Abstract
Bakgrunn Mål
Selv om hepatocellulær kreft (HCC) ofte oppstår i innstillingen av fibrose og en lever regenerativ respons krever ny cellevekst, har terapeutiske strategier for disse kreftformene ikke målrettet proteinsyntesen. Silvestrol, en rocaglate isolert fra
Aglaia
foveolata
, kan hemme proteinsyntesen ved å modulere initiering av oversettelses gjennom eukaryote initiering faktor 4A. I denne studien, vurderte vi den terapeutiske effekten av silvestrol for HCC.
Metoder
Effekten av silvestrol ble undersøkt ved hjelp av humane HCC celler
i
vitro
ved hjelp av en orthotopic tumorcelle xenograft modell i en fibrotisk leveren. Virkningen av silvestrol på leveren ble vurdert
i
vivo
i villtype mus.
Resultater
Silvestrol hemmet cellevekst med en IC50 på 12,5 til 86 nM i fire forskjellige HCC cellelinjer.
I
vitro
, økt silvestrol apoptose og caspase 3/7 aktivitet ledsaget av tap av mitokondriemembranen potensial og redusert uttrykk av Mcl-en og BCL-XL. En synergistisk effekt ble observert når silvestrol ble kombinert med andre terapeutiske midler, med en dosereduksjon indeks på 3,42 ganger med sorafenib og 1.75 ganger med rapamycin ved en fraksjonert effekt på 0,5.
I
vivo
, ble en antitumoreffekt ble observert med 0,4 mg /kg silvestrol sammenlignet med kontroller etter en uke, og overlevelse av tumorbærende mus ble forbedret med en median overlevelsestid på 42 og 28 dager i silvestrol og kontrollgruppene, respektivt. Den effekt på overlevelsen ble ikke observert i ortotopiske xenografter i ikke-fibrotiske lever. Silvestrol behandling
i
vivo
endret ikke leveren struktur.
Konklusjoner
Disse dataene identifiserer silvestrol som en roman, strukturelt unike stoffet med potent anticancer aktivitet for HCC og støtte den potensielle verdien av målretting initiering av oversettelse i behandlingen av HCC
Citation. Kogure T, Kinghorn AD, Yan jeg, Bolon B, Lucas DM, Grever MR, et al. (2013) Terapeutisk Potensiale Oversettelse Inhibitor Silvestrol i Hepatocellulær Cancer. PLoS ONE 8 (9): e76136. doi: 10,1371 /journal.pone.0076136
Redaktør: Manlio Vinciguerra, University College London, Storbritannia
mottatt: 1 juni 2013; Godkjent: 23 august 2013; Publisert: 26.09.2013
Copyright: © 2013 Kogure et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd midler fra National Institutes of Health, DK069370 (TP) og National Cancer Institute, P01 CA125066 (ADK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den høye globale forekomst og dødelighet av leverkreft (HCC) understreker behovet for behandlinger som er effektive i å forbedre overlevelse [1]. HCC er sterkt motstandsdyktige overfor konvensjonelle terapeutiske metoder, og det er et behov for mer effektive terapeutiske midler for å styre disse kreftformene. Cure er bare mulig med kirurgisk reseksjon eller transplantasjon, men disse er ikke mulig for de fleste pasienter med denne kreftformen, og mange av dem til stede med mer avansert sykdom. Nyere studier har implisert flere forskjellige signaliseringsmekanismer i molekyl patogenesen av denne kreft [2]. Disse står for heterogenitet av svar og begrense nytten av terapeutiske intervensjoner ved hjelp av konvensjonelle strategier som søker å modulere spesifikke molekylære mål [3,4]. I dag er bare en agent, sorafenib, er tilgjengelig for systemisk terapi med beskjedne resultater for forbedring av overlevelse [5].
Tumorvekst krever ny proteinsyntese, og følgelig er forbundet med en økning i protein oversettelse. Direkte rettet oversettelse kan være et nyttig terapeutisk strategi, og garanterer hensynet til HCC [6,7]. Flere studier har rapportert onkogene effekter som følge av ektopisk ekspresjon av eukaryote initiering faktor eif-4E, som er et hastighetsbegrensende faktor for oversettelse inhibering [6]. Videre har en anti-tumor effekt av målrettet nedregulering av eif-4E blitt vist i flere studier ved bruk av diverse tumor xenograft-modeller. Målretting med andre komponenter av proteintranslasjon maskiner har også vært effektiv ved modulering av tumorcellevekst. Beskjeden antitumor effekt for HCC har blitt vist ved hjelp av hemmere av mammalian target of rapamycin (mTOR) veien som er involvert i proteinsyntesen [8-10].
rocaglate silvestrol er en cyklopentaCb [b] benzofuran flavagline fra
Aglaia
slekt av familien Meliacae [11-13]. Som medlem av en ny klasse av narkotika med en unik struktur, er silvestrol en attraktiv sammensatte å målrette HCC [14]. Silvestrol har egenskapen til å modulere oversettelse ved å hindre ribosom lasting på mRNA maler ved å målrette den eukaryote initiering faktor, EIF-4A [15,16].
In vivo
anti-tumor aktivitet er vist for silvestrol i hematologiske maligniteter som kronisk lymfatisk leukemi, akutt lymfatisk leukemi og mantelcellelymfom [16-18], sannsynligvis gjennom uttømming av kort halveringstid pro- vekst eller pro-overlevelse proteiner inkludert cyclin D og Mcl-en. I dyrestudier ved bruk av Eμ-myc-modellen, kan silvestrol forbedre følsomheten til vanlige midler, slik som doksorubicin [15]. Således utførte vi prekliniske studier for å vurdere rollen til denne unike forbindelsen for behandling av HCC. Våre data viser at silvestrol er en effektiv cytostatisk og cellegift for HCC celler både
in vitro Hotell og i orthotopic tumorcelletransplantater
in vivo
, og støtte videre utvikling av denne agenten som en terapeutisk for HCC.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Alle dyrestudier ble utført etter Institutional Animal Care og bruk komité prosedyrer og retningslinjer på Ohio State University under en godkjent protokoll.
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Menneskelig HCC cellelinjer, PLS /PRF /5 (PLC), HepG2, Hep3B og Huh7 ble hentet fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia) og ble dyrket i minimum essensielt medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antimykotisk /antibiotikablanding. Luciferase-uttrykke PLC (PLC-Luc), som ble generert ved stabil transfeksjon med luciferase-uttrykke phCMV plasmid som inneholder cDNA som koder for fi re fl y luciferase genet, ble vennlig levert av Dr Ching-Shih Chen (College of Pharmacy, Ohio State University, Columbus, ÅH). Cellelinje autentisering ble utført av genética DNA-laboratorier (Cincinnati, Ohio).
Cvtotoksisitetsmålinq
Celleviabilitet ble vurdert ved hjelp av CellTiter 96 vandig analysen kit (Promega, Madison, WI). Celler (5000 /brønn) ble sådd ut i 96-brønners plater (BD Biosciences, Rockville, MD) og inkubert ved 37 ° C over natten før tilsetning av eksperimentelle midler. Celleviabilitet ble vurdert etter 72 timer. IC
50 verdier ble beregnet ved hjelp XLfit programvare (IDBS, Burlington, MA). Legemiddelinteraksjoner ble evaluert ved hjelp av et fast forhold av konsentrasjoner. Resultatene ble analysert ved hjelp av median effekter analyse og kombinasjonen indeks (CI) avledet bruker Calcusyn programmet (Biosoft, Cambridge, Storbritannia).
apoptose Analyser
Cellene ble dyrket i fire -vel kammers objektglass (5 x 10
4 celler per brønn) i 500 ul medium og inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2. 100 nM av silvestrol ble tilsatt, og omfanget av celle apoptose ble bestemt etter 24 timer. Celler med morfologiske forandringer av apoptotisk celledød ble kvantifisert ved hjelp av fluorescens mikroskopi etter farging med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). For kaspase-3/7-analyser, ble cellene dyrket i 96-brønners plater (5 x 10
3-celler per brønn) og var 100 nM av silvestrol i opp til 24 timer). Caspase-3/7 aktivitet ble vurdert ved hjelp av en luminometric assay (caspase-Glo 3/7 analysen, Promega Corp., Madison, WI).
Måling av mitokondriemembranen potensial
Nedbrytning av mitokondriell membranpotensialet ble påvist ved hjelp av JC-1 (APO LOGIX ™ JC-1, Peninsula Laboratories Inc., San Carlos, CA). For fluorescens mikroskopi, ble cellene dyrket i et 4-brønns kammer sleiden (5 x 10
4 celler pr brønn) i fluorescens mikroskopi, eller i 96-brønners plater (5 x 10
3-celler per brønn) for fluorometrisk gjenkjenning. Celler ble inkubert med 100 nM av silvestrol i 24 timer, deretter med 5 mg /ml av JC-1 ved 37 ° C i 15 min. Intakte mitokondriene blir oppdaget som røde aggregater med utslipp på 590 nm og mitokondrie membran depolarisering ble oppdaget som grønn fluorescens med utslipp på 530 nm.
Western Blotting
Celler dyrket i 6-brønners plater ble vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) og lysert ved inkubering i 30 minutter i 600 mL av cellelyseringsbuffer med proteaseinhibitorer (Complete lysis-M EDTA-fri, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland). Lysat proteinkonsentrasjonen ble målt ved hjelp av en bicinchoninic syre analysesett (Protein Assay Kit, Pierce Biotechnology, Rockford, IL). ~ 25 mg protein ble blandet med NuPAGE LDS-prøvebuffer (Invitrogen, Carlsbad, CA) og proteiner separert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) under anvendelse av NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris geler (Invitrogen). Etter elektroforese ble proteinene i gelene overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Membranene ble blokkert med 5% bovint serumalbumin (BSA) i Tris-bufret saltvann, og ble inkubert med primære antistoffer og IRDye700- og IRDye800 merkede sekundære antistoffer (Rockland, Gilbertsville, PA) i henhold til produsentens instruksjoner. Proteinet av interesse ble visualisert og kvantifisert ved hjelp av LI-COR Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Bioscience, Lincoln, NE).
Induksjon av leverfibrose hos nakne mus
Seks ukers -gammelt mannlige imunodeficient mus (NCR nude) ble oppnådd fra Taconic (Hudson, New York) og matet mat og vann
ad libitum
. Musene ble opprettholdt i samsvar med Institutional Animal Care og bruk komité prosedyrer og retningslinjer under en godkjent protokoll. Leverfibrose ble indusert i nakne mus ved subkutan injeksjon av 0,4 g /kg kroppsvekt karbontetraklorid (CCl
4) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to ganger ukentlig. CCI
4 ble fortynnet i olivenolje (CCI
4: olivenolje = 1: 7) og sterilisert ved bruk av 0,22 mm-filter før bruk. For valideringsstudier for å verifisere og kvantifisere leverfibrose, CCI
4 ble administrert til hårløse mus to ganger ukentlig. Etter 6, 9, eller 12 uker, ble lever ut og fiksert med formalin for patologisk undersøkelse. Etter farging levervev med Masson er Trichrome ble minst fem tilfeldig utvalgte mikroskopiske bilder av vevssnitt fra hver mus fotografert med digital bildebehandling (NIS-Elements, NIKON, Tokyo, Japan) og prosent område av leverfibrose kvantifisert ved hjelp av NIH ImageJ programvare (National Institute of Health, Bethesda, MD).
ortotopiske HCC celle xenograft modell
CCI
4 eller fortynningsmiddel ble administrert subkutant to ganger per uke i 10 uker som ovenfor, etterfulgt av direkte intrahepatisk injeksjon av PLC
luc
celler til å etablere ortotopiske tumorcelletransplantater i immunodeficient mus som følger. Laparotomi ble utført ved anvendelse av isofluran anestesi og den venstre leverlapp ble eksponert. PLC-Luc-celler (10
6), ble suspendert i 20 ml serumfritt medium inneholdende 50% av Matrigel (BD Bioscience, San Jose, CA), og langsomt injisert i den venstre leverlapp ved anvendelse av en 28-gauge nål . Etter fjerning av nålen, ble kompresjon påført ved injeksjonsstedet ved hjelp av en bomullspinne for å unngå blødning. Bukveggen muskler og hud ble stengt ved kontinuerlig sutur med absorberbare sutur materiale. Ti dager etter tumorcelle-injeksjon, ble bioluminescens avbildning ved hjelp av IVIS avbildningssystem (Xenogen Corp, Alameda, CA) startet for å overvåke etablering og veksten av tumorer. Mus ble bedøvd med isofluran og D-luciferin (Gold Biotechnology, St. Louis, MO) oppløst i PBS ble administrert intraperitonealt (150 mg /kg kroppsvekt mus). Etter 10 minutter ble musene avbildes med en svært følsom, avkjølt CCD-kamera i en lystett prøvekammer (IVIS200, Xenogen). Oppkjøp og quanti fi kasjon av Bioluminescens signaler ble utført ved hjelp av levende bilde programvare (Xenogen). For en foreløpig studie, ble fem mus avlivet etter minst fire uker med overvåking. Bioluminesens bildebehandling var korrelert med levertumorvolum estimert ved hjelp caliper målinger og en standard formel: 1/6 * bredde * lengde * dybde. For
in vitro
bioluminesens imaging, celler ble talt opp og belagt (40-10240 celler) på svart 96-brønns plate. D-luciferin (150 mikrogram /ml) ble tilsatt til hver brønn og bildebehandling ble utført etter 10 minutter ved hjelp av IVIS.
Behandling studie i xenograft modell
En behandlingsstudie ble utført i ortotopiske xenografter i nakne mus med eller uten induksjon av hepatisk fibrose. Etter intrahepatisk PLC-Luc celle implantasjon, ble bioluminesens overvåkes for å overvåke utviklingen av svulster. Når Bioluminescens intensitet oversteg 10 millioner foton /sek, ble mus med ortotopiske xenografter randomisert til å motta silvestrol (0,4 eller 1 mg /kg kroppsvekt ip) eller kontroll (0,5 ml /kg kroppsvekt 0,1% DMSO i saltvann) i 5 påfølgende dager en uke i fire uker. Terapeutisk respons ble definert som en 30% reduksjon i bioluminescence intensitet fra baseline. Musene ble fotografert ukentlig i 10 uker fra behandlingsstart.
Hepatotoksisitet etterforskning i villtype mus
Seks uker gamle, kvinne, C57BL /6 mus ble behandlet med 0 (kjøretøy kontroll) eller 1,5 mg /kg av silvestrol (n = 7 per gruppe) hver 48 time i 28 dager ved den intraperitoneale rute. Ved obduksjon ble blod samlet opp for å måle serum alanin (ALT) og aspartat aminotransferase (AST), mens leveren ble fiksert ved nedsenking i nøytral bufret 10% formalin. Histopatologiske lesjoner i fast, parafin-embedded, hematoxylin og eosin (H E) -stained vevssnitt ble gradert av en bord-sertifisert veterinær patolog ved hjelp av en 5-lagdelt, semi-kvantitativ skala: innenfor normale grenser, eller minimal, mild, moderate eller store endringer.
Kjemikalier og reagenser
Silvestrol, {6-O-demetyl-6- [6- (1,2-dihydroksyetyl) -3-metoksy-1,4 -dioksan-2-yl] -aglafolin}, ble isolert fra barken og kvister av Aglaia foveolata Pannell (mahognifamilien), som tidligere beskrevet av AD Kinghorn. Silvestrol ble resuspendert i dimetylsulfoksyd (DMSO) og lagret ved -80 ° C. Sorafenib ble oppnådd fra LC Laboratories (Woburn, MA) og fortynnet i DMSO. Rapamycin ble oppnådd fra Calbiochem (San Diego, CA) og fortynnet i DMSO. Konsentrasjonen av DMSO var under 0,1% for alle studiene. Z-VAD-FMK ble hentet fra Promega (Madison, WI)
Statistisk analyse
Dataene ble analysert ved enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av en post hoc prosedyre. For analyse av overlevelse, ble overlevelseskurver laget av Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet med en log-lank test. Multivariabel analyse ble utført med Cox proporsjonale hazard regresjon. Statistisk signifikans ble akseptert til en verdi av
p
0,05.
Etikk uttalelse
Alle dyrestudier ble utført etter Institutional Animal Care og bruk komité prosedyrer og retningslinjer på Ohio State University under en godkjent protokoll.
Resultater
silvestrol hemmer menneskelig HCC cellevekst
in vitro
for å undersøke potensialet anti-tumor effekt av silvestrol, begynte vi ved å undersøke effekten av silvestrol på cellevekst
in vitro
ved hjelp av et panel av forskjellige ondartede humane hepatocytter cellelinjer. Inkubering med silvestrol resulterte i en konsentrasjonsavhengig effekt ved inhibering av cellevekst i alle tumorcellelinjer undersøkt, med en IC50 på 23,9 nM i PLC /PRF /5, 12,5 nM i Hep3B, 14,6 nM i Huh 7 og 86 nM i HepG2 celler (Figur 1). Disse data indikerte at silvestrol hadde en svært potent anti-kreft-effekt i humane HCC celler.
Humant HCC celler ble sådd ut på 96-brønners plater (5.000 celler /brønn) og inkubert med forskjellige konsentrasjoner av silvestrol eller kontroll ( fortynningsmiddel). Celleviabilitet ble vurdert etter 72 timer ved hjelp av en metabolsk levende celle analysen (CellTiter 96 AQ, Promega Corp., Madison, WI). Dataene representerer gjennomsnittet og standardavvik for fem separate bestemmelser.
induksjon av celledød ved apoptose i HCC celler ved silvestrol
Vi antok at cytotoksisiteten til silvestrol oppstått som et resultat av induksjon av apoptose mediert av nedsatt syntese av kortvarige apoptose regulatoriske molekyler som Mcl-en [16,17]. Således undersøkte vi induksjon av apoptose i PLC /PRF /5 humane HCC celler etter inkubering med 100 nM silvestrol. Caspase 3/7 aktivering ble påvist ved luminometric assay, med en økning i aktiviteten bemerket i løpet av 30 minutter og varte i opptil 6 timer (figur 2A). Tilsvarende en øket spaltning av polyADP-ribose polymerase (PARP), et substrat for caspase-aktivitet, ble også observert sammen med spaltningen av andre caspaser som kaspase 8 og 9 (figur 2B). Pre-inkubering av cellene i 30 minutter med den kaspaseinhibitor 50 uM zVAD-FMK redusert cytotoksisitet fra påfølgende inkubasjon med 50 nM silvestrol fra 36,4 ± 3,5% 17,6 ± 2,9% etter 24 timer. I samsvar med disse endringene, 19,3% av PLC /PRF /5 celler viste morfologiske funksjoner i cellene gjennomgår apoptose etter 24 timer (Figur 2C). Disse studiene tyder på at morfologiske og biokjemiske egenskaper av apoptose oppstå tidlig i løpet av inkubasjon av cellene med HCC silvetrol.
PLC /PRF /5 HCC celler ble sådd ut på fire-brønners kammerskyveren (25.000 celler /brønn) og inkubert med 100 nM silvestrol i 24 timer. Apoptotiske celler ble påvist ved fluorescens mikroskopi etter DAPI farging. Andelen av celler som viser morfologiske trekk ved apoptose ble talt opp. *,
p
0,05, t-test.
Silvestrol forandrer uttrykk for Mcl-en
Vi postulerte at effekten av silvestrol kan være mediert av effekten på modulering av syntesen av kort halveringstid regulatorer av apoptose som Mcl-en og BCL-X
L. Vi vurderte derfor effekten av silvestrol på Mcl-1 protein og mRNA uttrykk. En reduksjon i Mcl-1-protein ekspresjon som varer i inntil 24 timer ble notert som respons på silvestrol i PLC /PRF /5-celler (figur 3). I motsetning til dette, ble ekspresjon av Mcl-1 mRNA betydelig økt. ble observert Tilsvarende endringer i HepG2 celler. Som Mcl-1 kan virke som en anti-apoptotiske faktor til å blokkere den frigjøring av cytokrom C fra mitokondrier, undersøkte vi effekten av silvestrol på mitokondrie integritet. Inkubering med 100 nM silvestrol i 24 timer resulterte i et tap av mitokondriemembranpotensialet bestemt ved fluorescens mikroskopi etter farging med JC-1 i PLC /PRF /5-celler (figur 4A). JC-1 fluorescens-forholdet (rød til grønn) økt til 141% av kontroll i PLC /PRF /5-celler inkubert med silvestrol (figur 4B). Dermed kunne de mekanistiske effektene av silvestrol på HCC cellevekst oppstår fra økt apoptose som følge av en nedgang i mitokondriemembranen potensialet knyttet til tap av Mcl-en til tross for økt Mcl-1 mRNA transkripsjon som beskrevet i KLL celler [17].
(A) PLC /PRF /5 HCC celler ble sådd på 96-brønners plate (5.000 celler /brønn) og inkubert med 100 nM silvestrol i opp til 24 timer. Caspase-3/7 aktivering ble vurdert ved hjelp av en luminometric assay (caspase-Glo 3/7 analysen, Promega Corp., Madison WI). Dataene representerer gjennomsnittet og standardavvik for tre separate bestemmelser. (B) PLC /PRF /5-celler ble sådd ut på 6-brønners plater (20,000 celler /brønn) og inkubert med 100 nM silvestrol (100 nM) i opptil 24 timer. Celler ble høstet ved de angitte tider, og immunoblotanalyse for apoptose-relaterte proteiner ble utført. *,
p
0,05, ble ANOVA, Fishers plsd (C) PLC /PRF /5-celler og HepG2-celler utsådd i 6-brønners plater og inkubert med 100 nM silvestrol i opp til 24 timer. Ekspresjon av Mcl-1-proteinet ble undersøkt ved immunblotting. (D) RNA ble ekstrahert ved hvert tidspunkt og Mcl-1 mRNA-ekspresjon nivå ble bestemt ved kvantitativ real-time PCR. Verdier er uttrykt i forhold til ekspresjon i ikke-behandling etter normaliseringen ved hjelp av GAPDH som en intern kontroll. Dataene representerer gjennomsnittet og SD. *,
p
0,05, ANOVA, Fisher plsd.
A, PLC /PRF /5-celler ble sådd på 4-brønn kammer lysbilde (25.000 celler /brønn) og inkubert med 100 nM silvestrol i 24 timer. Cellene ble farget med JC-1 og mitokondriell permeabilitet ble oppdaget ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Celler som oppviser rød fluorescens i henhold til basale betingelser, men grønn fluorescens følgende endring i mitokondriemembranpotensialet. B, PLC /PRF /5-celler ble sådd på 96-brønners plate (5000 celler /brønn) og inkubert med 100 nM silvestrol i 24 timer. Celler ble farget med JC-1 og forholdet av grønn til rød fluorescens ble bestemt fluorometrisk (gjennomsnitt ± SD). *,
p
0,05, t-test.
Silvestrol modulerer følsomhet for kjemoterapi
Gitt den intense interesse for å utvikle nye terapeutiske midler for HCC, er det sannsynlig at den kliniske bruken av silvestrol kan innebære sin brukes i kombinasjon med andre terapeutiske midler. Sorafenib er en muntlig multi-kinase inhibitor som nylig har blitt vurdert og godkjent for bruk i avanserte HCC. Selv om det har potent aktivitet mot Raf /MEK /ERK vei, kan den terapeutiske effekt for HCC involvere andre veier. mTOR signal ofte hyperactivated i HCC, og målretting mTOR er en attraktiv terapeutisk strategi [19]. Vi undersøkte interaksjoner mellom silvestrol og enten sorafenib eller mTOR-hemmer rapamycin. PLC /PRF /5-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av silvestrol i kombinasjon med sorafenib eller rapamycin, og cytotoksisiteten ble bestemt etter 72 timer. Kombinasjonen av enten sorafenib eller rapamycin med silvestrol øket celledød indusert av den sistnevnte (figur 5A og 5B). Interaksjon evaluert av medianeffektanalyse av Chou og Talalay var i samsvar med en synergistisk interaksjon i veksthemming med disse kombinasjonene (figur 5C) [20]. Videre kombinasjon med silvestrol resulterte i en gunstig dosereduksjon indeks for både sorafenib (3,42 ganger reduksjon) og rapamycin (1,75 ganger reduksjon) (figur 5D). Således kan silvestrol virke synergistisk med andre kjemoterapeutiske midler som kan benyttes for HCC.
PLC /PRF /5-celler ble sådd på 96-brønners plater (5000 celler /brønn) og ble inkubert i 72 timer med forskjellige konsentrasjoner av silvestrol (SVL) og (A) sorafenib (SRF) i et fast forhold på SVL: SRF på 1: 250 eller (B) rapamycin (RPM) ved et fast forhold på SVL: RPM på 1: 2,5. Celleviabilitet ble vurdert ved hjelp av en metabolsk analyse (CellTiter 96 AQ, Promega Corp., Madison, WI). Potensielle interaksjoner mellom silvestrol og sorafenib eller rapamycin ble evaluert ved hjelp av medianeffektanalyse av Chou og Talalay å utlede (C) kombinasjon indeks og (D) dosereduksjon indeks av kombinasjonene.
Murine orthotopic HCC xenograft modell
for å evaluere den terapeutiske bruken av silvestrol
in vivo
, vi etablert en ny sykdom relevant modell av HCC av orthotopic tumorcelle xenograft implantering i fibrotiske eller ikke-fibrotiske lever i immunsvikt mus . Den store fordelen med denne tilnærmingen over konvensjonelle prekliniske modeller som underhudssykdommer xenografter er at det er mer etterligner den opprinnelige svulsten mikromiljøet. Dette muliggjør vurdering av sykdomsrelevante microenvironmental påvirkninger på narkotika følsomhet
in vivo
. Leverfibrose ble eksperimentelt indusert av CCI
4 administrasjon, og tilstedeværelsen av fibrose verifisert og kvantifisert ved digital bildeanalyse etter Masson er Trichrome farging. Patologisk undersøkelse viste typiske fibrotiske forandringer i leveren hos mus med fortykkelse av portal traktater og utviklingen av fibrose (Figur 6A). Prosentandelen av arealet av fibrose økning i dosen av CCU
4 avhengig måte (figur 6B). Deretter PLC /PRF /5 celler konstitutivt uttrykker luciferase (PLC
luc
) ble etablert ved stabil transfeksjon ved hjelp av en GFP-luciferase konstruere. Bioluminescens av disse luciferase-uttrykkende PCL /PRF /5 stabile transfektanter (PLC-Luc celler) ble verifisert
in vitro
, med en sterk positiv korrelasjon observert mellom bioluminescens intensitet og antall celler
in vitro product: (Figur 7A) (
r
2 = 0,973). Deretter ble ortotopiske xenotransplantater etablert ved intrahepatisk injeksjon av PLC-luc-celler (10
6 celler) i den venstre leverlapp av nakne mus (8 uker gamle, hann, n = 5) og bioluminescens avbildning utført for å overvåke etablering og vekst av levertumor som starter ved 10 dager etter implantasjon (figur 7B). Bioluminescens i leveren ble observert å øke med tiden. Etter minst 4 uker ble musene avlivet og volumet av utvunnet tumorer ble oppnådd ved kalibermåling. Det var en positiv korrelasjon mellom bioluminescence intensitet før levertumor utvinning in vivo, og tumor volum (
r
2 = 0,638) (figur 7C). Disse studiene validert ved bruk av PLC-Luc celler og bioluminescens avbildning for å måle tumorvekst
in vivo
.
leverfibrose ble indusert i nakne mus ved to ganger ukentlig injeksjon av karbontetraklorid (CCl
4) ved dosering på 0,4 g /kg kroppsvekt til 6, 9 og 12 uker.
A Hotell og
B
, typiske bilder av leverhistopatologi med Trichrome farging (A, kontroll, B, CCI4 12 uker). Leveren ble løst med formalin og farget med Masson er trichome.
C
, Minst fem bilder ble tilfeldig tatt fra hver lever seksjon og prosentandelen av arealet av fibrose ble analysert ved anvendelse av NIH ImageJ programvare. Data representerer prosentandelen av det totale område med fibrose uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *,
p
0,05, ANOVA, Fisher plsd.
En
,
I
vitro
bioluminescence avbildning av PLC
luc
celler. Cellene ble telt og utsådd på svarte 96-brønns plater. D-luciferin (150 ug /ml) ble tilsatt til hver brønn og avbildning ble utført ved anvendelse IVIS. Bioluminesens er plottet mot cellenummer.
B
,
I
vivo
bioluminesens imaging. Ortotopiske svulster ble etablert ved direkte intrahepatisk injeksjon av PLC
luc
celler. En million PLC
luc
celler ble injisert i venstre leverlapp. Veksten av svulster ble overvåket av bioluminescent bildebehandling bruker IVIS. C, Forholdet mellom tumorvolumet og bioluminescens. Etter minst 4 uker med overvåking mus ble avlivet, og lever tumorvolumer ble oppnådd ved bruk av kalibermåling. Den estimerte volumet av tumor etter utskjæring er plottet mot bioluminesens bestemmes in situ.
Leveren fibrosis modulerer tumorcellevekst
Tilstedeværelsen av leverfibrose er en viktig faktor for HCC utvikling (Figur 8). Vi først undersøkte effekten av fibrose i startfasen og tumorvekst. Nitten mus hver ble administrert subkutant 0,4 mg /kg kroppsvekt av enten CCl
4 (19 mus) eller bærer (18 mus) to ganger ukentlig i 10 uker. Intrahepatisk tumorcelle implantasjon ble utført etter 10 uker, og da fibrose er etablert i alle mus som fikk CCI
4. En mus i bærergruppen døde umiddelbart etter tumorcelle implantasjon kirurgi. Fire mus, en i CCU
4 gruppe og tre i bilen behandlet gruppe, ikke utvikler levertumor etter minst 12 uker etter implantasjon. En CCI
4 behandlet mus som utviklet målbar tumor døde før behandlingen starter. De resterende 32 levertumorbærende mus som besto av 17 CCl
4-behandlede mus (fibrøse lever gruppe), og 15 bærerbehandlede mus (ikke-fibrotisk leveren). Når tumordannelse ble påvist, med bioluminescens intensitet 10 mill foton /sek, hver mus i hver gruppe (fibrotisk /ikke-fibrotisk lever) ble randomisert til å motta enten silvestrol (0,5 mg /kg eller 1 mg /kg kroppsvekt) eller DMSO 0,1% (kontroll) av ip injeksjon fem sammenhengende dager i uken i fire uker. En mus ble randomisert, men døde før de fikk noen injeksjoner og ble ikke inkludert i analysen. Gjennomsnittlig varighet fra tumorcelle injeksjon randomisering ble betydelig redusert hos mus med leverfibrose sammenlignet med ikke-fibrotisk mus (14,2 dager
vs
21,5 dager, p = 0,0011, (figur 8A). Hyppigheten av svikt i tumorutviklingen var lavere i fibrotisk mus (en av 19 mus, 5,26%) enn i ikke-fibrotisk mus (3 av 18 mus, 16,7%) (figur 8B). Det var ingen statistisk signifikant forskjell i den kumulative overlevelse mellom ikke-fibrotisk mus og fibrotisk mus i bilen behandlede kontrollgruppen (p = 0,59), og median overlevelse ganger beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden var 25 dager for ikke-fibrotiske mus, og 28 dager for fibrotiske mus.
mus fikk 0,4 g /kg karbontetraklorid for å fremkalle leverfibrose (n = 19) eller kjøretøy injeksjoner (n = 18) i ti uker. ortotopisk tumorer ble deretter etablert ved direkte intrahepatisk injeksjon av 10
6 PLC
LUC
celler. Tumor celle xenograft vekst ble overvåket av bioluminesens bildebehandling og ble oppdaget i 18 mus med fibrotiske lever og i 15 musene uten leverfibrose. (A) Den tid i dager (gjennomsnitt ± SE) for levertumorvekst fra tumorcelleinjeksjon til bioluminescens intensiteten av 10
7 foton /sek er vist. (B) Frekvens av svikt i tumordannelse (%). (C) Virkning av fibrose på tumorvekst. Endringen i bioluminescens intensitet som en prosent av utgangsverdien (gjennomsnitt ± SE) er plottet mot tid. Når bioluminesens oversteg 10
7 foton /sek, ble hver mus randomisert til en behandlingsgruppen og motta silvestrol eller fortynningsmiddel (kontroll). D, Survival kurve av
kontroll
gruppe. Tilstedeværelsen av leverfibrose ikke påvirke overlevelsen av mus med tumor-xenografter som ikke fikk noen behandling. *,
p
0.05.
Silvestrol skader ikke normale hepatocytter
in vivo
Silvestrol administrasjon på 1,5 mg /kg annenhver dag i 28 dager induserte ikke synlige lesjoner i leverparenkym av noen mus. Spesielt verken nekrose eller apoptose var tydelig innen hepatocytter, gallegang epitel, eller bosatt sinusmakrofager (dvs. Kupffer celler). I forhold til kontroll dyr, behandling med silvestrol var assosiert med beskjedne økninger i serum aktiviteter av ALAT og ASAT i tre av syv mus. *,
p
0,05.
