016951
Redaktør: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasil
mottatt: 13 august 2010; Godkjent: 18 januar 2011; Publisert: 9. februar 2011
Copyright: © 2011 Akunuru et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH R01 CA141341 og T32 HL091805. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er fortsatt den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis. Sykdommen er grovt klassifiseres i to Histo-patologiske grupper – småcellet lungekreft (SCLC) og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), med senere gruppen representerer ~80% av lungekrefttilfeller. Adenokarsinomer forekommer i omtrent 55% av NSCLC og 40% av alle lungekreft. Til tross for fortsatt utvikling av kreftbehandling, for tiden den samlede fem års overlevelse for lungekreftpasienter er mindre enn 15% [1]. Ofte eksisterende kjemoterapi, strålebehandling eller kirurgi kan bare delvis fjerne svulsten byrde, etterlot terapi resistente kreftceller som kan regenerere svulsten på barne nettstedet og /eller metastaserer til sekundære nettsider for å initiere nye svulster.
nylige publikasjoner har rapportert identifikasjon av kreft initiere eller kreft stamceller (cscs) fra blod [2], hjerne [3], bryst [4], tykktarm [5], [6], hepatisk [7], bukspyttkjertel [8] , nedbrutt [9], [10], så vel som lungekreft [11], [12], [13]. De cscs er identifisert enten ved unike celleegenskaper som for eksempel Hoechst fargestoff utelukkelse (Hoechst fargestoff-lav side populasjon) eller ved ekspresjon av spesifikke overflatemarkører så som CD133, ALDH eller CD24 /CD44, og de er ofte forbundet med kjemoterapi og stråleterapi motstand. Cscs er definert av deres stamcelle som selvfornyelse evner, deres evne til å differensiere til celletyper som utgjør hoveddelen av svulsten, og til å initiere tumorer på et betydelig redusert dose i mus xenograft studier [7], [14]. NSCLC-initierende celler har blitt isolert fra human lunge-cancercellelinjer basert på økt Hoechst 33342 fargestoff-utløps aktivitet [12]. Den Hoechst fargestoff lave siden befolkningen (SP) celler er beriket for svulst initiere aktivitet sammenlignet med ikke-side befolkningen (NSP) celler og uttrykke forhøyet ABCG2 og andre multi-drug resistance transportører som kan megle terapeutisk motstand.
fremføring av kreft stamcelle teori har ført til forslaget om at målretting CSC kan føre til utrydding av de resterende terapi-resistente tumorceller i pasienter. Nylig Gupta
et al
antydet at indusere differensiering av CSC ved hjelp salinomycin, kan en selektiv kalium ionofor blokkere melke CSC aktivitet og metastasering [15]. Imidlertid har flere nylige rapporter vist at cscs og ikke-cscs kan være av plast og inter-cabriolet i naturen [16] – [17]. For eksempel ble JARID1 negative celler vist seg å representere et forbigående langsom sykling ikke-CSC befolkningen som kan gi opphav til rask sykling JARID1 positive cscs i melanom (13). Det er dokumentert at ikke-cscs kan konvertere til cscs gjennom interaksjon med ekstracellulære matrise og andre miljømessige signaler (14). Dette øker muligheten for at nærmer seg utelukkende rettet mot cscs er ikke tilstrekkelig for kreftterapi, fordi den gjenværende ikke-cscs kan omprogrammeres for å cscs å gjenoppta tumorgenese.
Rac1 er en intracellulær molekyl bryter som transduces signaler i en rekke onkogene veier. Det er ofte funnet å være forhøyet i ekspresjon og /eller aktivitet i en rekke tumorceller og regulerer viktige cellulære prosesser som er relevante for cancercelle atferd, inkludert genekspresjon, celleproliferasjon, aktin cytoskjelettet ombygging og er essensielt for celleretnings migrering og adhesjon. Rac1 aktivitet kan påvirke cellesyklusprogresjon og overlevelse, og det viste seg å være nødvendig i K-ras tumorvekst mediert lunge i en murin spontan lungekreft modell [18]. Men om Rac1 bidrar til human NSCLA tumorvekst og /eller metastase, spesielt hvis Rac1 spiller en rolle i å regulere cscs krever videre undersøkelser. I dagens arbeid viser vi at Rac1 er kritisk involvert i NSCLA celle migrasjon, invasjon og lungemetastasering av SP celler, derfor tjene som en nyttig terapeutisk mål ved å hemme tumor initiering og metastasering av CSC befolkningen i NSCLA.
materialer og metoder
Cell kultur
A549, H23, H1299 og H441 celler ble dyrket i henhold til retningslinjene fra ATCC. Menneske bronkial epitelceller (HBEC) var raus gave fra Dr. Jeffery Whitsett (Cincinnati Children Hospital Medical Center). Primære pasient lunge adenokarsinom prøver ble innhentet skriftlig samtykke fra pasienter under en godkjent institusjon Review Board protokollen ved University of Cincinnati Scientific Review Committee (IRB # 01-09-27-07), og ble brukt i forsøkene i henhold til Cincinnati Children Hospital Medical Senter Scientific Review Committee (IRB # 07-06-57) at identiteten til pasientene forblir anonym. Svulster ble hakket og resuspendert i DMEM inneholdende 0,5 mg /ml Liberase (Roche) og 1% penicillin og streptomycin. Etter 45 minutters inkubering ble oppslemming av cellene passerte gjennom 100 mikron filter og totale celler ble vasket, sådd ut i 10% føtalt bovint serum inneholdende vekstmedium. Epiteliale kreftceller ble beriket av voksende celler i sfære dyrkningsforhold.
A549, H23, H1299, H441, HBEC eller primær adenokarcinomceller ble infisert med lentivirus uttrykker YFP tagged egge shRNA (SCR) eller Rac1 shRNA1 eller Rac1 shRNA2 tidligere beskrevet [19]. Egge shRNA konstruere var raus gave fra Dr. Lee Grimes (Cincinnati Children Hospital Medical Center) og Rac1 shRNA konstruerer var sjenerøs gave fra Dr. Jim Mulloy (Cincinnati Children Hospital Medical Center). Etter 72 timers infeksjon ble YFP positive celler, sortert ved hjelp av FACS og anvendes for forskjellige eksperimenter.
For Rac1 mutant rednings forsøk ble fire mismatch punktmutasjoner laget i shRNA bindingsseter av Rac1 cDNA i vektoren ved hjelp av MIEG3 seterettet mutagenese kit (Stratagene, Agilent Technologies) per produsentens anvisninger. A549-celler ble infisert med Rac1 mutant som uttrykker retrovirus, og etter 72 timer ble GFP-positive celler, sortert ved hjelp av FACS. Cellene ble deretter infisert med lentivirus uttrykker SCR shRNA eller Rac1 shRNA. Etter 72 timer, GFP
+ YFP
+ celler ble anvendt for å utføre flere funksjonelle analyser.
Cell proliferasjonsanalyser
Celler ble sådd ut (2000 celler /brønn) på 96 brønn plate i tre paralleller. Antall levende celler på hver dag ble bestemt ved ikke-radioaktiv MTS proliferasjonsanalyse (Promega).
For BrdU-inkorporering assay, BrdU (10 ug /ml) ble tilsatt til cellene ved 60% konfluens i 2 timer ved 37 ° C. Celler ble oppsamlet, fiksert, farget og FACS-analyse ble utført som beskrevet tidligere [20]. For å oppdage BrdU positive celler i CD133
+ og CD133
– populasjoner ble cellene farget med CD133 /2-APC antistoff (Miltenyi Bioteknologi Inc.) etter BrdU flekker. De BrdU positive celler ble gated fra begge CD133
+ og CD133
-.-Celler
myk agar-kolonidannelsesbestemmelsen
celler ble sådd (10.000 celler /brønn) i 0,3% lavt smeltepunkt agarose tatt opp i vekstmedium inneholdende 10% føtalt bovint serum og lagvis på toppen av 0,6% agarose i vekstmedier. Antall kolonier dannet etter enten 2 uker (A549, H1299) eller 3 uker (H441, H23) ble tellet under lysmikroskop.
Sphere-analysen
Cells (10.000 celler /ml) ble sådd ut i suspensjon kulturbetingelser i serumfritt sfære medium (DMEM: F12 inneholdende 0,4% BSA, 10 ug /ml insulin, 10 ng /ml EGF, 10 ng /ml FGF) i 6-brønners plater forbelagt med 1% agarose for å hindre celle vedlegg. Media ble erstattet hver 2-3 dager og antall sfærer som dannes i 2 uker, ble tellet under lysmikroskop.
adhesjonsassayet
Plater ble belagt med 50 pg /ml fibronektin over natten ved 4 ° C og blokkert med 2% BSA i 2 timer ved 37 ° C. Etter blokkering, ble celler platet (10.000 celler /brønn) og inkubert ved 37 ° C i 60 minutter. Ikke-adherente celler ble aspirert og platene ble vasket tre ganger med PBS. Antall celler som er knyttet til brønnene etter vask ble bestemt ved hjelp av ikke-radioaktiv spredning MTS analysen.
Migrasjon og invasjon analyser
For trans-vel migrasjon analysen ble 50.000 celler lagt til øvre kammer i serum frie medier og migrasjon ved 37 ° C til 10% FBS inneholder vekstmedier ble bestemt enten etter 24 timer (A549, H1299, H23) eller 48 timer (H441). Celler som migrerte gjennom membranen ble fiksert, farget med Giemsa beis (Sigma) og tellet under lysmikroskop.
For invasjon assay, lavere kamre av Matrigel belagte invasjons plater ble belagt med 10 pg /ml fibronektin over natten ved 4 ° C og cellene invaderende gjennom matrigel ble fiksert og farget enten etter 48 timer (A549 celler) eller 72 timer (H441-celler) som ligner på migrasjon analysen.
Immuno-farging
celler ble sådd ut på fibronektin belagt lysbilder og etter 18-20 timer cellene fiksert ved hjelp av 3,7% formaldehyd. Celler ble farget for aktin cytoskjelettet (Rhodamine-Phalloidin, Invitrogen), kjerner (DAPI, Invitrogen) ved anvendelse av standard immuno-farvemetoder som er beskrevet tidligere [21]. Alternativt celler ble farget med enten fosfor-FAK (Focal Adhesjon Kinase, Millipore) eller vinculin (Sigma) eller fosfor-paxillin (Cell signale Technologies).
Side-befolkningen, CD133 cellefarging og isolasjon
Cellene trypsinisert og vasket med PBS. Cellene farges med Hoechst 33342 flekker buffer slik som beskrevet tidligere ved en sluttkonsentrasjon på 5 ug /ml Hoechst 33342 [22] for side populasjon (SP), eller med anti-CD133 antistoff for CD133-positive celler. Cellene ble analysert eller sortert for SP /CD133
+ celler ved flowcytometri.
For å få Rac1 knockdown i SP eller CD133
+ celler, celler ble infisert med lentivirus uttrykker YFP merket scr eller Rac1 shRNA og etter 72 timer ble cellene farget for side befolkningen eller CD133. YFP positiv SP eller ikke-SP celler ble sortert for enten Western analyse eller funksjonelle analyser.
Rac1-GTP pull-down analysen
For å utføre Rac1 trekke ned analyser ble cellene lysert ved å legge lyse buffer inneholdende 20 mM Tris-HCl pH 7,6, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl, 1% Triton X-100, 0,2% SDS, og protease-fosfatase-inhibitorer direkte til adherente celler. Cellelysater som inneholder like mengder protein ble inkubert med glutation perler konjugert til GST-PAK1 inneholder aktive Rac1 samspill domene og behandles videre som beskrevet tidligere [23].
Lung kolonisering analysen
Bruk av mus som xenograft verter ble godkjent av IACUC komiteen ved Cincinnati Children Hospital Medical Center (Protocol # 8D06052). Bestemt antall celler ble suspendert i PBS og injisert intravenøst i immun kompromittert NOD /SCID /γc – /- (NSG) mus ved haleveneinjeksjon. Ved slutten av studien ble lungene fiksert i Bouins løsning for å telle antall tumorer
Subkutan xenograft assay
spesifisert antall celler blir suspendert i 200 pl PBS. Matrigel blanding (1 :1 volum) og injisert subkutant i flankene av immun kompromittert NOD /SCID /γ – /- (NSG) mus. Etter 3-4 uker etter injeksjon tumorstørrelse ble målt ukentlig ved hjelp calipers og tumorvolumet ble bestemt ved hjelp av formel 0.52XLXW
2 cm3.
tumorcelle homing analysen
Celler som uttrykker YFP ble injisert intravenøst inn i NSG mus. Etter 24 timer ble lungene isolert etter perfusjon med PBS. Total lungeceller ble isolert ved Liberase fordøyelse og total celletall ble bestemt ved Hemavet celleteller. Prosentandelen av YFP positive celler ble bestemt ved flow-cytometrisk analyse av total lungeceller. Homing indeksen ble bestemt ved å beregne prosent YFP positive celler omplassert til lunge normalisert til kontrollceller.
Resultater
Rac1 målretting svekker spredning og kolonidannelse av menneskelige NSCLA celler
For å undersøke rolle Rac1 GTPase i NSCLA cellevekst, A549, H441, H1299, og H23-celler ble infisert med lentivirus koding scr eller Rac1 shRNA (shRNA1, 2). Western blot-analyse avslørte effektiv knockdown av Rac1 protein med både shRNA-konstruksjonene (henholdsvis 50% og 90% sammenlignet med SCR) på A549-celler (Fig. 1A). Rac1shRNA1 uttrykk partielt redusert spredning av lungekreftceller, mens Rac1shRNA2 mer potent hemmet cellevekst (fig. 1B) og forårsaket en signifikant reduksjon av antall kolonier dyrket i bløt agar-kolonidannelse assay (fig. 1C). Videre er cellesyklusanalyse utført av BrdU-farging og FACS-analyse avslørte en reduksjon i S-fase og en tilsvarende økning i G0 /G1-fasen av cellesyklusen ved Rac1 målretting (Fig. 1D). I H441-celler, Rac1 shRNA2 førte til ca 75% reduksjon i Rac1-proteinet (fig. S1A), og en relativ liten effekt på proliferasjonen (fig. S1B). I H1299 og H23-celler, forårsaket Rac1 knockdown en betydelig reduksjon i proliferasjon (fig. S1C, S1E) og bløt agar-kolonidannelse (Fig. S1D, S1F). For å finne ut om Rac1 knockdown effekter på spredning og myk agar vekst er spesifikke for Rac1, utførte vi shRNA-resistente Rac1 cDNA mutant redningsforsøk i knockdown cellene. Uttrykker en Rac1 shRNA resistent mutant cDNA kan stort sett redde spredning av Rac1 slått ned i A549 celler uten påvisbar effekt på scr shRNA behandlet kontrollceller (Fig. 1E). Tilsvar vi har observert en rednings av myk agar-kolonidannelse ved å uttrykke shRNA bestandig Rac1 cDNA mutant (Fig. 1F). Sammen indikerer disse resultater at Rac1 er nødvendig for den proliferative potensial på NSCLA celler.
(A) Cellelysater oppsamlet fra enten kryptert shRNA (SCR) eller Rac1 shRNA (shRNA1, shRNA2) A549 celler ble underkastet Rac1 western blot-analyse. GAPDH ble brukt som lasting kontroll. (B) Infiserte celler ble sortert og sådd ut på 96-brønners plate og proliferasjonsanalyse ble utført ved bruk av MTS-reagens. Assayet ble utført i tre paralleller, og ovenfor er en representant for tre uavhengige eksperimenter. (C) Infiserte celler ble sortert, belegg for myk agar-kolonianalyse og kolonier per felt ble tellet etter 2 uker. Assayet ble utført i tre paralleller, og ovenfor er en representant for tre uavhengige eksperimenter. (D) Infiserte celler ble sortert og inkubert med BrdU i log-fasen av cellevekst. Cellene trypisinized, farget med BrdU antistoff, ble 7AAD og cellesyklus analyse utført ved hjelp av flowcytometri. Assayet ble utført i tre paralleller, og ovenfor er en representant for fire uavhengige eksperimenter. Feilfelt representerer SD. (E) Kontroll celler eller celler som uttrykker shRNA motstandsdyktig Rac1 mutant ble infisert med SCR eller Rac1 shRNAs, sortert og belagt på 96-brønns plate. Proliferasjonsanalyse ble utført ved bruk av MTS-reagens. Assayet ble utført i tre paralleller, og ovenfor er en representant for to uavhengige eksperimenter. (F) Infiserte celler ble sortert, belegg for myk agar-kolonianalyse og kolonier ble talt etter 10 dager. Analysen ble utført i tre paralleller og over er en representant for to uavhengige eksperimenter.
Rac1 knockdown resulterer i redusert vedheft, migrasjon og invasjon av NSCLA celler
I samsvar med den kjente rollen Rac1 i cytoskjelettet regulering, Rac1 knockdown i både A549 og H441 celler resultert i endrede aktin cytoskjelettet organisasjon (data ikke vist). Undertrykkelse av Rac1 i A549-celler forårsaket redusert fokal adhesjon kompleksdannelse, med kontrollceller som utviser kraftige kontakt adhesjons komplekser visualisert ved farging for brenn adhesjonsproteiner p-FAK, vinculin, og p-paxillin mens Rac1shRNA2 infiserte celler demonstrerte redusert fokal adhesjon kompleksdannelse (fig. 2A). Vi har også observert redusert p-FAK, p-paxillin og p-MLC i Rac1 knockdown celler i forhold til å kontrollere celler ved Western blot analyse (Fig. S2A). I samsvar med redusert vedheft komplekser i Rac1shRNA infiserte celler, adhesjon til fibronektin ble redusert i disse cellene sammenlignet med (Fig. 2B) kontrollceller. I likhet med den virkning på proliferasjonen, Rac1 delvis knockdown i H441-celler resulterte i en relativt liten effekt på adhesjon til fibronektin sammenlignet med A549-celler (fig. S2B). I tillegg Rac1 knockdown i både A549 og H441 celler resulterte i redusert trans-brønn migrasjon og invasjon aktiviteter sammenlignet med kontrollceller (figur 2C, 2D, . Fig. S2C, Fig S2D.). Tilsvarende Rac1 knockdown i H1299 eller H23 celler drastisk redusert migrasjon sammenlignet med (Fig. S2E, Fig. S2F) kontrollceller. Som uttrykker en shRNA-resistent mutant Rac1 cDNA var i stand til fullstendig å redde migrering fenotypen til Rac1 knockdown i A549-celler (fig. 2E). Disse data viser viktigheten av Rac1 i NSCLA kreft celle adhesjon, migrasjon og invasjon.
(A) Infiserte A549 celler ble sortert, belagt på fibronektin belagt lysbilder og farget med enten p-FAK (top panel) eller vinculin (midtre panelet) eller p-Paxillin (nedre panel) og DAPI. Bilder ble samlet inn ved hjelp fluorescerende mikroskop på 40X forstørrelse. Bilder fra ovenfor er representative for flere bilder hentet fra to uavhengige forsøk. (B) A549 sortert celler ble sådd ut på fibronektin belagte 96-brønns plate i
in vitro
adhesjonsassayet og cellene som var festet til platen etter 1 time ble bestemt ved bruk av MTS-reagens. Adhesjon Analysen ble utført med fem replikater og dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (C) sorterte cellene ble sådd ut på trans-brønners plater migrering og migrering av celler mot 10% FBS ble målt over natten. Analysen ble utført i gjentak og over data var representative for tre uavhengige eksperimenter. (D) som er sortert A549 celler ble platet ut på Matrigel belagte invasjons plater og migrering av celler mot 10% FBS og 10 ug /ml fibronektin ble målt etter 48 timer. Assayet ble utført i tre paralleller, og de ovennevnte er en representant for tre uavhengige eksperimenter. Feilfelt representerer SD. (E) Kontroll eller celler som uttrykker Rac1shRNA resistent mutant ble infisert med Rac1 shRNA og sortert. Celler ble sådd ut på trans-brønners plater migrering og migrering av celler mot 10% FBS ble målt over natten. Analysen ble utført i tre paralleller og over data var representative for to uavhengige eksperimenter.
Rac1 knockdown forhindrer lunge kolonisering av NSCLA celler i mus
Deretter undersøkte vi effekten av Rac1 knockdown på tumorigenesis og metastatisk oppførsel av lunge adenokarcinomceller. Rac1 knockdown eller kontrollceller ble injisert intravenøst i immuno-mangel NSG mus i en lunge kolonisering modell. Både A549 (Fig. 3A) og H441 celler (fig. S3A) uttrykker Scr (500.000 celler /mus) forårsaket tumordannelse i lungene mens Rac1 knockdown celler (500.000 celler /mus) ikke klarte å danne svulster i lungene 8 uker post- injeksjon. Som forventet, Rac1shRNA1 infiserte celler som viste en delvis Rac1 protein knockdown dannet redusert antall svulster. For å bestemme om effekten på lungekolonisering er relatert til et målsøkende defekt av de Rac1 knockdown celler i lungene, testet vi muligheten av tumorcellene til hjem til lungevevet 48 timer etter haleveneinjeksjon. Flowcytometri analyse viste at YFP
+ Rac1 knockdown celler viste signifikant redusert lunge homing aktivitet sammenlignet med YFP
+ Scr celler (fig. 3B). I tillegg, subkutan xenograft av tumorcellene (500.000 celler /mus) i NSG mus etablert at Rac1 knockdown cellene hadde forsinket tumorutvikling og redusert tumorvolum sammenlignet med kontroll-celler (Fig. 3C). Interessant, sfære dannelsen av H441-celler, som korrelerer med tumor initiering potensial, ble også svekket ved Rac1 knockdown (fig. S3b) mens ingen virkning ble observert ved Rac1 knockdown på sfære dannende aktivitet av de ikke-trans HBEC kontrollceller (Fig. S3C ). Således er det sannsynlig at Rac1 knockdown effekter tumorcellelungekolonisering, vekst på grunn av en kombinert effekt på cancercellemålsøkende og proliferasjon i lungen.
(A) 5 x 10
5 A549-celler ble injisert i halevenen av NSG mus (n = 6 per tilstand) og lunger ble dissekert etter 8 uker. Lung ble farget med Bouins løsning og avfarget i 70% etanol. Kvantifisering av lunge kolonisering data ble vist i panelet til høyre. Feil stolpe representerer SE. Avbildet er en representant for to uavhengige eksperimenter. (B) Tumor-celle homing assay ble utført som beskrevet i metodene (n = 6 per tilstand i hvert forsøk). Homing indeksen ble målt som andel av YFP positive celler påvist i lunge, normalisert å kontrollere. Avbildet er et representativt for tre uavhengige eksperimenter. (C) 5 × 10
5 SCR eller Rac1 shRNA infiserte celler ble injisert subkutant i flankene av NOD /SCID mus og tumor volum ble målt ukentlig i 7 uker. Feil stolpe representerer SE.
Side befolknings celler inneholder forhøyede Rac1-GTP og økt migrasjon, invasjon, og lunge kolonisering aktiviteter
kreft stamcelle teori tilsier at en brøkdel av kreft cellepopulasjon er beriket for svulst initiere evne, og dermed krever fortrinnsrett målretting for å oppnå terapeutiske fordeler. Side populasjon er en av stamcelle markører som har blitt brukt for å isolere lungekreft stamceller [12]. Vi har isolert SP-celler ved flow cytometri fra A549-celler (fig. 4A) og bekreftet ved RT-PCR at de uttrykker økte ABCG2 transportør (fig. S4A). Interessant, SP-celler inneholdt øket Rac1 aktivitet (Fig. 4B) og vises øket migrasjon sammenlignet med ikke-SP-celler eller parentale celler (Fig. 4C). Hemming av Rac1-aktivitet ved hjelp av et lite molekyl Rac-inhibitor, NSC23766, resulterte i redusert migrering og invasjon av SP-celler (fig. S4B, S4C), noe som antyder økt Rac1-GTP i SP-celler som bidrar til disse tumorcelle atferd. Videre SP cellene viste økt lunge kolonisering evne
in vivo
sammenlignet med ikke-SP eller foreldre celler (fig. 4D). Interessant, til tross for ulike kreft initiere aktiviteter
in vivo
, SP og ikke-SP celler proliferated med en lignende hastighet som foreldrecellene
in vitro plakater (Fig. S4D). Men SP celler vises økte kolonidannelse aktivitet når det vokser i soft agar sammenlignet med ikke-SP og foreldre celler (Fig. S4E). Den gjenværende tumorigen aktivitet som oppvises av de ikke-SP-celler var ikke på grunn av urenheter av disse cellene, fordi parallelt FACS-analyse funnet i 99,9% anrikning for ikke-SP-celler fra Hoechst 33342 fargestoff sortering (data ikke vist). Derfor er det sannsynlig at en plastisitet av de ikke-SP-celler tillater dem å gi opphav til kreft initiere cellene som resulterer i den observerte rest tumorigenisitet.
(A), A549-celler ble farget med Hoechst 33342 fargestoff og analysert ved flowcytometri for side befolkningen (venstre panel). Celler ble behandlet med 10 uM Fumitremorgen for inhibitor kontroll (høyre panel). Avbildet er en representant for flere SP analyser. (B) Cellelysater innsamlet fra sorterte SP og ikke-SP-celler ble underkastet GST-PAK trekke ned analysen og behandlet for Rac1 western blot-analyse for å bestemme den Rac1 aktivitet. Total Rac1 Blottet ble anvendt som en kontroll. Avbildet er et representativt av tre uavhengige Rac1 aktivitet pull-down-analyser. (C) Ordnet A549 celler ble sådd for trans godt migrasjon analysen og celler migrert over natten mot 10% FBS var farget og telles. Ovenfor er en representant for tre uavhengige eksperimenter og feilfelt representerer SD. (D) 5 × 10
4 sortert SP og ikke-SP celler ble injisert i halevenen av NSG mus (n = 4 per tilstand). Lungene ble dissekert ut ved slutten av 12 uker. Høyre panel viser kvantifisering av lunge kolonisering data. Feil stolpe representerer SE. Ovenfor er en representant for tre uavhengige eksperimenter
SP celler ble også påvist i H441-celler med en lavere prosentandel enn A549-celler (fig s4F;. 0,5-2% vs. 4-10%).. I likhet med A549 SP-celler, viste H441 SP-celler økte lungekolonisering i svekket immunforsvar mus sammenlignet med ikke-SP-celler (fig. S4G), og det dannet flere kolonier i myk agar, sammenlignet med ikke-SP og parentale celler (Fig. S4H).
Disse resultatene lede oss til å konkludere med at SP celler fra NSCLA representerer en undergruppe i bulk kreftceller som inneholder forhøyede Rac1 aktivitet, økt migrasjon, invasjon, forankringsuavhengig vekst aktiviteter, og er beriket for celler som er i stand kolonisere lunge. De foreslår også at ikke-SP celler kunne forbli tumorigent, riktignok med redusert CSC aktivitet, for å gi opphav til svulster.
Rac1 knockdown undertrykker adhesjon, migrasjon og invasjon av både SP og ikke-SP celler
for ytterligere å undersøke effekten av Rac1 knockdown på SP-celler, ble A549 celler infisert med lentivirus enten inneholder scr eller Rac1 shRNA, og SP og ikke-SP celler ble isolert ved flowcytometri. Western blot-analyse bekreftet effektiviteten av Rac1 knockdown i både SP og ikke-SP-celler (fig. S5a). I tråd med våre tidligere data om foreldreceller, Rac1 knockdown endret cytoskeletal organisering av både SP og ikke-SP celler (Fig. S5b), og redusert fokale vedheft komplekser som visualiseres ved p-FAK farging av både SP og ikke-SP celler (fig. 5A). Konsekvent, adhesjonen aktiviteten til både SP og ikke-SP-celler til fibronektin ble også redusert (fig. 5B). Videre redusert Rac1 knockdown migrasjon og invasjon av både SP og ikke-SP celler (Fig. 5C, 5D). Dermed kan Rac1 målretting undertrykke migrasjon og invasjon av både SP og ikke-SP kreftceller.
(A) Sortert celler ble sådd ut på fibronektin belagt lysbilder, fast og utsatt for farging med p-FAK antistoff. Celle bilder ble samlet inn på 40X forstørrelse ved hjelp av fluorescerende mikroskop. Over avbildet er representative for flere bilder samles. (B, C, D) A549 celler ble sortert enten utplatet på fibronektin belagte 96-brønns plate i
in vitro
adhesjonsassayet (B), på trans-brønners plater for migrering analyse (C) eller matrigel belagt invasjon plater for invasjon assay (D). Alle analyser ble utført i tre paralleller og Feilstolpene representerer SD. Avbildet er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Rac1 målretting reduserer spredning og lunge kolonisering av både SP og ikke-SP celler
For å undersøke om den observerte hemming av spredning av den samlede kreft cellepopulasjon ved Rac1 knockdown er på grunn av en spesifikk effekt på cscs, vi neste testet vekstegenskaper av isolert SP og ikke-SP-celler før og etter transduksjon av Rac1 spesifikke shRNA. Spredning av SP og NSP celler
in vitro
dukket lignende under standard vev kultur forhold, og Rac1 knockdown blokkert
in vitro
spredning av både SP og ikke-SP celler til lignende omfang (Fig . 6A). BrdU-merking viste at både SP og ikke-SP-celler ble hemmet i S-fase overgang med en tilsvarende økning i G0 /G1 fasen av cellesyklusen etter Rac1 knockdown (fig. 6B). Mens egge RNA ikke påvirker den økte kolonidannelse aktivitet av SP-celler i et myk-agar assay sammenlignet med ikke-SP-celler i enten redusert serum eller normalt serum betingelser (Fig 6C;. Data ikke vist), Rac1 shRNA var i stand til å redusere koloni dannelsen av både SP og ikke-SP A549 celler. I tail-vene injisert NSG mus, ble lunge kolonisering av Rac1 shRNA SP celler drastisk redusert sammenlignet med SCR celler og tilsvarende ikke-SP celler viste ingen svulst kolonisering aktivitet (Fig. 6D). Disse resultatene gir sterke bevis for at Rac1 målretting er effektive i å hemme spredning og metastasering av både SP og ikke-SP celler. For å teste om de Rac1 knockdown effekter på spredning gjelder for kreft stamceller preget av CD133, ble en BrdU inkorporering analyse utført der BrdU positive celler ble inngjerdet i CD133
+ eller CD133
– befolkning på både scr og Rac1 shRNA behandlede celler. Vi observerte en nedgang i BrdU
+ celler i både CD133
+ og CD133
– subpopulasjoner ved Rac1 knockdown (Fig. 6E). Således er Rac1 kreves for spredning av CSC populasjonen.
(A) sorterte cellene ble sådd ut i 96-brønns plate og proliferasjonsanalyse ble utført ved bruk av MTS-reagens. Analysen ble utført i tre paralleller og feilfelt representerer SD. Avbildet er et representativt for tre uavhengige eksperimenter. (B) A549 sortert cellene ble inkubert med BrdU og cellesyklusanalyse ble utført ved BrdU-farging og flowcytometric analyse. Assayet ble utført i triplikater og Feilstolpene representerer SD. Ovenfor er en representant for to uavhengige eksperimenter. (C) Ordnet celle ble sådd direkte på bløt agar-kolonidannelsesbestemmelsen og antall kolonier ble dannet ble tellet etter 2-3 uker. Assayet ble utført i triplikater og Feilstolpene representerer SD.
