Abstract
Bakgrunn
androgen reseptor (AR) spiller en avgjørende rolle i spredning av prostata kreft celler. Men virkningsmekanismen i spredning er fortsatt ukjent. En forståelse av mekanismen for AR handling i spredning kan føre til utvikling av effektive strategier for behandling av prostatakreft.
metodikk /hovedfunnene
I denne studien rapporterer vi at pulsen behandling av synkronisert LNCaP-celler med Casodex, en AR-antagonist i 4 timer i midten av G
1 fase var tilstrekkelig til å forhindre celler fra å komme inn i S-fasen. Etter montering av pre-replikasjonskompleks (pre-RC) i G
1 er nødvendig for progresjon av celler fra G
1 til S-fasen, er effekten av Casodex- under mid-G
1 antydet at rollen til AR i spredning kan være å regulere montering av pre-RC. For å teste denne muligheten, undersøkte vi samspillet mellom AR og Cdc6, en avgjørende del av pre-RC i LNCaP celler. AR samlokalisert og co-immunopresipitert med Cdc6, og Casodex behandling forstyrret dette samspillet. AR-immunpresipitatet (AR-IP) inneholdt også cyclin E og cyklin A, som spiller en kritisk rolle i pre-RC montering og cellesyklus inntreden i S-fasen, og DNA-polymerase-α, PCNA, og ribonukleotid-reduktase, som er avgjørende for initiering av DNA-syntese. I tillegg, i celler i S-fasen, AR ko-sedimenterte med komponentene av DNA-replikasjon maskineri av celler som kom inn i S-fasen.
Konklusjoner /Betydningen
Til sammen utgjør disse observasjonene tyder på en ny rolle av AR som en del av pre-RC å utøve kontroll over utviklingen av LNCaP celler fra G
1 til S-fasen gjennom en mekanisme som er uavhengig av sin rolle som en transkripsjonsfaktor
Citation. Murthy S, Wu M, Bai VU, Hou Z, Menon M, Barrack ER, et al. (2013) Rolle av androgen Receptor i Progresjon av LNCaP prostata kreft celler fra G
1 til S-fase. PLoS ONE 8 (2): e56692. doi: 10,1371 /journal.pone.0056692
Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia
mottatt: 16 august 2012; Godkjent: 14 januar 2013; Publisert: 20 februar 2013
Copyright: © 2013 Murthy et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd W81XWH-05-1-0071 fra det amerikanske forsvarsdepartementet for å GPR. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den hyppigste diagnosen non-hudkreft og andre ledende årsak til kreft dødsfall i amerikanske menn [1]. Androgen, ved aktivering av androgenreseptoren (AR), spiller en viktig rolle i både utvikling og progresjon av prostatacancer. Derfor androgen ablasjon ved farmakologisk eller kirurgisk kastrasjon [2] er fortsatt frontlinjen for behandling av lokalavansert eller disseminert prostatakreft. Imidlertid, selv om sykdommen i første omgang går tilbake i respons til androgen ablasjon, det etter hvert tilbakefall til å bli kastrering motstandsdyktig [3], [4]. Bemerkelsesverdig men til tross for fortsatt bruk av denne behandlingsstrategi i over 70 år, er svært lite kjent om den mekanismen som AR regulerer prostatakreft cellevekst. En forståelse av mekanismen for AR handling i proliferasjon kan føre til utvikling av mer effektive strategier for behandling av prostatacancer.
Kastrering-resistente vekst av prostatakreft er ofte forbundet med økt ekspresjon av AR [5] , [6], [7]. AR fortsatt uunnværlig for spredning av prostata kreft celler som har blitt kastrering-resistente; AR-spesifikk shRNA eller siRNA blokkerer proliferasjon av androgen-sensitive så vel som resistente kastrerings-AR-positive prostatakreftceller [8], [9], [10], [11], [12]. I tillegg er mikroinjeksjon av AR-spesifikt antistoff inn i kjernen eller behandling av celler med AR mRNA hammer ribozym inhiberer proliferasjonen av AR-positiv, men ikke AR-negative, prostatakreftceller [13], som indikerer en kritisk rolle av AR i proliferasjon av AR-uttrykke prostata kreft celler. Interessant, synes rolle AR i proliferasjon av prostata kreftceller til å være uavhengig av dens funksjon som en transkripsjonsfaktor, i det minste i kastrering resistente CWR22R3 humane prostatakreftceller (som stammer fra CWR22 xenotransplantater), hvori AR-avhengig proliferasjon er ligand uavhengig men AR transkripsjonen aktivitet forblir ligand-avhengig [11]. Sammen er disse observasjonene påberope muligheten for at, i tillegg til sin rolle som en transkripsjonsfaktor, kan AR spille en direkte rolle i cellesyklusregulerende arrangementer som kreves for spredning av prostata kreft celler. En direkte rolle AR i å regulere spredning i kontrast til forestillingen om en indirekte rolle hvor AR transkripsjonen aktivitet regulerer uttrykket av faktorer som kreves for cellesyklusprogresjon.
cellecyklusprogresjonen fra G
1 til S-fasen er grunnleggende for proliferasjon. Vi rapporterte tidligere at Casodex (bikalutamid), en spesifikk hemmer av AR, blokkerer muligheten for G
1 fase AR-positive LNCaP prostata kreft celler til å gå inn i S-fasen [14], [15], noe som indikerer en rolle AR i cellesyklusprogresjon fra G
1 til S-fasen. Progresjon av celler fra G
1 til S-fasen krever en kaskade av hendelser i sekvensielle G
en fase som bidrar til sammenstillingen av DNA-replikasjon i celler maskineri som går inn i S-fasen. Disse hendelsene inkluderer) lasting av Cdc6, replikering lisensiering faktor RLF-B /Cdt1, og mini-kromosom vedlikehold (Mcm) proteiner bort på opprinnelsen anerkjennelse kompleks (ORC) for å danne pre-replikering kompleks (pre-RC), og b) avvikling av DNA ved helicase (Cdc45) assosiert med pre-RC, og montering av enzymer av DNA-syntese for å danne mega-komplekser som kreves for initiering av DNA-syntese på opprinnelsen til DNA replikasjon (se Reddy et al [16] for en gjennomgang ).
I denne studien undersøkte vi om AR samhandler med komponentene i pre-RC og DNA replikasjon maskiner. Våre studier viser for første gang at AR er nødvendig i midten av G
en fase, på det tidspunkt da pre-RC sammenstillingen er kjent for å starte, for LNCaP-celler å gå inn i S-fasen, og at AR er forbundet med cellesyklusregulerende proteiner og enzymer i DNA-syntese i en multienzymkompleks isolert fra S-faseceller. Disse observasjonene tyder AR engasjement i spredning gjennom sitt samspill med cellesyklusregulerende proteiner og enzymer av DNA-syntese som kreves for utbruddet av DNA-syntese og progresjon av LNCaP celler fra G
1 til S-fasen.
Materialer og Methods
Cell Culture
LNCaP-celler ble holdt i RPMI-medium (Gibco BRL, Rockville, MD) inneholdende 10% føtalt kalveserum (FCS), 2,5 mM glutamin, 100 ug /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin (komplett medium) i en fuktet inkubator med 5% CO
2 og 95% luft ved 37 ° C.
RNA Isolation, RT-PCR, og real-time RT -PCR (QRT-PCR)
RNA ble isolert fra kontroll og Casodex behandlede celler og utsatt for RT-PCR for å bestemme PSA og GAPDH uttrykk som tidligere beskrevet [14]. Primersekvensene brukes til PSA er: 5′-gcacccggagagctgtgt (fremover) og 5-gatcacgcttttgttcctgat (revers) primere, og for GAPDH er 5′-gagatccctccaaaatcaagtg (fremover) og 5′-ccttccacgataccaaagttgt (bakover). GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. Den densitometri av RT-PCR-bånd ble utført som beskrevet tidligere [14]. QRT-PCR ble utført på en Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) ved å bruke TaqMan genuttrykk analyser for PSA (analyse Id: Hs02576345_m1) og 18S RNA (analysen Id: Hs03928985_g1) som beskrevet tidligere [17]. Den relative nivået av PSA uttrykk ble kvantifisert ved hjelp av sammenlignende ΔΔC
t med 18S RNA som intern kontroll.
Synkronisering av LNCaP celler ved Isoleucin deprivation
Isoleucin mangel ble utført av vår tidligere publisert metode [15]. Celler ble dyrket til 60% til 70% konfluens, og deretter ble mediet erstattet med isoleucin-fri RPMI 1640 (Life Technologies, Carlsbad, CA), supplert med 6% dialysert FCS (Life Technologies, Carlsbad, CA), 2,5 mM glutamin, 100 ug /ml streptomycin, og 100 enheter /ml penicillin. Celler ble opprettholdt i isoleucin-fritt medium i 36 timer i en inkubator som ovenfor. Celler ble løslatt fra isoleucin-blokken ved å erstatte mediet med komplett medium inneholdende 10% FCS og behandles med Casodex (bikalutamid, gave fra Astra Zeneca, England, UK) som angitt.
Siden oppføring av celler i S fase er preget av utbruddet av DNA-syntese, progresjon av synkroniserte celler fra G
1 til S-fasen ble overvåket ved å bestemme evnen til cellene for å innlemme
3H-tymidin i DNA, som beskrevet tidligere [14], [ ,,,0],15]. Med regelmessige intervaller etter frigjøring fra isoleucin-blokk ble cellene puls-merket med 2 uCi /ml
3H-thymidin (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA) i 30 minutter ved 37 ° C i en fuktet inkubator. Radioaktiviteten inkorporert i syre-utfellbart materiale ble deretter bestemt som beskrevet [15].
Fremstilling av celle-ekstrakter og Immunoutfelling
Eksponensielt voksende LNCaP-celler høstet ved skraping i fosfat-bufret saltvann (PBS) ble pelletert ved sentrifugering i 10 minutter ved 4 ° C ved 2000 rpm i en Sorvall RT7 sentrifuge og resuspendert i immunutfelling (IP) buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,1% Triton X-100, 5 mM EDTA, 250 mM NaCl, 2 mM CaCl
2, 50 mM NaF, og 0,1 mM Na
3VO
4) supplert med protease inhibitor cocktail (P-8340, Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) ved en tetthet på omtrent 1 x 10
7 celler /ml. Cellesuspensjonen ble deretter underkastet to ganger til 30 pulser av ultralydbehandling ved bruk av en Branson Sonifier 250 (Branson Sonic Power Co, Danbury, CT), satt til en utgangsstyre av to og en driftssyklus på 20, med periodisk avkjøling på is. Den ultralydbehandlet celleekstrakt ble fjernet ved sentrifugering i en Eppendorf-sentrifuge 5415R ved 6000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C. Proteinkonsentrasjonen i klarerte ekstraktene ble bestemt ved bruk av Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
For immunopresipitering, ble celle-ekstraktene ble fortynnet 5 ganger i IP-buffer supplert med protease inhibitor cocktail og inkubert ved 4 ° C over natten med 4 mikrogram /ml anti-AR antistoffer (AR-N20 eller AR-441) eller anti-Cdc6 antistoffer (H-304) (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, California). Immunkompleksene ble deretter adsorbert til Pierce Protein A /G-agarosekuler (Thermo Scientific, Philadelphia, PA) i 2 timer ved 4 ° C med forsiktig omrøring. De adsorberte komplekser ble vasket tre ganger med IP-buffer ved sentrifugering i en Eppendorf-sentrifuge 5415R ved 6000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C, og deretter eluert med PAGE ladningsbuffer (Bio-Rad, Richmond, CA). Kontroll immunopresipitater ble fremstilt ved anvendelse av 4 ug /ml renset mus eller kanin IgG (Antibodies Incorporated, Davis, CA) i stedet for anti-AR eller anti-Cdc6 antistoffer.
Isolering av DNA Replication Complex fraksjon fra Nuclear Lysate
Synkroniserte LNCaP-celler i G
en fase (en time etter frigjøring fra isoleucin-blokk) eller i S-fase (24 timer etter frigjøring fra isoleucin-blokk) ble høstet og den nukleære lysatet ble fremstilt ved en liten modifikasjon av fremgangsmåten til Subramanyam et al [18]. Høstede celler ble pelletert ved sentrifugering i 10 minutter ved 4 ° C ved 2000 rpm i en Sorvall RT7 sentrifuge og suspendert på nytt i buffer A [0,16 M sukrose, 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM KCl, 10 mM MgCl
2, 70 mM HEPES (pH 7,6), 0,025 mM CaCl
2, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 2 mM DTT, 1 mM EDTA] ved en tetthet på 2 x 10
7 celler /ml. Cellesuspensjonen ble så homogenisert i en motordrevet homogenisator Wheaton (Wheaton Co., Wheaton, IL) inntil ~90% av cellene ble merket med trypanblått fargestoff (vanligvis tre slag på en rotasjonsinnstilling av 3). Cytosoliske Supernatanten ble deretter separert fra den nukleære pelleten etter sentrifugering i en Eppendorf-sentrifuge 5415R ved 6000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C. Den nukleære pellet ble suspendert i et volum av buffer A tilsvarende til den som anvendes for homogenisering og underkastet to ganger til 30 pulser av sonikering med en Branson Sonifier 250 (Branson Co., Danbury, CT) innstilt på et utgangsstyre av to og en driftssyklus 20, med periodisk avkjøling på is. Den ultralydbehandlet atom Ekstraktet ble fjernet ved sentrifugering i en Eppendorf-sentrifuge 5415R ved 6000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C. DNA-replikasjon komplekset fraksjon ble deretter isolert ved å underkaste den nukleære lysatet til sukrose-tetthetsgradient-sentrifugering i det vesentlige som beskrevet av Reddy og Pardee [19]. Nuclear lysat (0,5 ml) ble lagt over en 4,8 ml lineær gradient av 20-40% (vekt /volum) sukrose i buffer A, som i sin tur er lagt over en 66% sukrose pute (0,5 ml) og sentrifugert i en Beckman SW 50,1 rotor ved 4 ° C i 16 timer ved 35 000 rpm. Gradienten ble deretter oppløst i 0,5 ml fraksjoner og hurtig sedimenterende fraksjonen som inneholdt DNA-polymerase-aktivitet blir referert til som den replitase komplekset fraksjonen som beskrevet av Murthy og Reddy [20]. Komplekset fraksjon fra G
1 eller S-faseceller ble deretter utsatt for Western blot-analyse for å vurdere tilstedeværelse av enzymer i DNA-syntese og celle-syklusregulerende proteiner.
Western Blot analyse
prøvene ble oppløst i PAGE lasting buffer (Bio-Rad, Richmond, CA) og utsatt for denaturering 10% polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og deretter overført til nitrocellulosemembraner. Individuelle membraner ble undersøkt med antistoffer mot AR (AR-N20 eller AR-441), Cdc6 (H-304), prostataspesifikt antigen (PSA, C-19), Lamin B, DNA polymerase-α (STK1), PCNA (PC10 ), ribonukleotidreduktase (R2, E-16), cyclin A (H-432), cyclin E (C-19) (alle fra Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), p27
Kip-en, cyclin B (BD Transduksjon Lab, San Jose, CA), caspase 3 (Cell Signal, Danvers, MA), eller GAPDH (Chemicon, Temecula, CA). Immunreaktive bånd ble utviklet ved hjelp av pepperrotperoksidase-konjugert sekundære antistoffer og SuperSignal WestPico kjemiluminescenssubstrat (Pierce, Rockfold, IL) og visualisert ved hjelp av X-ray film.
Immunofluorescent Farging og Konfokalmikroskopi
LNCaP celler dyrket på objektglass ble vasket en gang med PBS, fulgt av fiksering i 3,7% (volum /volum) formaldehyd i 20 minutter ved 22 ° C. Celler ble permeabilisert i 0,5% (vol /vol) Triton X-100 i 15 minutter og blokkert i en time i 2% (vekt /volum) BSA ved 22 ° C. Platene ble deretter inkubert i en time ved 22 ° C med antistoffer mot AR (AR-N20 eller AR-441) og Cdc6 eller DNA-polymerase-α etterfulgt av både geit-anti-mus-fluorescein-isotiocyanat (FITC) – og geit-anti -kanin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) -merket sekundære antistoffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Etter fire vasker med PBS, ble lysbilder montert med Aqua-Poly /Mount (Polysciences Inc., Warrington, PA). Konfokal laser scanning mikroskopi ble utført med en Zeiss LSM 410 oppreist konfokalmikroskop. Bilder ble behandlet, og colocalization analyse (som er farget gul) ble utført med et Zeiss LSM 410 Meta magnetisering system med samling ved 488 og 543 nm. Intensitet korrelasjon Quotient (ICQ) analyse for å kvantifisere AR colocalization med Cdc6 eller DNA polymerase-α ble utført ved hjelp av ImageJ programvare (NIH, Bethesda, MD).
Immunofluorescent Påvisning av bromdeoksyuridin (BrdU) Innlemmet i DNA
LNCaP-celler dyrket på objektglass ble merket med 10 mM BrdU (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 30 minutter, vasket en gang med PBS og fiksert i 3,7% formaldehyd i 20 minutter ved 22 ° C. Celler ble permeabilisert i 0,5% (v /v) Triton X-100 i 15 minutter og blokkert i en time i 2% (vekt /volum) bovint serumalbumin ved 22 ° C. Cellene ble deretter farget med muse-monoklonale antistoffer mot BrdU (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), etterfulgt av geit-anti-mus-FITC-merket sekundært antistoff. Lysbilder ble montert med Vectashield Mounting Medium inneholder DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og fotomikrografi ble utført med en Zeiss Axiofot mikroskop utstyrt for epifluorescence.
Resultater
Bruk av Casodex å finne ut hvilken rolle av AR i Cell Cycle of Synkroniserte LNCaP celler
AR knockdown strategier har blitt brukt til å vise at AR er nødvendig for spredning av prostata kreft celler [8], [9], [10], [11], [12]. Men AR knockdown av siRNA eller shRNA krever behandling av prostata kreft celler over en periode på flere dager. Således kan denne metode ikke brukes til å identifisere når i cellesyklus (dvs. G
1, S eller G
2 /M faser) AR er nødvendig for spredning av LNCaP-celler, som hver fase av cellesyklus varer ikke mer enn noen få timer. Derfor brukte vi det ikke-steroide anti-androgen Casodex (bicalutamid) og for selektivt å hemme akutt AR for å bestemme hvilken rolle AR i progresjonen av synkroniserte LNCaP-celler gjennom G
1 og S-faser.
Casodex brukes vanligvis ved 10 til 20 pm for å inhibere androgen-indusert AR transkripsjonen aktivitet; men i disse eksperimenter, er cellene i trekull-strippet serum (CSS) -inneholdende medium [21], [22]. Imidlertid vil synkroniserte celler slippes ut CSS-holdig medium ikke komme seg gjennom cellesyklusen. Vi sammenlignet effektiviteten av Casodex- på ekspresjonen av prostata spesifikt antigen (PSA), en spesifikk AR-target-genet [23], i LNCaP-celler i FCS- vs. CSS- medium. Androgen-berøvelse av celler i CSS-medium ble redusert PSA uttrykk til ~ 50% av det som i kontrollceller i FCS-medium og Casodex forårsaket en ytterligere reduksjon (fig. 1A og 1B). Casodex på 75-100 mikrometer i FCS-medium hadde samme effekt på PSA uttrykk som 25-50 mikrometer Casodex i CSS-medium (fig. 1A og 1B). Spesielt, når den doseavhengige respons på Casodex er plottet i forhold til sin egen kontroll (i FCS vs. CSS), kurvene overlapper hverandre, noe som indikerer at IC
50 for å inhibere AR-aktivitet er ≈50 uM Casodex i enten FCS eller CSS (fig. 1C). Cellene ble behandlet med 100 uM Casodex i FCS-medium var morfologisk lik de som ble behandlet med 20 uM Casodex i CSS-medium, og 100 uM Casodex i FCS-medium ikke forårsaket noen merkbar celledød, bestemt ved trypanblått eksklusjon fremgangsmåte (data ikke vist). Derfor brukte vi 100 uM Casodex, en maksimalt effektiv konsentrasjon for å inhibere AR-aktivitet, for å bestemme hvilken rolle AR i proliferasjon av LNCaP-celler i FCS-medium. Denne konsentrasjonen er lik den som brukes for å inhibere ekspresjon eller PSA veksten av LNCaP-celler i nærvær av FCS [24], [25], [26].
Eksponensielt voksende LNCaP-celler ble vasket to ganger med serum-og hormon-fritt medium og overført til RPMI medium inneholdende 10% føtalt kalveserum (FCS) eller 6% trekull-strippet serum (CSS). Etter 24 timer ble Casodex tilsatt og cellene ble inkubert i ytterligere 24 timer. RNA isolert fra kontroll og Casodex behandlede celler ble underkastet RT-PCR og QRT-PCR-analyse av PSA som beskrevet i Materialer og Metoder. (A) RT-PCR-produkter av PSA og GAPDH separert på 1% agarosegel. Forholdet mellom båndet tetthet PSA /GAPDH (P /G-forhold) av celler i FCS uten Casodex ble innstilt på 1,0 og P /G-forhold på andre behandlingsforhold er uttrykt i forhold til kontrollen. (B) Relative PSA-nivåer, som bestemt ved QRT-PCR, er plottet som en funksjon av Casodex- konsentrasjon. Og (C) i forhold PSA-nivåer i fig. 1B er plottet som en prosentandel av kontroll uten Casodex- beregnes separat for FCS- og CSS- medium. Lukket sirkel, FCS-medium; og åpne sirkler, CSS-medium. Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter.
LNCaP Cell Inngåelse S Fase Krever Funksjonell AR under Mid-G
1 Fase
Vi har vist tidligere at isoleucin deprivasjon årsaker LNCaP celler til å arrestere i G
0 /G
en fase [15], [27]. Ved løslatelse fra isoleucin-blokk, dvs. overføre til komplett medium som inneholder FCS (FCS-medium), disse cellene fremgang gjennom G
1 og skriv S-fasen 12 timer etter utgivelsen, og nå en topp på S-fasen 10-12 timer deretter [15]. Vi har også vist at Casodex behandling i 24 timer med start fra tidspunktet for frigjøring fra isoleucin-blokk opphever evnen til cellene til å gå inn i S-fasen [14], [15]. Selv om dette foreslått en rolle av AR i cellesyklusen, kan det eksperimentell design ikke skille mellom en rolle av AR i G
1 vs S-fasen. Derfor, for å skille mellom en inhiberende effekt av Casodex- i G
1 vs i S-fasen, vi behandlet synkronisert LNCaP-celler med Casodex starter på 0, 4, 8, 12 eller 16 timer etter frigjøring fra isoleucin-blokk , og bestemmes evnen av celler til å innlemme
3H-tymidin (
3H-TdR) 20 timer etter frigivelse, en tid da kontrollcellene er i S-fasen (se skjematisk i fig. 2A). Som vist på fig. 2A, Casodex maksimalt inhibert
3H-TdR innlemmelse hvis tilsettes når som helst i løpet av G
en fase (dvs., 0, 4 eller 8 timer etter frigivelse), noe som indikerer en rolle av AR i G
1. Derimot ble Casodex effekt avstumpet hvis behandlingen ble utsatt til 12-16 timer etter løslatelsen fra isoleucin-blokk, en gang når cellene har allerede forpliktet seg til å gå inn i S-fasen. Casodex behandling av celler som allerede hadde skrevet inn i S-fasen (16 timer etter løslatelse fra isoleucin-blokk) hadde svært liten effekt på
3H-TdR inkorporering (fig. 2A). Således, den hemmende effekten av Casodex- oppstår i G
en fase, når cellene er klar til å gå inn i S-fasen, og ikke i S-fasen. Derfor er AR nødvendig i G
1 for celler til å gå inn i S-fasen.
LNCaP celler ble synkronisert med isoleucin-deprivasjon og sluppet inn komplett medium. A) Casodex tilsatt ved den angitte tiden etter løslatelse fra isoleucin-blokk og vedlikeholdt på mellomlang til
3H-TdR inkorporering ble bestemt 20 timer etter løslatelsen fra isoleucin-blokken. Resultatene er uttrykt som prosent av
3H-TdR inkorporering i kontrollceller som ble sluppet ut i komplett medium i fravær av Casodex-. A) Casodex ble tilsatt til en 4-timers periode, som vist i toppanelet, og
3H-tymidin (
3H-TdR) inkorporering i DNA ble bestemt etter 4 timer etter frigjøring fra isoleucin-blokk og etter fjerning av Casodex. Hvert datapunkt er gjennomsnittet av triplikate prøver med 10% variasjon; Dataene som vises er representative for to uavhengige eksperimenter.
Vi deretter bestemmes når i G
1 fase Casodex er mest effektive i å undertrykke celle inntreden i S-fasen. Vi puls behandlet synkroniserte LNCaP celler med Casodex i løpet av første, andre eller tredje 4-timers intervall etter utslipp fra isoleucin-blokken, tilsvarende tidlig-G
1, mid-G
1, eller sen-G
1, henholdsvis, og bestemmes frekvensen av
3H-TdR-inkorporering i DNA ved 4-timers intervaller i 24 timer (se skjematisk i fig. 2B). Vi har tidligere vist at
3H-TdR innlemmelse gir en pålitelig og reproduserbar metode for å overvåke progresjonen av synkroniserte celler fra G
1 til S-fasen og bekreftes ved strømningscytometri-analyse, så vel som ekspresjon av S-fase- spesifikke cykliner og aktivering av cyklin-avhengige kinaser [14], [15]. Som vist på fig. 2B, behandling med Casodex under mid-G
1 (4-8 timer etter løslatelsen fra isoleucin-blokk) var mer effektiv til å blokkere inntreden i S-fasen enn var behandling i tidlig-G
1 (0-4 timer etter løslatelse fra isoleucin-blokk) eller sen-G
1 fase (8-12 timer etter løslatelsen fra isoleucin-blokk). Dette tyder AR engasjement i cellesyklusregulerende hendelser i Midt-G
en fase som er kritiske for LNCaP celler for å gå videre fra G
1 til S.
AR samhandler med Cdc6, en kritisk komponent i pre-RC Nødvendig for montering av Replication Machinery i S-fasen LNCaP celler
Siden Casodex behandling i midten av G
1 blokkert muligheten for synkroniserte LNCaP celler til å gå inn i S-fasen (fig. 2), vi testet om AR samhandler med cellesyklusregulerende proteiner involvert i montering av pre-RC, som montering av pre-RC i midten til slutten av G1 er nødvendig for celler til å gå inn i S-fasen og initiere DNA-syntese. Cdc6 binding til opprinnelsen anerkjennelse kompleks (ORC) er det første trinnet i prosessen med pre-RC forsamlingen [16]. Vi observerte at en immunpresipitatet utarbeidet etter Cdc6-spesifikke antistoffer (Cdc6-IP) inneholdt AR, tyder AR interaksjon med Cdc6 (Fig. 3A). Denne interaksjonen er spesifikk, siden en av de mest rikelig uttrykte proteiner, prostataspesifikt antigen (PSA), i LNCaP-celler ble ikke forbundet med Cdc6-IP (fig. 3A). Vi har tidligere vist at interaksjonen mellom cellesyklusregulerende proteiner og enzymer i DNA-syntese i en rekke celler fører til montering av en multienzymkompleks som kalles replitase eller DNA-replikasjon maskiner [28], [29], [30]. Disse kompleksene er lett påvisbar i celler som er i S-fasen, men ikke noe tidspunkt i løpet G1 fase [29], [30]. Derfor testet vi om AR-Cdc6 samhandling er en cellesyklusavhengig fenomen. Som vist på fig. 3B, selv om Cdc6 var til stede på et lavt nivå i G
en faseceller, dens assosiasjon med AR-IP ble sett i synkroniserte LNCaP-celler som var i S-fasen, men ikke i de som var i G
1 fase. Til sammenligning Lamin B, en kjernefysisk protein, viste svært liten forskjell i sin tilknytning til AR-IP fra G
1 vs S-fase celler (fig. 3B). Således oppviser AR et cellesyklusavhengig vekselvirkning med Cdc6.
A) Cdc6-IP ble fremstilt fra eksponentielt voksende LNCaP-celler og ble utsatt for Western blot-analyse. B) AR-IP-er ble fremstilt fra synkronisert G
en fase (en time etter frigjøring fra isoleucin-blokk) eller S-fase (20 timer etter frigjøring fra isoleucin-blokk) LNCaP-celler, og underkastet Western blot-analyse. IgG tung kjede i AR-IP og IgG-IP er angitt med pil.
Casodex forstyrrer AR-Cdc6 Interaksjon
Siden AR er innblandet å spille en rolle i regulering av Cdc6 uttrykk [14], [31], testet vi om Casodex-induserte blokade av oppføring av LNCaP-celler i S-fasen er på grunn av en reduksjon i Cdc6 proteinnivåer. Faktisk, under de eksperimentelle betingelser som anvendes i den foreliggende undersøkelse, Casodex ikke hadde noen merkbar effekt på enten Cdc6 eller AR proteinnivåene i eksponentielt voksende LNCaP-celler (Fig. 4A, Input). Ikke desto mindre, Casodex avbrutt AR interaksjon med Cdc6 som indikert ved nærvær av Cdc6 i AR-IP fra kontrollceller, men ikke i den av Casodex- behandlede celler (fig. 4A, AR-IP). Dette Casodex-indusert forstyrrelse av AR tilknytning Cdc6 ble videre støttet av konfokalmikroskopi (fig 4B.); Vi observerte en merkbar nedgang i colocalization av AR med Cdc6 i kjernen av Casodex behandlede celler (ICQ = 0,059 ± 0,022 SD) sammenlignet med kontrollceller (ICQ = 0,152 ± 0,047 SD). Således Casodex-indusert undertrykkelse av oppføring av LNCaP-celler i S-fasen er forbundet med avbrudd av AR-Cdc6 interaksjon.
A) Eksponensielt voksende LNCaP-celler ble behandlet med Casodex eller bærer (kontroll) i 24 timer og AR-IP forberedt fra behandlede og kontrollceller ble underkastet Western blot-analyse for å detektere AR og Cdc6. B) LNCaP-celler dyrket på objektglass ble synkronisert med isoleucin-deprivasjon og frigjøres i fullstendig medium i nærvær av bærer (kontroll) eller Casodex. Ved 24 timer etter frigjøring fra isoleucin-blokken (når kontrollceller forventes å gå inn i S-fasen), ble cellene fiksert og prosessert for immunoflourescent farging ved anvendelse av anti-AR (AR-441) mus monoklonalt og anti-Cdc6 (H-304) kanin polyklonale antistoffer.
AR samhandler med S Phase cykliner
i tillegg Cdc6, noen av cellesyklusregulerende proteiner, slik som cykliner E og A, også spiller en viktig rolle i forsamlingen av pre-RC i G
1 [16]. Derfor har vi testet om AR virker sammen med hvilken som helst av cykliner som er kjent for å være involvert i utviklingen av celler fra G
1 til S-fasen (viz., Cykliner E og A) og G
2 /M ( nemlig., cyclin B) faser i LNCaP celler. Vi observerte at cyclin E og cyklin A, men ikke en mitotisk cyclin, cyclin B, var forbundet med AR-IP forberedt fra eksponentielt voksende LNCaP-celler (Fig. 5). Til sammenligning GAPDH, en cytosolic markør, ikke var assosiert med AR-IP. Således oppviser AR en spesifikk interaksjon med cellesyklusregulerende proteiner som er involvert i regulering av celle inntreden i S-fasen.
AR-IP forberedt fra eksponentielt voksende LNCaP-celler ble underkastet Western blot-analyse.
AR samhandler med enzymer av DNA Synthesis
siden CDC-6-avhengig montering av pre-RC fører til rekruttering av enzymer av DNA-syntese til nettstedene til DNA replikasjon [16], og siden AR samvirker med Cdc6 (fig. 3), har vi undersøkt hvorvidt AR-IP inneholder også enzymer i DNA-syntese. Som vist på fig. 6, observerte vi at AR-IP fremstilt ved anvendelse av to forskjellige antistoffer AR (AR-N20 og AR-441) inneholdt DNA-polymerase-α, et viktig enzym som er involvert i initiering av DNA-syntese (Fig. 6A). AR interaksjon med DNA polymerase-α ble ytterligere bekreftet av immunoflourescent konfokalmikroskopi (fig 6B.); observerte vi en sterk colocalization av AR med DNA polymerase-α (ICQ = 0,45 ± 0,016 SD) i kjernen av LNCaP celler. I tillegg til DNA-polymerase-α, AR-IP fremstilt ved anvendelse av AR-441 og AR-N20-antistoffer inneholdt prolifererende cell nuclear antigen (PCNA), en hjelpeprotein av DNA-polymerase, og den katalytiske subenhet av ribonukleotid-reduktase (RNR2), som konverterer ribonukleotider til deoksyribonukleotider som er nødvendige for DNA-syntese (fig. 6C). I tillegg til sin rolle i spredning [8], [9], [10], [11], [12], AR er også rapportert å spille en avgjørende rolle i overlevelse av LNCaP-celler, som AR knockdown fører til celledød ved apoptose [32]. Derfor testet vi om rollen til AR i reguleringen av apoptose innebærer også sin interaksjon med apoptotiske proteiner. Som vist på fig. 6A, caspase-3, en apoptotisk enzym, ble ikke påvist i AR-IP-er. Således AR utviser en selektiv interaksjon med enzymene av DNA-syntese som er nødvendig for spredning av LNCaP-celler.
AR-IP inneholder DNA-polymerase-α. AR-IP forberedt fra eksponentielt voksende LNCaP-celler ved hjelp av anti-mus-monoklonalt AR (441) eller kanin polyklonalt (N-20) antistoffer ble underkastet Western blot-analyse. B) AR er colocalized med DNA polymerase-α i LNCaP celler. Eksponensielt voksende LNCaP-celler på objektglass ble fiksert og farget med anti-AR (N-20) kanin polyklonale og anti-DNA-polymerase-α (STK1) monoklonale antistoffer fra mus og konfokal mikroskopi ble utført. C) AR-IP inneholder PCNA og ribonukleotidreduktase.
