Abstract
Nye behandlingsformer er nødvendig for eggstokkreft, den mest dødelige gynekologisk kreft. Nyere kliniske studier har vist imponerende terapeutiske potensialet av adoptiv behandling ved hjelp av kimære antigen reseptor (CAR) -redirected T-celler til å målrette hematologiske kreftformer, og nye studier tyder på en lignende effekt kan oppnås for faste kreftformer. Vi søkte avgjøre om genetisk modifiserte T-celler rettet mot CE7-epitop av L1-CAM, en celle adhesjonsmolekyl abnormt uttrykt i flere krefttyper, har løftet som en immunterapi for eggstokkreft, først demonstrere at L1-CAM var høyt over-uttrykt på et panel av ovarian cancer cellelinjer, primære prøvene eggstokk tumorvev, og ascites-avledet primære kreftceller. Humane sentrale hukommelses avledet T-celler (T
CM) ble deretter genetisk modifisert til å uttrykke et anti-L1-CAM CAR (CE7R), som er rettet effektorfunksjon på tumor-antigen stimulering som bedømt ved
in vitro
cytokin sekresjon og cytotoksisitetsassayer. Vi fant også at CE7R
+ T-celler var i stand til å målrette primære eggstokkreft celler. Intraperitoneal (i.p.) administrering av CE7R
+ T
CM induserte en betydelig tilbakegang av i.p. etablert SK-OV-3 xenografttumorer hos mus, hemmet ascites formasjon, og overdro en betydelig overlevelse fordel sammenlignet med kontrollbehandlede dyr. Samlet utgjør disse studier indikerer at adoptiv overføring av L1-CAM-spesifikke CE7R
+ T-celler kan tilby en ny og effektiv immunterapi strategi for avansert eggstokkreft
Citation. Hong H, Brun CE, Østberg JR, Priceman SJ, Chang WC, Weng L, et al. (2016) L1 celleadhesjonsmolekyl-spesifikke kimære antigen reseptor-omdirigert humane T-celler Exhibit Spesifikk og effektiv antitumoraktivitet mot human Eggstokkreft i Mus. PLoS ONE 11 (1): e0146885. doi: 10,1371 /journal.pone.0146885
Redaktør: Nupur Gangopadhyay, University of Pittsburgh, USA
mottatt: 3. september 2015. Godkjent: 24 desember 2015; Publisert: 13 januar 2016
Copyright: © 2016 Hong et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:.. Dette arbeidet ble støttet av Hoeven Family Kidney Cancer Research Fund, og NCI Cancer Center Support Grant (P30 CA33572)
konkurrerende interesser: MCJ rapporter mottar kommersiell forskning støtte fra, har eierinteresser (herunder patenter) på, og er et konsulent /rådgivende styremedlem for Juno Therapeutics, Inc. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Alle andre forfattere har ingen interessekonflikter å avsløre.
Innledning
Eggstokkreft er den mest dødelige blant alle gynekologiske kreftformer, og er ansvarlig for de fleste av gynekologiske kreftdødsfall, med en anslått 14030 dødsfall i 2013 [1]. Til tross for forbedringer i kirurgiske tilnærminger og avgrensninger av front cytotoksiske kombinasjoner i løpet av de siste to tiårene, de fleste pasienter i avanserte stadier av sykdommen på diagnosetidspunktet til slutt gi etter for tumorresidiv [2]. Således blir nye terapeutiske tilnærminger desperat behov. Med den økende erkjennelse av at ovarietumorer er immunogen, og kan gjenkjennes og angrepet av immunsystemet, har forskjellige immunbaserte modaliteter vært aktivt utforsket å forsterke effekten av konvensjonell terapi med potensial til å hindre gjentakelse. Faktisk en rekke peptid vaksiner, dendrittiske celler vaksiner og adoptiv cellen terapi strategier har blitt undersøkt i kliniske studier (anmeldt i [3]).
Den nylige kliniske effekten av kimære antigen reseptor (CAR) -baserte adoptiv T-celle-immunterapi ved behandling av undergrupper av pasienter med akutt lymfoblastisk leukemi, og kronisk lymfatisk leukemi (oversikt i [4, 5]) har gitt viktig støtte for å utvide denne form for immunterapi for behandling et bredere omfang av maligniteter. Biler er unike i endowing T-celler med cytotoksiske effektorfunksjoner i en HLA-unrestrictive måte, og således ikke er underlagt tumor flukt som en konsekvens av HLA nedregulering (oversikt i [6]). Dette er spesielt viktig i eggstokk-kreft, hvor fremskreden sykdom er korrelert med HLA nedregulering [7]. Faktisk, arbeidet med å utforme CAR T-celler for behandling av eggstokkreft har vært fokus for flere prekliniske og kliniske studier. Preklinisk anti-tumor aktivitet mot ovarietumorer har blitt rapportert ved bruk av T-celler som uttrykker CAR spesifikk for mesothelin [8] og MUC16 [9]. Folat-reseptor-spesifikke CAR-modifisert T-celler har blitt testet i et fase I-studie for tilbakevendende kreft i eggstokkene, men mangel på T-celle-utholdenhet og lokalisering til tumoren, så vel som mangelen på tumorregresjon antyder at strategien krever ytterligere optimalisering [10 ].
vi og andre har vist at L1-celleadhesjonsmolekyl (L1-CAM) er høyt over-uttrykt i eggstokk-kreft, mens fraværende i normale eggstokker [11, 12], og at dets ekspresjon på svulster er assosiert med dårlig klinisk resultat [13-15]. Tidligere studier har også rapportert at monoklonale antistoffer rettet mot L1-CAM hemme veksten av faste tumorceller
in vitro
og veksten av SKOV3 humane ovariekarsinom-celler hos et menneske xenograft modell [16]. Disse dataene, sammen med vår tidligere erfaring med bruk av cytotoksiske T-lymfocytter uttrykker en CAR spesifikt for CE7 epitop av L1-CAM (CE7R) til å behandle barn med avansert ildfast neuroblastom [17], har resultert i vår interesse i å undersøke nytten av CE7R
+ T-celler som en potensiell Immun strategi i eggstokkreft.
Materialer og metoder
tumorcellelinjer
eggstokk~~POS=TRUNC adenokarsinom linjer CAOV-3, OVCAR-3, SK -OV-3, MADH2780, og A2780 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket under ATCC foreslått betingelser. Generering av EBV-transformerte lymfoblastoid-cellelinje som uttrykker et membran bundet OKT3 enkeltkjedet antistoff (LCL-OKT3) ble tidligere beskrevet [18]. Ildflue luciferase-positive SK-OV-3 celler (ffluc + SK-OV-3) ble samlet ved lentiviral transduksjon av SK-OV-3-celler med en EGFP-ffLuc_epHIV7 lentiviral vektor ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 5. kryopreservert banker av alle cellelinjer ble godkjent for det ønskede antigen /markør ekspresjon ved strømningscytometri, og tinte celler ble dyrket i mindre enn 6 måneder før bruk i analyser.
Fersk isolert fra ascitesvæske ovarialcancer pasienter som gjennomgikk paracentesis ble hentet fra City of Hope National Medical Center (COHNMC) kirurgisk ansatte i et sterilt vakuum beholder med godkjenning av COHNMC Institutional Review Board (IRB) og Office of Human Emner Protection. Den COHNMC IRB fravikes behovet for skriftlig informert samtykke som alle prøver ble avidentifisert og ascites var kast materiale. Ascites ble så umiddelbart plassert i kultur med et like stort volum MCDB105 (Sigma) /M199 (Gibco) medium supplementert med 10% føtalt bovint serum (HyClone), og penicillin /streptomycin (Fisher Scientific). Ovarietumorceller til slutt festet til cellekulturen plateoverflaten. Alle eksperimenter med primærceller ble utført i løpet av to kulturveier.
DNA-konstruksjoner og lentiviral vektor
CE7R28Z-T2A-CD19tDHFR
FS_epHIV7 og CE7R (EQ) 28Z-T2A-CD19t_epHIV7 lentiviral konstruksjoner brukt til å generere CE7R
+ -celler inneholdt a) det kimære antigen-reseptor (CAR) sekvens som består av V
H og V
L gensegmenter av L1-CAM-spesifikk CE7 mAb [19], et IgG4-hengsel-CH2-CH3-sekvens, enten med eller uten L235E og N297Q dobbeltmutasjon (EQ) for å hindre FcR-binding og således forbedre utholdenhet i NSG mus [20], transmembran og cytoplasmiske signal domener av kostimulerende molekyl CD28 som inneholder gg mutasjoner for å forbedre CAR ekspresjon og funksjon [21], og det cytoplasmatiske domene av den CD3ζ kjeden [22]; b) ribosomal hoppe T2A sekvens [23]; og c) den avkortede human CD19 (CD19t) transduksjon seleksjonsmarkørsekvens som mangler det cytoplasmatiske signalhale (forkortet ved aminosyre 323), i noen tilfeller direkte etterfulgt av den doble muterte humane dihydrofolat-reduktase-gen (L22F, F31S; DHFR
FS), som gir resistens mot immunosuppressive legemidler av metotreksat (MTX) [24]. GM-CSF-reseptor alfa kjeden signalsekvensen ble brukt for både a) og c) å kjøre celleoverflaten uttrykk av bilen og seleksjonsgener. (EQ) 28Z-T2A-EGFRt-T2A-DHFR
FS_epHIV7 lentiviral-konstruksjon som brukes til å generere CD19-spesifikke CAR den CD19R (CD19R +) T
CM inneholdt de samme angitte komponentene som beskrevet ovenfor for CE7R-inneholdende konstruksjoner, med unntak av CAR, som har den V
H og V
L gensegmenter av CD19-spesifikke FMC63 mAb [25], og bruken av en avkortet human EGFR (EGFRt) som transduksjon seleksjonsmarkør [ ,,,0],26]. Alle konstruere og bygging forbundet polymerase kjedereaksjon primer sekvenser er tilgjengelig på forespørsel.
Aktivering, lentiviral transduksjon, og utvidelse av T
CM
Menneskelige perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert som beskrevet [18] fra heparinisert perifert blod hentet fra friske donor leukaferese produkter eller forkaste sett som inneholder rester av blodkomponenter av friske donorer som hadde gjennomgått aferese på COHNMC med godkjenning av COHNMC IRB og Office of human Emner Protection. Blodprøver fra friske donor Leukaferese produkter ble innhentet skriftlig informert samtykke. Den COHNMC IRB fravikes behovet for skriftlig informert samtykke fra blodprøver fra friske donor leukaferese forkast kits som disse ble avidentifisert og innhentet fra kast materiale. T
CM isolasjon (ved hjelp av CD14- og CD45RA-utarming, etterfulgt av CD62L-utvalg), anti-CD3 /CD28 stimulering perle, og lentiviral-mediert transduksjon ble deretter utført som beskrevet tidligere [27] med mois som strekker seg fra 1 til 3 . De Dynabeads Humant T Ekspansjons CD3 /CD28 (Invitrogen) ble fjernet mellom dager 10 og 14, og kule-fri T-celler ble ekspandert ved en celletetthet på 0,5-1 x 10
6 celler /ml med cytokiner [27]. I noen tilfeller celler transdusert med CE7R28Z-T2A-CD19tDHFR
FS_epHIV7 gjennomgikk ytterligere utvidelse (Rapid utvidelse metoden, REM) som tidligere beskrevet [18] med eller uten DHFR
FS-mediert ved bruk av 0,1 pM metotreksat (MTX) [24].
Strømningscytometri
Cell-overflate L1-CAM ble evaluert med renset CE7 mAb [12], etterfulgt av fykoerytrin (PE) -konjugert geit-anti-mus IgG (BD Biosciences) . CAR (CE7R eller CD19R) uttrykk ble evaluert med biotinylert Donkey anti-human Fcy (Jackson Immunoresearch Laboratories) etterfulgt av PE-konjugert streptavidin (SA-PE, BD Biosciences). Alternativt ble transgene uttrykk evaluert ved å oppdage de CD19t eller EGFRt markører med enten PE-konjugert anti-CD19 (Beckman Coulter) eller biotinylert-cetuximab [26] etterfulgt av SA-PE, henholdsvis. CD4 og CD8 ekspresjon ble påvist ved anvendelse av fluorkrom-konjugert anti-CD4 og anti-CD8 (BD Biosciences). Flourochrome-konjugerte isotype-matchet mAbs fungerte som kontroller (BD Biosciences). Datainnsamlingen ble utført på en FACSCalibur (BD Biosciences) og prosenter av immunreaktive celler ble beregnet ved hjelp av FCS Express versjon 3 programvare (De Novo Software).
Immunhistokjemisk farging
Immunhistokjemisk evaluering av L1-CAM uttrykket via CE7 mAb ble utført som tidligere beskrevet [12].
Immunofluorescence konfokal mikros
Nylig oppnådde ascitesceller var direkte avsatt på objektglass ved bruk av en Shandon Cytospin 4 cytosentrifuge, fiksert i 4% paraformaldehyd permeabilisert i 0,1% Triton X-100, og lagret i PBS ved 4 ° C inntil farget over natten med enten CE7 mAb [12] eller keratin 18 mAb (Cell Signaling) ved 4 ° C, etterfulgt av Alexa Fluor 488-konjugert geit-anti -mouse IgG farging ved romtemperatur i en time. Kjerner var kontra farget med DAPI. Negative kontroller ble farget i parallell ved hjelp av bare sekundært antistoff. Celler ble undersøkt på en Zeiss oppreist LSM 510 2-foton mikroskop. Bilder ble kjøpt med en Zeiss plan-neofluar 20 /0.5air linse eller plan neofluar 40 /1.3 numerisk apertur olje nedsenking linse, og synsfelt ble deretter analysert ved hjelp av Zeiss LSM Image Browser.
Vest-analyse
Western blot-analyse for CE7R ekspresjon ble utført ved anvendelse av et anti-humant CD3ζ kjeden (den cytoplasmiske hale) -spesifikk monoklonalt antistoff 8D3 (BD Pharmingen), etterfulgt av geit-anti-mus-IgM (mu-kjede) IRDye
® 800CW konjugert sekundært antistoff (Rockland immunochemicals Inc), og bildebehandling med Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR).
cytotoksisitet og cytokin produksjon analyser
4-timers
51 Cr frigjøring og provoserende cytokin frigjørings analysene ble utført som tidligere beskrevet [12].
Xenotransplantat eggstokktumor modell og xenogen bildebehandling
Åtte uker gammelt NOD /SCID-IL2Rγnull (NSG) mus ble inokulert ip med 3×10
4 ffLuc
+ SK-OV-3 celler på dag 0. Tumor engraftment ble evaluert av Xenogen non-invasiv optisk avbildning som tidligere beskrevet [28], og mus med stadig voksende svulster ble segregert i ulike grupper å motta to ip injeksjoner av enten 5 x 10
6 CE7R
+ T
CM (14,7 x 10
6 totalt celler), 14,7 x 10
6 mock-transduced T-celler, eller PBS på dag 5 og 12. Optisk avbildning ble videreført etter at adoptiv T celleterapi for å overvåke tumorvekst. Humane endepunkter ble brukt under dyret overlevelse studien, med mus avlives av CO
2 innånding ved tegn på stress som oppblåst mage på grunn av svulst ascites dannelse, kramper, skjelvinger, anstrengt eller pustevansker, vekttap ( 20% kroppsvekt), til tegn til avmagring (dvs. fremtredende skjelettstrukturer), nedsatt førlighet, manglende evne til stå oppreist, eller bevis for å være døende. Musene ble overvåket opp til en gang om dagen som overlevelse studien utviklet seg, med ingen uventede dødsfall. Alle mus eksperimenter ble gjennomgått og godkjent av COHNMC Institute Animal Care og bruk komité.
Fluorescens in situ hybridisering (FISH)
Celler ble eksponert for 0,075 M KCl ved 37 ° C i 20 minutter fast med Carnoy er fiksativ, og falt på lysbilder. Objektglass ble deretter inkubert i 2xSSC ved 37 ° C i 30 minutter, dehydrert gjennom etanolserie, ble lufttørket og disse prober benyttet: LSID13S319 /LSI 13q34, CEP4, CEP10, og CEP 17 (Abbott Molecular), og homebrew prober for kromosom 5 og 9. BAC 53k22 (5p15) og P1-1069 (CDKN2A) ble merket i Spectrum Orange (Abbott Molecular). BAC 98O22 (5q31) og PACS 835j22 og 1132h12 (ABL) ble merket i Spectrum Grønn (Abbott Molecular). Etter hybridisering over natten ved 37 ° C, ble objektglass vasket i 0.4XSSC /0,1% Igepal ved 72 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 2xSSC /0,3% Igepal ved romtemperatur i 2 minutter, motfarget med DAPI (Vector Laboratories) og avbildes på den Bioview Duet Bilde Analyzer. Et minimum av 200 celler ble scoret per prøve.
Statistisk analyse
Uparet t-test ble brukt for å vurdere forskjeller i flux verdier via Xenogen Levende bilde (fotoner /sek). Kaplan-Meier overlevelseskurver ble sammenlignet med log-rank test. GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software) ble anvendt for disse statistiske beregninger. Verdier for P 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
L1-CAM er en klinisk relevant eggstokkreft assosiert antigen
For å ytterligere evaluere L1-CAM som et mål antigen på eggstokkreft celler, vi først screenet celleoverflate-ekspresjon av CE7 epitop av L1-CAM på fem ovarie cancer cellelinjer ved flowcytometrisk analyse. Den CE7 epitop av L1-CAM er blitt foreslått for å ha tumor-begrensede ekspresjon, slik det har blitt detektert på forskjellige tumor-vev og ondartede cellelinjer, mens mange normale vev ikke uttrykker dette antigenet, og noen ikke-maligne celler, slik som monocytter , hurtig L1-CAM, men ikke dens CE7 epitop [12]. Ut av de fem eggstokkreft linjer undersøkt her, fire av dem, OVCAR-3, SK-OV-3, MADH2744 og CAOV-3, uttrykte høye nivåer av L1-CAM /CE7 mens A2780 celler oppviste liten eller ingen L1-CAM /CE7 uttrykk (fig 1A), utvide på våre tidligere funn [12].
A, Cell-overflate uttrykk for L1-CAM i ulike eggstokkene tumorlinjer inkludert CAOV-3, OVCAR-3, SK-stekeovnen 3, MADH2744 og A2780 ble undersøkt ved flowcytometri via CE7 mAb. Mean fluorescerende intensitet (MFI) og prosenter av celler med positiv farging (%, røde histogrammer) over sekundær reagent alene (svarte histogrammer) er angitt. B, Human eggstokkreft vev microarray av primære og metastatiske svulster ble immunhistokjemisk farget med CE7 mAb. Representative bilder fra hver histologisk subtype er avbildet. Photomicrographs vises på 400x forstørrelse (okular 10x, objektiv 40x). C, Friske ascites celler avledet fra eggstokk-kreft pasienter ble immunofluorescently farget (
venstre
) ved anvendelse av anti-keratin 18 mus eller CE7 mAb etterfulgt av Alexa Fluor 488-konjugert geit-anti-mus IgG. Nuclei var teller-farget med DAPI (blå). Ascites celler ble også immunohistochemically farget (
Høyre
) med de samme primære antistoffer. I hvert tilfelle, farving med geite-anti-muse-sekundært antistoff alene (2 ° Ab) tjente som negative kontroller.
L1-CAM /CE7 ekspresjon ble deretter evaluert på forskjellige histologiske subtyper av primær pasient- avledet eggstokkene vevsprøver ved immunhistokjemisk farging av 40 tilfeller av eggstokkreft svulstvev microarray [12]. Positiv immunoreaktivitets av L1-CAM /CE7 ble påvist i 39 tilfeller [12], og spredte alle fire histologiske subtyper undersøkt inkludert serøs, klarcellet, endometrioid, og mucinous (fig 1B). Det var betydelig heterogenitet i L1-CAM /CE7 uttrykk mellom tumorprøver, inkludert andelen av tumorceller som uttrykker L1-CAM /CE7, og intensiteten av L1-CAM farging. Av notatet, ble L1-CAM /CE7 ikke oppdaget på alle prøver av normal eggstokk, men funnet på varierende grad på de fleste undergrupper av eggstokkene adenokarsinomer (fig 1b).
L1-CAM /CE7 uttrykk på fersk eggstokkreft celler direkte avledet fra ascitesvæske av pasienter som gjennomgikk terapeutisk paracentesis ble også undersøkt. For å skille fra eventuelle kontaminerende ikke-tumorceller som kan også være til stede i ascites fluid, slik som stromale fibroblaster, røde blodceller, leukocytter, etc, farging for epitel-spesifikke cytokeratin (keratin 18) ble også utført siden eggstokkreft er generelt antatt å være epithelial i naturen. Både immunofluorescent (Fig 1C Venstre) og immunhistokjemisk (fig 1C Høyre) farging vist at cellene fra ascitesvæske uttrykt keratin 18, som foreslo at de ble ekspandert kreftceller, og mange var også svært positivt for L1-CAM /CE7. Videre ble L1-CAM ekspresjon bekreftet på positive og negative celler og vev ved hjelp av spesifikk pan-L1-CAM antistoff klon UJ127.11, og ingen signifikante forskjeller i ekspresjon mellom CE7 epitop og total L1-CAM ble observert, bekrefter tilstedeværelsen av CE7 epitop for L1-CAM-uttrykk eggstokk-kreft (data ikke vist, og [12]). Samlet utgjør disse funnene sammen med andre ved hjelp av L1-CAM påvise reagenser som ikke var spesielt for CE7 epitop [29, 30], validere potensialet for L1-CAM, herunder CE7 epitop, som et immunterapeutisk mål for eggstokkreft.
CE7R
+ T
CM utstillingen
in vitro
effektor aktivitet mot L1-CAM
+ eggstokkreft cellelinjer
Ved å bygge på vår tidligere erfaring med første generasjon CE7 spesifikke CAR T-celler som spesifikt retter L1-CAM [12, 17, 19], har vi utviklet en ny generasjon CAR som inneholder tidligere rapporterte L1-CAM /CE7 bindende scFv [19] i forbindelse med en CD28 ko-stimulerende domene i serie med signaldomenet av CD3ζ for å øke styrken [22, 31, 32] (figur 2A). CAR lentiviral kassett også inkludert en T2A ribosomalt hoppe sekvens [23] etterfulgt av en avkortet CD19 utvalg /sporing markør (CD19t) for å lette identifikasjon av vellykkede CAR-uttrykke T-celler (figur 2A). I noen tilfeller, ble en mutant dihidrofolate (DHFR
FS) sekvens som inngår i forbindelse med CD19t (figur 2A) til å gi metotreksat (MTX) resistens og således gi rom for
in vitro
utvalg av transduktanter. For disse studiene, benyttet vi beriket sentrale minne T-celler (T
CM) (CD45RA-, CD62L +) [27], som vår gruppe har utviklet en klinisk produksjon plattform for dette minnet undergruppe som tidligere har vært vist seg å ha gode egenskaper for terapeutisk anvendelse, herunder langsiktig utholdenhet på adoptiv overføring
in vivo product: [18, 33, 34]. Primær human T
CM beriket fra friske givere som ble lentivirally omsatte å uttrykke L1-CAM-spesifikke CAR (CE7R) og utvidet med en syklus av REM, ble undersøkt for CAR protein uttrykk ved Western blotting (Fig 2B). Den endogene CD3ζ kjede av 16KDa ble påvist i både omsatte og mock-transduced T-celler, mens den omtrentlige 66 kDa bånd indikasjon på bilen var bare til stede i CE7R-omsatte T-celler (figur 2B). Stabil celleoverflate-ekspresjon av CE7R (som påvist ved hjelp av anti-Fc-antistoff) og CD19t immunologisk markør på transdusert T
CM-avledede celler som var blitt utvidet i nærvær av MTX ble bekreftet via flowcytometrisk analyse (figur 2C). Transduksjon og valg av CAR-uttrykke celler ikke vesentlig endre CD4 /8 forhold sammenlignet med mock-transduced kontroller (Fig 2C).
A, Skjematisk fremstilling av andre generasjon CE7 spesifikke CAR (øverst) og en representant lentiviral CE7R kassett (nederst) som inneholder sekvenser som koder en immunglobulin enkelt kjede variabel fragment (scFv) avledet fra L1-CAM-spesifikke murine CE7 monoklonalt antistoff knyttet sammen gjennom et humant immunglobulin (huγ
4 Fc) hengsel region til den humane CD28 transmembrane og cytoplasmatiske signal domener (huCD28 tm /CYT), og det humane CD3 ζcytoplasmic (huCD3ζ CYT) domene, fulgt av det ribosomale hopp T2A sekvens, og seleksjonsmarkører CD19t og dobbel mutant DHFR (DHFR
FS). Konstruer uttrykk er drevet av en EF-1α promoter. B, Western blot avslører både endogene CD3ζ (intern lasting kontroll), og de CE7R bånd detektert med anti-human CD3 ζ den cytoplasmiske hale-spesifikt antistoff. Felt 1: en kjent CAR-positive T-cellelinje (positiv kontroll), Lane2: CE7R-omformet T
CM celler, Lane3: mock-transduced T
CM celler. C, Flowcytometrisk analyse av overflaten uttrykt Fc holdig CE7R, CD19t, CD4 eller CD8 (grå histogram) sammenlignet med farging med enten isotype kontroller eller SA-PE alene (åpne histogrammer). D, Cytolytiske aktivitet CE7R
+ T
CM cellene mot de angitte eggstokkkreft cellelinje mål ble bestemt ved 4-timers
51 Cr-release assay. LCL-OKT3 ble anvendt som positiv kontroll mål. Mean% krom utgivelsen ± S.D. av tre eksemplarer brønner er avbildet. E, CE7R + T
CM celler ble ko-dyrket med de indikerte tumorlinjer ved et 10: 1 forhold i 21 timer, og supernatanter ble analysert med hensyn til IFN-γ og TNF-α nivåer ved cytometrisk kule array. Betyr + S.E.M. av tre eksemplarer brønner er avbildet.
Neste, CE7R
+ T-celler ble vurdert for deres effektorfunksjon på svulst antigen stimulering. Den CE7R
+ T celler utstilt robust re-rettet cytolytisk aktivitet mot alle testet L1-CAM
+ eggstokkreft cellelinjer (dvs. CAOV-3, OVCAR-3, SK-OV-3, og MADH2744), men ikke målrette L1-CAM negative eggstokkreft cellelinje, A2780, i standard 4-timers
51 Cr frigjøring analyser (fig 2D). Interessant, gjorde dette cytolytisk aktivitet ikke ut til å korrelere med L1-CAM /CE7 uttrykk nivå, som «lav uttrykker «MADH2784 (fig 1A) ble drept med samme effektivitet som de andre tre L1-CAM
+ eggstokkene tumorlinjer. I motsetning til dette ble mock-transduserte paren T-celler ikke lyserer en hvilken som helst av målene, bortsett fra den humane lymfoblastoid cellelinje som uttrykker membranbundet CD3-agonistisk antistoff OKT3 (LCL-OKT3), som ble anvendt som en positiv kontroll mål for å avbilde den maksimale cytolytiske potensialet av T-cellene.
In vitro
stimuleringsanalyser på lignende måte viste at den CE7R
+ T-cellene produserte signifikante mengder av pro-inflammatoriske cytokiner så som IFN-γ og TNF-α ved ko-kultur med alt L1-CAM
+ ovarial-tumorcellelinjer, men ikke ved stimulering med L1-CAM-negative A2780 celler (figur 2E). Cytokinet respons, i motsetning til de drepte analyser, viste et forhold til L1-CAM uttrykk intensitet, hvor CAOV-3-celler indusert de høyeste og SK-OV-3 og MADH2744 induserte de laveste cytokinnivåer. Sammen disse dataene viste at CE7R-uttrykke T-celler kan utløses å utøve L1-CAM-spesifikke effektor aktivitet
in vitro
mot målet eggstokkreft linjer.
adoptiv overført CE7R
+ T
CM utvise sterk
in vivo
anti-tumor aktivitet
for å undersøke anti-tumor aktivitet av CE7R-uttrykke T
CM i prekliniske musemodeller, har vi utviklet en human xenograft modell av intraperitoneal ovarial tumor ved hjelp av en SK-OV-3-cellelinjen som ble konstruert for å uttrykke ildflue luciferase (ffLuc
+ SK-OV-3) for å muliggjøre overvåking av tumorvekst i mus med bioluminescens avbildning. Gitt det faktum at selv avanserte ovarietumorer forblir stort sett innelukket i det peritoneale hulrom og sjelden spre gjennom det vaskulære system hos pasienter, valgte vi å administrere tumorceller direkte inn i bukhulen for å modellere en slik klinisk relevant intraperitoneal (i.p.) – Disseminert eggstokkreft. Inokulering av NSG mus med ffLuc
+ SK-OV-3 celler i.p. ført til utviklingen av en stor primærtumor nodule og formidling av flere mindre nodulær svulster til organer innenfor i bukhulen, omentum og mesenteriet, og /eller dyrene presenteres med oppblåst mager fylt med blodig ascites (opp til 3 ml per mus) innen 1,5 til 2 måneder. Utvikling av peritoneal karsinomatose, spredning av kreftceller i hele magen, og massiv ascites i denne xenograft modell etterligner kliniske situasjoner i eggstokkene kreftpasienter.
Primær human T
CM celler som ble perle stimulert og deretter mock-transduced eller lentivirally omformet til å uttrykke enten CE7R eller en uavhengig kontroll, CD19-spesifikke CAR (CD19R), ble preget for sin fenotype før bruk i mus (fig 3A). Av notatet, både bil sekvenser i disse studiene inneholdt L235E /N297Q dual mutasjon i sitt Fc spacer som vi har vist seg å redusere binding til løselig FcγRs og øke
in vivo
utholdenhet uten å endre evnen av bilen for å mekle target antigen-spesifikk lysis [20]. Total, mock-, CD19R-, og CE7R-omsatte T-celler var like med hensyn til sine prosenter av CD4
+ (82-87%) og CD8
+ (10-13%) populasjoner. T-celle doser gitt til mus ble så normalisert basert på CAR positivitet, slik at eventuelle tumorresponsforskjeller ikke ville bli tilskrives forskjeller i transduksjon effektivitet mellom de T-cellelinjer. Dermed etter å ha bekreftet ffLuc + SK-OV-3 svulst etablering av bioluminesens imaging, mus fikk to i.p. doser av enten 5 x 10
6 CAR
+ T-celler, mock-transduced T-celler, eller PBS, på dag 5 og dag 12 etter tumorcelle administrasjon. Kontroll mus (PBS, håne, eller CD19R behandlet) alle viste progresjon av i.p. eggstokkreft tumorvekst, ble døende og måtte avlives innen 2 måneder. I motsetning til dette, behandling med den CE7R
+ -T-celler i betydelig grad hemmet tumorvekst (figur 3B og 3C). Seks måneder etter behandling med CE7R
+ T-celler, 50% (3 av 6) mus forble i live uten tegn til stress, og bildebehandling i dag 119 etter tumorcelle injeksjon viste at to mus hadde fortsatt bare minimum svulst signal (Fig 3B).
A, flowcytometrisk analyse av mock-, CE7R- og CD19R-omformet T
CM celler før bruk
in vivo
. Prosenter av positive celler i hver kvadrant er indikert. B, NSG mus fikk i.p. injeksjon av ffLuc + SK-OV-3-tumorceller på dag 0, og ble randomisert inn i 4 grupper (n = 6 mus per gruppe) for behandling med to doser av enten PBS eller mock-, CE7R- eller CD19R-transduserte T-celler i.p. (dvs. dag 5 og 12). Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. C, Kvantitativ bioluminesens avbildning av for hver gruppe over tid. Gjennomsnitt ± S.E. av den totale fluks nivåer av luciferaseaktivitet ble målt. Stiplede linjer representerer dager etter T-celle-behandling. *, P 0,05 ved sammenligning av fluks-verdier ved de angitte tidspunkter ved hjelp av det uparede t-test. D, Strømningscytometrisk påvisning av T-celler i perifert blod 8 dager etter den andre dosen av T-celler ble administrert. Representative histogrammer og prosentandeler av human CD45
+ celler (gjennomsnitt + S.D.) er vist for hver gruppe av mus. *, P 0,003 når CE7R
+ T-celle-gruppe ble sammenlignet med enten den Mock eller CD19R
+ T-celle-behandlede grupper. E, Kaplan-Meier analyse av overlevelse for hver gruppe. * P ≤ 0,001 når CE7R
+ T-celle behandlede gruppen ble sammenlignet med en annen gruppe med Log-rang (Mantel-Cox) test.
Interessant, nivåer av humane T-celler (huCD45
+) i perifert blod 8 dager etter den siste T-celle administrasjon (dag 20 etter tumorcelle injeksjon) var lav, men konsekvent påvises i mock, CD19R
+ og CE7R
+ T celle- behandlede gruppene (figur 3D), med minst mulig huCD45
+ celler i CE7R
+ T-celle behandlede gruppen. Vi hypotese at flertallet av i.p. administrert L1-CAM-spesifikke CAR T-celler kan ha forblitt i bukhulen-som er i tråd med våre observasjoner i andre eksperimenter hvor CE7R
+ T-celler ble lettest påvises i peritoneal vasker (og ikke i perifert blod) av OVCAR-3 svulst bærende mus opptil tre uker etter ip administrasjon (S1 fig). Uavhengig av T-celle perifere persistens og /eller lokalisering, CE7R
+ T-celle-behandlede mus oppviste signifikant forbedret overlevelse (median overlevelse av 104,5 dager) sammenlignet med PBS (median overlevelse 60 dager, p = 0,0012), mock (median overlevelse på 50 dager, p = 0,001), og CD19R (median overlevelse på 56,5 dager, p = 0,0009) behandlet kontroller (fig 3E).
Rest svulster legge CE7R
+ T celleterapi
