Abstract
mikroRNA-210 (MIR-210), master hypoxamir, spiller pleiotrope roller i visse kreftformer ; imidlertid dens rolle i utviklingen av human kolorektal kreft er fortsatt uklar. Heri, rapporterer vi at MIR-210 er ofte oppregulert i kolorektal kreft vev, med høy Mir-210 uttrykk betydelig korrelere med stor svulst størrelse, lymfeknutemetastase, avansert klinisk stadium og dårlig prognose. Funksjonelt, fremmer MIR-210 overekspresjon migrasjon og invasjon av kolorektal kreft celler. Videre kan MIR-210 bli indusert av hypoksi og formidler hypoksi-indusert metastasering av kolorektal kreft celler. I tillegg er vakuolen membranprotein 1 (VMP1) identifisert som den direkte og funksjonelle mål av MIR-210. Dermed er MIR-210 en nyttig biomarkør for hypoksiske tumorceller og en prognostisk faktor som spiller en viktig rolle i kolorektal kreft metastase
Citation. Qu A, Du L, Yang Y, Liu H, Li J, Wang L, et al. (2014) Hypoksi-induserbar MiR-210 er en uavhengig prognostisk faktor og bidrar til metastaser i tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (3): e90952. doi: 10,1371 /journal.pone.0090952
Redaktør: Fabio Martelli, IRCCS-Policlinico San Donato, Italia
mottatt: 19 september 2013; Godkjent: 06.02.2014; Publisert: 14 mars 2014
Copyright: © 2014 Qu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (No. 81271916, 81301506); Foundation Shandong-provinsen Natural Science of China (No. ZR2010H004); Forskningsfondet for doktorgradsutdanning av høyere utdanning i Kina (nr 20120131110055) og National Key Klinisk medisinske spesialiteter fundament. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er fortsatt den tredje vanligste kreftformen i verden og står for den femte største årsaken til kreft-dødsfall i Kina [1]. Selv om de siste forbedringene i diagnostiske teknikker og klinisk ledelse har økt tidlig påvisning av CRC og redusert dødelighet, ca 25% av CRC pasienter til stede med stadium IV sykdom [1]. Videre pasienter med avansert sykdom ofte utvikle tilbakevendende sykdom etter lengre radikale resections dermed viser ekstremt dårlig overlevelse på grunn av metastaser [2], og 5-års postsurgical overlevelse faller fra 90% til 10% eller enda mindre etter metastasering har oppstått . Et økende antall studier har vist at både kreftceller og mikromiljøfaktorer orkestrere de kritiske hendelser som fører til metastaser [3], og dermed understrekes behovet for å videre forstå svulsten mikromiljøet og molekylære mekanismene som er involvert i tumormetastaser.
Hypoksi, eller lavt oksygen spenning, er en vanlig funksjon av solid tumor mikromiljøet. Hypoksiske tumorer har en tendens til å være mer aggressiv, mer sannsynlig å metastasere, mer resistente mot konvensjonell terapi, og er assosiert med en dårlig prognose [4] – [6]. Genet som koder for HIF1 (hypoksi-induserbar faktor-1), som er sammensatt av HIF1α og HIF1β underenheter, er kanskje den mest studerte gen som spiller en vesentlig rolle i respons til hypoksi [7]. HIF1α er stabilt under hypoksiske forhold, med sitt uttrykk raskt avtagende henhold normoksisk forhold, mens HIF1β er konstitutivt uttrykt under begge betingelsene [8]. Bevis akkumulerer angående betydningen av HIF1α ekspresjon i ulike faste tumorer [9] – [11], og øket HIF1α ekspresjon er nylig blitt rapportert for å bidra til kolorektal cancer metastase [12], [13]
microRNAs. (mirnas, Mirs) er en ny klasse av endogene, små, ikke-kodende RNA-oligonukleotider som regulerer genuttrykk ved å målrette den 3 «ikke-translatert område (3»-UTR) av den tilsvarende mRNA [14], [15]. Feilregulering av miRNAs er en velkjent viktig prosess i patogenesen av mange kreftformer og kan oppstå når som helst, fra initiering til metastaser. Det er en funksjonell kobling mellom hypoksi og mikroRNA feilregulering i kreft. For eksempel, har Chen H rapportert at MIR-103/107 ble økt i nærvær av hypoksi og kan bidra til hypoksi-stimulert metastaser i CRC [16]. Mange microRNAs, slik som MIR-21, 93, 103, 107, 192, 195, 210, og 213, kan induseres og sterkt oppregulert ved HIF1α i kreftceller i henhold til hypoksiske betingelser [17], [18]. Blant de mirnas indusert av HIF1α, er miRNA-210 det mest fremtredende og konsistent oppregulert miRNA under hypoksiske respons på forskjellige typer av tumorceller og normale celler [19], [20]. Nylig, Ying et al. viste at hypoksi-indusert MIR-210 kan forbedre migrasjon og invasjon av leverkreft (HCC) [21], og Redova og kolleger fant at nedregulering av MIR-210 hemmet trekkfugl og invasiv potensial for nyrecellekreft (RCC) [ ,,,0],22], Rothe rapporterte lignende resultater i brystkreft [23]. De fleste studier har vist at MIR-210 kan virke som en onkogen miRNA og er assosiert med en dårlig prognose i noen humane epiteliale cancere [21], [24] – [26]. Imidlertid har noen studier indikerte at Mir-210 uttrykk er tapt under tumorigenesis og at miRNA utøver en tumor-suppressor effekt på human epitelial eggstokkreft og esophageal plateepitelkarsinom [27], [28]. Disse data indikerer at MIR-210 kan spille viktige roller i løpet av tumorigenese og progresjon av kreft, og kan utøve en rekke virkninger på forskjellige kreftformer. Selv om det har blitt rapportert at MIR-210 uttrykkes og sterkt oppregulert i respons til hypoksi i CRC-cellelinjer (HCT-116 og HT-29), er funksjonen av MIR-210 i kolorektal kreft har ikke blitt klarlagt til nå, og dens rolle i kolorektal kreft progresjon er fortsatt uklart.
i denne studien har vi fokusert på MIR-210, den hypoksi-indusert miRNA, og undersøkt dens uttrykk i menneskelige CRC vev, analysert dens korrelasjon med clinicopathological egenskaper og prognose, og deretter avdekket rollen MIR-210 i hypoksi-indusert metastaser under kolorektal kreft progresjon.
Materialer og metoder
Pasient og vevsprøver
vevsprøver, inkludert tumorvev og tilstøtende ikke-kreft vev, ble innhentet fra 193 CRC pasienter på tidspunktet for kirurgi ved Institutt for generell kirurgi, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan, Kina, fra juni 2003 til februar 2008. Ingen av pasientene hadde noensinne mottatt noen cellegift, strålebehandling eller kirurgi. Alle vev ble umiddelbart plassert i flytende nitrogen og frosset ved -80 ° C til RNA-ekstraksjon. Denne studien ble godkjent av etisk komité Qilu Hospital, Shandong University, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient.
clinicopathological data, inkludert kjønn, alder, tumor plassering, tumor stadium, tumorstørrelse, lokal invasjon, histologisk differensiering og lymfeknutemetastase ble samlet retrospektivt. Varigheten av oppfølgingen ble beregnet fra tidspunktet for kirurgi i hjel eller siste oppfølging, og vi fullførte oppfølging i april 2012. Pasientene ble ekskludert fra analysen av clinicopathological egenskaper og prognose hvis de hadde ufullstendige medisinske poster eller mangelfull oppfølging.
Cell kultur
CRC cellelinjer (HT-29, SW480, og SW620) og HEK (humane embryonale nyre) 293T cellelinje ble kjøpt fra Type Culture Collection av Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), og HCT116 cellelinje ble kjøpt fra Shanghai Institute of Biochemistry og cellebiologi (Kina). Alle cellelinjene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Hyaline, Logan, UT) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator. For å indusere hypoksi, ble cellene eksponert for en jevn strøm av en gassblanding med lav oksygen (1% O
2, 5% CO
2, og 94% N
2) i en fuktet inkubasjon kammer (MiniGalaxy, RSBiotech, Irvine, Skottland).
RNA isolering, cDNA syntese, og kvantitativ real-time polymerase chain reaction (QRT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen , Carlsbad, California) i henhold til produsentens protokoll. Alle manipulasjoner av RNA ble utført under RNase-frie betingelser. RNA-konsentrasjonen ble målt ved anvendelse av en BioPhotometer pluss (Eppendorf, Hamburg, Tyskland) ved 260 nm, og det isolerte RNA ble lagret ved -80 ° C inntil bruk. For analyse av HIF1α og VMP1mRNA ekspresjon, ble total RNA (1 pg) revers transkribert til cDNA ved anvendelse av Superscript Kit (Toyobo, Osaka, Japan), og QRT-PCR-analyser ble utført ved anvendelse av SYBR grønn (Toyobo, Osaka, Japan) og en ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, California). De fold endringer i HIF1α og VMP1 mRNA uttrykk ble kvantifisert ved hjelp av to
-ΔΔCT relativ kvantifisering metode med β-actin som housekeeping kontroll. De primere for β-aktin (forover primer: 5′-TGGAGTCCTGTGGCATCCACGAAA-3 «, reverse primer: 5′-TGTAACGCAACTAAGTCATAGTCCG-3′), HIF-1α (forover primer: 5»-ATCGCGGGGACCGATT-3 «, reverse primer: 5» -CGACGTTCAGAACTTATCTTTTTCTT-3 «) og VMP1 (forover primer: 5′-GAGATGCTGGAACATGCAGA-3′, reverse primer: 5»-TTGCTCCACTATGTGCTTGC-3 «) ble kjøpt fra BioSune, Shanghai, Kina. For miRNA uttrykket, ble cDNA syntetisert ved hjelp av gen-spesifikke primere (Ribobio, Guangzhou, Kina) og M-MLV RT kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i et 20-ul reaksjonsvolum. RT reaksjons reagenser inneholdt en mikrogram RNA mal, 1 ul 10 mM dNTP mix, 2 mL 0,1 M DTT, 4 pl 5 × første-strand buffer, og en mL 40 U /mL RNase inhibitor. Volumet ble justert med RNA-free H
2o. Den reverstranskripsjonsreaksjon ble utført i triplikat for å fjerne eventuelle utliggere. MiRNA uttrykket ble vurdert ved QRT-PCR og en ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, California). De fold endringer i miRNA uttrykket ble bestemt ved hjelp av to
-ΔΔCT metoden; uttrykket ble normalisert til U6 small nuclear RNA (U6) ekspresjonsnivå. I tillegg er den relative uttrykk for miRNA, HIF1α og VMP1 i HT-29 celler kuttet som kalibrator i hvert løp, og ble satt til verdien av 1.
Transfeksjon med miRNA /plasmid
CRC cellene ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
4 celler /brønn i 24-brønners plater eller ved 1,5 x 10
5-celler /brønn på 6-brønners plater og dyrket omtrent 24 timer før transfeksjon. Etter at cellene nådde 50% samløpet, transient transfeksjon av miRNA etterligner /inhibitor (RiboBio, Guangzhou, Kina) og /eller plasmid ble utført med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) etter produsentens anvisninger. For hvert eksperiment ble transfeksjonseffektiviteter evaluert ved QRT-PCR ved 24 timer etter transfeksjon.
migrering og invasjon analyser in vitro
Transwell kamre (diameter på 6,5 mm, porestørrelse på 8 um ) (Corning, NY, USA) belagt med eller uten Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) ble anvendt for å utføre migrering og invasjon analyser. Ved 24 timer etter transfeksjon, HT-29 (5 x 10
4-celler), eller SW480 (1 x 10
5-celler) celler ble resuspendert i et medium inneholdende 1% FBS og plassert i det øvre kammer av hvert innlegg. En aliquot av medium inneholdende 10% FBS (500 ul) ble tilsatt til de nedre kamre. Etter inkubering i 24 timer ved 37 ° C ble cellene fester seg til den nedre membranen farget med 0,1% krystallfiolett, avbildes (200 x) og tellet ved bruk av en IX81 invertert mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).
Luciferase assay
Luciferase reporter analysen ble utført ved hjelp av pmiR-REPORTTM vektorer (RiboBio, Guangzhou, Kina) som inneholder villtype (WT) -VMP1 3′-UTR sekvenser eller mutant (MUT) -VMP1 3 «-UTR sekvenser. HEK293T celler ble transient transfektert med Mir-210 etterligner /MIR-negativ kontroll og WT-VMP1 3′-UTR vektor /MUT VMP1 3»-UTR vektor. Luciferasepreparater aktiviteter ble målt ved hjelp av Dual-luciferase assay kit (Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens instruksjoner 48 timer etter transfeksjon.
Western blot
Totalt protein av dyrkede celler ble hentet av RIPA buffer som inneholder PMSF. BCA proteinanalysesett (Beyotime, Haimen, Kina) ble anvendt for å bestemme konsentrasjonen. Proteiner ble separert via SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Etter blokkering, ble membranen inkubert med mus-anti-VMP1 polyklonalt antistoff (Abcam, Southampton, UK) eller anti-β-actin mus monoklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), etterfulgt av inkubasjon med HRP-konjugert sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Signaler ble bestemt av en chemiluminescence deteksjon kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Statistisk analyse
SPSS (Statistical Package for Social Sciences) programvarepakke, versjon 18.0 (Chicago, IL, USA), ble brukt til å analysere alle data. Vi brukte først Kolmogorov-Smirnov test for å avgjøre fordelingen av dataene i hver gruppe. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD) eller median (interkvartilt område) når verdiene normalt eller unormalt ble distribuert, respektivt. Statistiske forskjeller mellom gruppene ble testet med Mann-Whitney
U
-test, Student
t
-test, eller en Kruskal-Wallis test, som passer. Korrelasjonen mellom MIR-210 og HIF1α (eller VMP1) ble bestemt ved Pearsons korrelasjonsanalyse. Kaplan-Meier metoden ble brukt for å estimere overlevelse, og overlevelse forskjeller mellom undergruppene ble undersøkt ved hjelp av log-rank test. En Cox regresjonsmodell (proporsjonal risikomodell) ble anvendt for univariate analyser og multivariat analyse av prognostiske faktorer. Forskjeller ble ansett som statistisk signifikant bare når
P
. 0,05
Resultater
MiR-210 er ofte oppregulert i kolorektal kreft vev og involvert i CRC utvikling
De uttrykk nivåer av MIR-210 i 193 par av menneskelige CRC vev og tilsvarende ikke-kreft vev ble undersøkt ved hjelp av QRT-PCR. For å sikre at referanse genet U6 ikke endrer seg mellom tumorvev og de tilsvarende ikke-cancervev, beregnet vi middel Ct-verdier som 2
-ct. Nivået på U6 viste ingen signifikante forskjeller mellom svulst og tilsvarende ikke-kreft prøver (2
-CtTumor /2
-CtNon-kreft = 0,93;
P
= 0,34) (Figur S1 ). Resultatene indikerte at MIR-210-ekspresjon i CRC vev var signifikant oppregulert i forhold til den i de tilstøtende normale vev (
P
0,001, figur 1A.). I tillegg, viste 58% (111 til 193) av prøvene mer enn to gangers oppregulering av MIR-210 sammenlignet med de ikke-kreft vevsprøver, noe som tyder på at overekspresjon av mir-210 er et vanlig arrangement i CRC. I en kontrollert eksperiment, også fant vi MIR-21, en annen uttrykt MIR i CRC [29], var signifikant oppregulert i CRC vev sammenlignet med tilstøtende ikke-tumorvev (
P
0,001, Figur S2 ), bekrefter gjennomførbarhet og pålitelighet av vår metode. Videre HIF1α uttrykk i CRC vev var oppregulert (
P
0,001; figur 1D) og positivt korrelert med Mir-210 uttrykk i CRC vev (r = 0,402,
P
1 (overekspresjon) og -1 (underexpression); de rester fold endringer ble definert som uendret. (C) Den overekspresjon av MIR-210 ble funnet hos 58% (111 til 193) av CRC vev i forhold til de tilstøtende ikke-tumorvevet. (D) HIF1α mRNA-ekspresjon ble påvist i CRC-vev (CRC) og tilstøtende ikke-tumorøse vev (NT), og dets ekspresjon var normalisert til nivået for β-aktin-ekspresjon i hver prøve. (E) Sammenhengen mellom MIR-210 uttrykk og HIF1α mRNA-nivåer i CRC-vev ble analysert ved hjelp av Pearsons korrelasjonsanalyse. (F) Kaplan-Meier-overlevelseskurver samlet i henhold til nivået av MIR-210 uttrykk. Pasientene med høy Mir-210 uttrykk hatt en vesentlig dårligere 5 års total overlevelsesrate enn de med lav Mir-210 uttrykk (
P
0,001). Median MIR-210 uttrykksnivået i tumorprøver ble valgt som cut-off point.
Vi oppsummert videre foreningen av Mir-210 uttrykk nivåer med ulike clinicopathological egenskaper i CRC vev og fant at MIR-210 uttrykk var signifikant korrelert med stor svulst størrelse (
P
= 0,014), lokal utbredelse (
P
= 0,047), positiv regional lymfeknutemetastase (
P
= 0,001), og TNM stadium (
P
= 0,005). Men det var ingen signifikante assosiasjoner mellom Mir-210 uttrykk og pasientens kjønn, alder, tumor sted, eller histologi Karakter (alle
P
0,05). De detaljerte resultatene av de statistiske tester mellom Mir-210 uttrykk og clinicopathological egenskaper er listet i tabell 1.
MiR-210 er en uavhengig prognostisk markør for total overlevelse av CRC pasienter
totalt 50 pasienter døde i løpet av oppfølgingsperioden, og den kumulative 5 års samlet overlevelse var 56,9%. Ved hjelp av medianen av Mir-210 uttrykk nivåer som en cutoff, fordelt vi de 116 CRC pasientene inn i to grupper: en høy Mir-210 uttrykk gruppe og en lav Mir-210 uttrykk gruppe. Vi brukte deretter Kaplan-Meier overlevelseskurve analyse for å vurdere den prognostiske verdien av MIR-210 i tykk- og endetarmskreft. Resultatene viste at pasienter med høyt MIR-210 uttrykk hadde en vesentlig dårligere prognose enn de med lav MIR-210 uttrykket (
P
0,001, figur 1F.). For å vurdere om Mir-210 uttrykk var en selvstendig indikator på total overlevelse for CRC pasienter, må vi først brukt en univariat Cox regresjonsmodell til å estimere den enkelte hasardratio for alle clinicopathological parametere. Resultatene viste at total overlevelse var signifikant relatert til Mir-210 uttrykk nivå (RR = 2,621; 95% CI, 1,457 til 4,712;
P
= 0,001) og fire andre parametere (tumor størrelse, lokal utbredelse, regional lymfeknutemetastase, og TNM stadium, alt
P
0,05). I multivariat analyse, er Cox modell som involverer de fem viktigste prognostiske faktorer identifisert Mir-210 uttrykk som en selvstendig prognostisk faktor for pasienter med CRC (
P
= 0,008). De statistiske verdier av Mir-210 uttrykk og de andre clinicopathological parametere avledet fra Cox regresjonsmodell er oppført i tabell 2.
MiR-210 er uttrykt i CRC cellelinjer og er indusert av hypoksi i CRC celler
Vi har undersøkt uttrykk nivået av MIR-210 i et panel av CRC cellelinjer, inkludert HCT-116, HT-29, SW620 og SW480. Resultatene viste at nivået av MIR-210 var høyest i HT-29-celler sammenlignet med de andre tre cellelinjer, og dens nivå var lavest i SW480-celler (Fig. 2A). Basert på dette uttrykket mønster, valgte vi derfor HT-29 og SW480 for følgende studier. Som presentert i figur 2D og 2E, fant vi at MIR-210 nivåer stiger som respons på hypoksi i disse cellene. Videre uttrykk for MIR-210 øker kraftig med langvarig eksponering for hypoksi, noe som indikerer at MIR-210 ble faktisk indusert av hypoksi i CRC cellelinjer.
(A) MiR-210 uttrykk i CRC cellelinjer. (B, C) HIF1α mRNA ekspresjon i HT-29 (B) og SW480 (C) celler under hypoksiske forhold. (D, E) MiR-210-ekspresjon i HT-29 (D) og SW480 (E) celler under hypoksiske betingelser. Dataene er presentert som gjennomsnittet av tre målinger, og de Feilstolpene representerer standardavvik for gjennomsnittet. *
P
. 0,05
MiR-210 fremmer CRC celle migrasjon og invasjon og formidler hypoksi-indusert migrasjon og invasjon av CRC celler
For å måle de biologiske egenskapene til Mir-210 i CRC celler, vi forbigående modulert Mir-210 uttrykk nivå ved transfeksjon med Mir-210 etterligner eller hemmer. Som vist i figur 3, transfeksjonseffektiviteten var meget høy i HT-29 og SW480 cellelinjer. Transwell eksperimenter med eller uten Matrigel ble utført for å teste effekten av MIR-210 på CRC celle migrasjon og invasjon, og vi fant at oppregulering av MIR-210 ved Mir-210 etterligner forbedret migrasjon og invasjon evne CRC celler (Fig . 4A, 4C). I samsvar med disse resultatene, transfeksjon med MIR-210-inhibitor førte til en betydelig reduksjon i migrasjon og invasjon evne til CRC-celler sammenlignet med celler transfektert med den MIR negativ kontroll (fig. 4B, 4D). Tatt sammen, våre observasjoner tyder på at MIR-210 kunne fremme migrering og invasjon evne til CRC-celler.
(A, C) MiR-210-ekspresjon i HT-29 (A) og (C) SW480-celler ble betydelig økt etter transfeksjon med Mir-210 etterligner. (B, D) MiR-210-ekspresjon i HT-29 (A) og (C) SW480-celler ble sterkt redusert etter transfeksjon med MIR-210-inhibitor. Dataene er presentert som gjennomsnittet av tre målinger, og de Feilstolpene representerer standardavvik for gjennomsnittet. *
P
. 0,05 sammenlignet med tilsvarende negativ kontroll
(A, B) Transwell migrasjon analyser av HT-29 og SW480 celler ble utført etter transfeksjon med speil 210 ligner (A) eller hemmer (B). (C, D) Transwell invasjonsanalyser av HT-29 og SW480 celler ble utført etter transfeksjon med Mir-210 etterligner (C) eller inhibitor (D). I alle paneler, resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. NC, negativ kontroll.
Fordi vi demonstrert MIR-210 kan øke migrasjon og invasjon potensialet i CRC celler, hypotese vi at MIR-210 kan også megle hypoksi-indusert migrasjon og invasjon av CRC celler . For å bekrefte denne hypotesen, utførte vi Transwell-analyser for å undersøke migrering og invasjon potensialet av CRC cellene under hypoksiske betingelser og funnet at migrering og invasjon evnen til disse CRC-celler ble signifikant økt sammenlignet med celler under normoksisk betingelser. Dessuten, transfeksjon med MIR-210-inhibitor dramatisk redusert migrering og invasjon evne til hypoksiske CRC-celler, mens transfeksjon med MIR-210 etterligner ytterligere forbedret migrering og invasjon evne til av CRC-celler (Fig. 5). De ovenfor angitte resultater viser at MIR-210 spiller en viktig rolle i den hypoksi-indusert migrering og invasjon av CRC-celler.
(A, B) Transwell migrering og invasjon analyser av HT-29 og SW480-celler ble utført etter transfeksjon med Mir-210 etterligner eller negativ kontroll (NC) under normoksisk eller hypoksiske forhold. (C, D) Transwell migrering og invasjon analyser av HT-29 og SW480-celler ble utført etter transfeksjon med MIR-210-inhibitor eller den negative kontroll i henhold til normoksisk eller hypoksiske betingelser. I alle paneler, resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
VMP1 er et direkte mål på MIR-210
TargetScan identifiserer at 3′-UTR av VMP1 inneholder spådd bindingssetet for MIR-210 (fig. 6A). Luciferase aktivitetsanalyse viste at MIR-210 hemmet luciferaseaktiviteten av WT 3′-UTR i betydelig grad, men ikke den Mut 3′-UTR av VMP1 i HEK293T celler (Fig. 6B). Videre overekspresjon av MIR-210 signifikant hemmet VMP1 mRNA og proteinnivåer i HT-29 og SW480 celler (Fig. 6C, 6D) og VMP1 nivå ble omvendt korrelerte med Mir-210 uttrykk i grunnskolen CRC vev (r = -0,318,
P
0,01; fig. 6E). Disse dataene antyder sterkt at MIR-210 regulerer VMP1 uttrykk negativt ved direkte rettet mot sine 3′-UTR sekvenser.
(A) den antatte MIR-210 bindende sekvenser i VMP1 3′-UTR. (B) Luciferase aktivitetsanalyse ble utført for HEK293T celler transfektert med pmiR-rapport vektorer som inneholder WT-VMP1 3′-UTR eller MUT-VMP1 3′-UTR sekvenser og Mir-210 etterligner. Data er presentert som normalisert ganger endring i luciferase-aktivitet. (C, D) VMP1 mRNA og protein ble bestemt i HT-29-celler og SW480-celler transfektert med MIR-210 etterligner eller MIR-negative kontroll av henholdsvis QRT-PCR og Western blot,. (E) Inverse sammenheng mellom Mir-210 uttrykk og VMP1 mRNA nivåer i CRC vev ble analysert ved hjelp av Pearsons korrelasjonsanalyse.
Overuttrykte VMP1 delvis reverserer migrasjon og invasjon av CRC celler indusert av MIR-210
for å avgjøre om VMP1 er involvert i MIR-210 indusert metastaser fra CRC celler, utførte vi rednings analyser. Som vist i figur 7, kan MIR-210 etterligner forsterke metastatisk evne til CRC-celler og redusert metastatisk potensiale ble observert i VMP1-overuttrykkende celler sammenlignet med kontrollceller. Videre kan samtidig overekspresjon av MIR-210 og VMP1 delvis oppheve MIR-210-indusert metastatisk potensial i CRC celler. Disse resultatene viser at MIR-210 kan fremme CRC celle migrasjon og invasjon ved å målrette VMP1.
(A, B) Transwell migrasjon og invasjon ble utført i VMP1-overekspresjon HT-29 celler transfektert med Mir-210 etterligner eller negativ kontroll. (C, D) Transwell migrasjon og invasjon ble utført i VMP1-overekspresjon SW480 celler transfektert med Mir-210 etterligner eller negativ kontroll. I alle paneler, resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
Hypoksi er en utbredt karakteristisk trekk ved de fleste solide svulster, og den robuste hypoksi-indusert miRNA, MIR-210 er i dag ansett som «master miRNA» av hypoksi respons [15]. Det er derfor viktig å undersøke mulighetene roller MIR-210 i solid tumorprogresjon, da dette miRNA har vist seg å spille en nøkkelrolle i utviklingen av kreft etter hypoksiske forhold [21], [30]. Våre resultater gir det første bevis på at Mir-210 er overuttrykt i CRC vev og fungerer som en viktig faktor i utviklingen av CRC.
Den feilregulert uttrykk for MIR-210 er uomtvistelig demonstrert i ulike menneskelige kreftformer. Cai et al. viste at MIR-210 uttrykk var betydelig høyere hos pediatriske osteosarkom pasienter og var signifikant assosiert med aggressive clinicopathological funksjoner og en dårlig prognose [31]. Men Tsuchiya [32] rapporterte at Mir-210 uttrykk ble markert nedregulert i pasienter med dårlig differensiert esophageal plateepitelkarsinom. I motsetning til dette, Greither et al. [33] rapporterte at det var ingen statistisk signifikante sammenhenger mellom Mir-210 uttrykk og aggressive clinicopathological funksjoner i Bløtvevskreft. Disse uharmoniske funnene kan forklares med de ulike rollene som MIR-210 kan spille i patogenesen av ulike kreftformer. Her, vi har oppdaget en markant oppregulering av Mir-210 uttrykk i CRC vev, og MIR-210 overekspresjon var signifikant korrelert med aggressive clinicopathological funksjoner, for eksempel en stor svulst størrelse, positiv regional lymfeknutemetastase, lokal tumorinvasjon, og en avansert klinisk scene. Vi fant også at MIR-210 nivå var positivt korrelert med HIF1α uttrykk som var relatert til metastasering og ugunstig prognose av CRC [12], [13]. Disse funnene indikerer at MIR-210 kan spille en viktig rolle i utviklingen av den progressive fenotype av CRC.
Når det gjelder overlevelse, ble univariate og multivariate analyser utført for å undersøke mulighetene prognostisk verdi av MIR-210 i CRC . Resultatene av univariate analysen viste at pasienter med høyere MIR-210 nivåer hadde en dårligere prognose enn de med lavere MIR-210-nivå. Videre er resultatene av den multivariate analysen av Cox regresjonsmodellen viste at MIR-210 var et uavhengig prognostisk faktor for pasientene, og overlevelse etter kirurgi. Disse resultatene er i samsvar med de rapporterte ved Camps et al studier. i brystkreft [34] og Gee et al. i hode og nakke kreft [35]. Sammen med våre resultater, disse funnene tyder på at Mir-210 kan være en lovende prognostisk markør for å identifisere pasienter med dårlig prognose.
Den funksjonelle utforskning av MIR-210 indikerte at MIR-210 spiller nøkkelroller i mange cellulære prosesser involvert i fysiologiske og ondartede forhold. MiR-210 kan være involvert i erythropoiesis og kan også fremme adipogenesen [36], [37]. Som den mest konsekvent og robust oppregulert miRNA henhold hypoksiske betingelser, regulerer MIR-210 mange aspekter av hypoksi veier, slik som den angiogene responsen av endotelceller til hypoksi [38]. Konsistente resultater har vist at opp-regulert ekspresjon av MIR-210 er involvert i den hypoksi /VEGF-signalreaksjonsveien i brystkreft [34]. I epitelial eggstokkreft, men MIR-210 blir ofte slettet og kan hemme cellecyklusprogresjonen [27].
I denne studien fant vi at overekspresjon av MIR-210 markert fremmet migrasjon og invasjon av CRC celler. Våre data antyder at MIR-210 fungerer som en onkogene miRNA i human kolorektal kreft for å fremme metastaser, som er konsistent med funnene i tidligere studier [21] – [23]. Vi har også bekreftet tidligere funn som viser at MIR-210 var oppregulert i CRC-cellene i respons til hypoksi og at MIR-210 ble indusert på en tidsavhengig måte. Disse resultatene indikerer at MIR-210 er også en hypoksisk markør i CRC pasienter, slik det er i andre kreftformer, slik som hode- og nakkekreft [35]. Videre fant vi at MIR-210 mediert hypoksi-indusert migrasjon og invasjon av CRC celler. Derfor, i tillegg til sine roller i tilpasning av kreftceller til lav oksygen stress og som en markør for svulst hypoksi, foreslår vi at forhøyede nivåer av MIR-210 kan ha biologiske funksjoner knyttet til kreft og metastasering av svulster, en mulig forklaring hvorfor MIR-210 er assosiert med en dårlig prognose i kreftpasienter. Videre undersøkelser viste at VMP1 var den funksjonelle nedstrøms målet på MIR-210 i CRC. VMP1 er et transmembranprotein lokalisert til intracellulære vakuoler som opprinnelig ble beskrevet som et protein forbundet med akutt pankreatitt [39].
