Abstract
I nyrene vitamin D omdannes til sin aktive form. Siden vitamin D utøver sin virksomhet gjennom binding til atom vitamin D reseptor (
VDR
), har de fleste genetiske studier primært fokusert på variasjon innenfor dette genet. Derfor kan analyse av genetisk variasjon i
VDR Hotell og andre vitamin D-pathway gener gi innsikt i rollen som vitamin D i nyrecellekreft (RCC) etiologi. RCC tilfeller (N = 777) og kontroller (N = 1035) ble genotypet for å undersøke forholdet mellom RCC risiko og variasjon i åtte mål gener. Minimum-p-verdi permutasjon (Min-P) tester ble brukt for å identifisere gener som er forbundet med risiko. En tre enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) glidende vindu ble brukt til å identifisere kromosomale regioner med en False funnrate på 10%, der senere, haplotype relativ risiko ble beregnet i Haplostats. Min-P-verdiene viste at
VDR product: (p-verdi = 0,02) og retinoid-X-reseptor-alpha (
RXRA
) (p-verdi = 0,10) var assosiert med RCC risiko. Innenfor
VDR
, tre haplotyper over to kromosomale regioner av interesse ble identifisert. Den første regionen, som ligger innenfor intron 2, inneholdt to haplotyper som økte RCC risiko med ca 25%. Den andre regionen inkludert en haplotype (rs2239179, rs12717991) over intron 4 at økt risiko blant deltakerne med
TC plakater (OR = 1,31, 95% CI = 1,09 til 1,57) haplotype i forhold til deltakere med felles haplotype,
TT
. Across
RXRA
, en haplotype som ligger 3 «av den kodende sekvensen (rs748964, rs3118523), økt RCC risiko 35% blant personer med varianten haplotype forhold til de med de mest vanlige haplotype. Denne studien grundig evaluert genetisk variasjon over åtte vitamin D pathway gener i forhold til RCC risiko. Vi fant økt risiko forbundet med
VDR Hotell og
RXRA
. Replication studier er garantert å bekrefte disse funnene
Citation. Karami S, Brennan P, Rosenberg PS, Navratilova M, Mates D, Zaridze D, et al. (2009) Analyse av SNPs og haplotyper på vitamin D Pathway Gener og nyre kreftrisiko. PLoS ONE 4 (9): e7013. doi: 10,1371 /journal.pone.0007013
Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, USA
mottatt: May 11, 2009; Godkjent: 14 juli 2009; Publisert: 15.09.2009
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av egenutført Research Program av det amerikanske National Institutes of Health, National Cancer Institute, Seksjon for Cancer Epidemiology og genetikk. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i nyrene, er vitamin D metaboliseres til 1,25-dihydroksykalsiferol (1,25 (OH)
2D
3), den aktive formen av vitamin D [1]. Den anti-kreftfremkallende egenskaper av vitamin D er hemning av klonal tumor celleproliferasjon, induksjon av immuncelledifferensiering og apoptose, og redusert angiogenese [2], [3]. Vitamin D-aktivitet er mediert gjennom bindingen av 1,25 (OH)
2D
3 til vitamin D-reseptoren (
VDR
), som kan regulere transkripsjon av andre gener som er involvert i celleregulering, vekst og immunitet [3] – [6].
VDR
modulerer uttrykket av gener ved å danne en heterodimer kompleks med retinoid-X-reseptorer (
RXR
) [7]. Dette
VDR-RXR
komplekset er rettet på vitamin D-responselementet (
VDRE
) i promoterregionen av flere 1,25 (OH)
2D
3-regulerte gener å initiere transkripsjon [7], [8].
Siden 1,25 (OH)
2D
3 utøver sin virksomhet gjennom atom
VDR
, de fleste studier av genetisk mottakelighet til vitamin D relaterte sykdommer har undersøkt variasjon innen
VDR
gen [4], [7], [9] – [11]. Men konserten av gener som samhandler med
VDR
er stort; derfor en analyse av variasjon i
VDR Hotell og andre gener i vitamin D sti kan gi innsikt i rollen som vitamin D i nyrecellekreft (RCC) etiologi. Gitt betydningen av vitamin D metabolismen i nyrene og mangel på studier som har vurdert forholdet mellom vitamin D,
VDR
genet, og RCC, vi tidligere evaluert hvordan tre felles
VDR
gen polymorfismer (
BsmI
,
Foki
,
TaqI
) endret RCC risiko [12]. Vi observerte reduserte RCC risiko blant eldre personer og blant pasienter med en familiehistorie med kreft som var bærere av
f
alleler i
Foki
enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) sammenlignet med pasienter med
FF
genotype [12]. Men gitt den begrensede genomisk dekning av
VDR
i vår forrige kandidat SNP etterforskning, og de mange gener som kommuniserer direkte med
VDR
i vitamin D vei, utvidet vi på disse funnene for å undersøke variasjon i kandidatgener som kan samhandle direkte med
VDR
å endre RCC risiko og forbedret vår analyse ved å øke regional dekning av variasjon på tvers av hvert gen til 80-90%.
Derfor, for å avgjøre om variasjon i vitamin D-pathway gener endret RCC risiko, vi grundig undersøkt forholdet mellom nedsatt risiko for kreft og 139 merking SNPs over åtte mål gener (
VDR, RXRA, RXRB, CYP24A1, GC, STAT1, THRAP4, etter og
TRAP5
) av vitamin D veien mellom saker og kontroller fra Sentral-Europa, et område med en av de høyeste tallene for RCC hele verden [13]. Så vidt vi vet, representerer dette en av de største og mest detaljerte undersøkelser av genetisk variasjon innen vitamin D sti og RCC risiko gjennomført hittil.
Resultater
En beskrivelse av deltagerne og kjent RCC risikofaktorer er gitt i Tabell 1. Alle deltakerne og bare genotypet deltagere viste en lignende fordeling av egenskaper, med unntak av kjønn. Saker og kontroller var sammenlignbare i alder, men tilfellene var mer sannsynlig å ha overkant body mass index (BMI) ( 30 kg /m
2) og høyt blodtrykk, og å ha en første grad slektning med kreft. Foreningen med røyking var ikke lenger observert etter justering for alder, BMI, høyt blodtrykk, studiesenter, og sex [14].
Tabell 2 viser resultater for global gen-baserte tester av foreningen med case /kontroll status med et minimum av p-verdi permutasjon (Min-P) test.
VDR product: (p-verdi = 0,02) og
RXR-alfa (RXRA) product: (p-verdi = 0,10) gener ble sterkest assosiert med RCC risiko. Både minimum p-verdi for alle tagging SNPs innenfor genet og minimum falsk oppdage rate (FDR) justerte p-verdier for de tre SNP haplowalk glidende vindu for
VDR Hotell og
RXRA
var signifikant forbundet med RCC risiko.
Deretter ble HaploWalk baserte metoder som brukes til å identifisere regioner av interesse i hvert gen som forble signifikant ved en FDR på mindre enn 10%. Tre betydelig
VDR
haplotyper (Tabell 3) ble identifisert i to regioner som var assosiert med økt RCC risiko. Den første regionen (figur 1), som ligger innenfor intron 2, viste forsøkspersoner med
AGC plakater (OR = 1,29; 95% CI = 1,10 til 1,52, p-verdi = 0,002) eller
GAC
(OR = 1,25; 95% CI = 1,04 til 1,51, p-verdi = 0,02) haplotype var på en betydelig økt risiko sammenlignet med pasienter med de vanligste referent haplotype,
GAT
. Økt risiko syntes å være drevet av
T
til
C
endring på tredje loci. Den andre regionen (figur 1), sentrert rundt intron 4, økte også RCC risiko blant deltakerne
TC plakater (OR = 1,31, 95% CI = 1,09 til 1,57, p-verdi = 0,004) haplotype i forhold til deltakerne vanligste referent haplotype,
TT
. R justerte globale p-verdier for begge disse regionene var 0.04 (tabell 3). Across the
RXRA
genet (figur 2), en enkelt region som ligger nedstrøms, 3 «av den kodende sekvensen, ble vist å være assosiert med økt RCC risikoen blant personer med
CG plakater (OR = 1,35; 95% CI = 1,11 til 1,66, p-verdi = 0,003) haplotype sammenlignet med personer med den vanligste haplotype,
GA
. R justert global p-verdi for denne regionen var 0,03
Top:. HaploWalk analyse identifisert to kromosomale regioner av interesse i vitamin D reseptor (VDR) gen som var betydelig på en FDR på 10%. Region man følger SNPs 3′- rs4760648, rs2853564, rs2254210 -5 «; region to medfølgende SNPs 3»- rs12717991, rs2239179 -5 «. Bunn: Haploview analyse også identifisert to haplotype blokker innenfor de samme kromosomale regioner av interesse
Top:. HaploWalk analyse identifisert en enkelt kromosom region av interesse i retinoid-X-reseptor-alpha (RXRA) genet det var signifikant ved en FDR på 10%. Denne regionen inkludert SNPs 5’rs748964, rs3118523 -3 «. Bunn: Haploview analyse også identifisert en haplotype blokk innenfor samme kromosom regionen av interesse
Resultatene for de enkelte analyser av disse SNPs er gitt i Supplemental tabell S1.. Tretten SNPs i fem vitamin D pathway genene var signifikant assosiert med RCC risiko ved bruk av en additiv modell (antall betydelige tag SNPs):
VDR product: (5),
RXRA product: (5),
CYP24A1 product: (1),
GC product: (1), og
STAT1 product: (1). Ingen statistisk signifikante interaksjoner mellom disse SNPs og potensielle confounders (dvs. BMI, alder, kjønn, røykestatus, høyt blodtrykk, og en familiehistorie med kreft) ble påvist (data ikke vist). Det ble ikke observert forskjell i samarbeid mellom enkelt SNPs og RCC risiko når analysene ble begrenset til RCC tilfeller histologisk diagnostisert med klarcellet subtype (data ikke vist) og heller ikke når analysene ble begrenset til tilfeller med bare høye karakterer svulster (data ikke vist).
Diskusjoner
i denne analysen av 139 tagging SNPs over åtte vitamin D pathway gener, identifiserte vi tre regioner i løpet av to gener som var signifikant assosiert med RCC risiko. Både gener,
VDR Hotell og
RXRA
, som vi hypotese
a priori
ville være forbundet med risiko, som finnes regioner med signifikante sammenhenger. Across the
VDR
genet, tre haplotyper innen to regioner (intron 2 og intron 4) var signifikant assosiert med økt risiko. Across the
RXRA
genet, RCC risikoen var høyere blant de med en spesiell haplotype beliggende 3 «av koderegionen.
Bare en håndfull studier har omfattende analysert genetisk variasjon i
VDR
-genet i forhold til kreft [15], [16], [17]. En case-control studie av 630 hendelsen prostatakreftpasienter ble gjennomført omfattende analysere genetisk variasjon i
VDR
genet; tjueto SNPs ble genotypet for å fange en høy andel av variasjonen i
VDR
genet [17]. En to-fold økning i prostatakreft risiko ble observert for to
VDR
loci (rs2107301 og rs2238135), som ble plassert i introner 2 og 4, henholdsvis [17]. Selv om informasjonen er begrenset når det gjelder sammenhengen mellom
VDR
varianter og RCC risiko, genetisk mottakelighet studier for felles
VDR
polymorfismer, for eksempel
BsmI
,
Foki
,
Taql, og Apal
, har vist seg å modifisere RCC risiko [15], [16]. En fersk case-control studie av 135 RCC pasienter fant at deltakere med
AA
genotype på
Apal
området hadde en betydelig økning i RCC risiko (OR = 2.59, p-verdi = 0,01 ); tilfeller med
AA
genotype også ble funnet å ha lavere overlevelse (relativ risiko = 3.3, p-verdi = 0,04) sammenlignet med tilfeller med
Aa
eller
aa
genotyper [16]. Det ble også rapportert om en to-fold økning i kreftrisiko blant deltakerne
TT
genotype på
TaqI
nettstedet i en andre case-control studie av 102 RCC pasienter sammenlignet med personer med
Tt
eller
tt
genotype (p-verdi = 0,001) [15].
på samme måte noen tidligere studier av RCC risiko og variasjon på tvers av vitamin D pathway gener har blitt gjennomført . Et lite antall polymorfismer i
VDR
genet, som for eksempel
poly (A)
,
TaqI
, og
BsmI
, har vært spekulert i resultere i variant av
VDR
uttrykk og er antatt å senere resultere i endringer i sirkulerende nivåer av aktivt vitamin D [15], [18], [19]. Altered
VDR
protein uttrykk har blitt rapportert i en rekke krefttyper, inkludert bryst, maligne gliomer, prostata og tykktarm kreft [20]. Dessuten har tidligere epidemiologiske studier har rapportert at økt binding av vitamin D til
VDR
er assosiert med redusert RCC risiko, og at aktive nivåer av vitamin D
3 i serum er betydelig lavere i RCC pasienter sammenlignet med befolkningen kontroller [15], [16], [19]. Sammen disse resultatene tyder på at vitamin D-nivåer påvirker RCC risiko. Mens resultatene har vært blandet om sammenhenger mellom varianter i
RXR
genet og kreftrisiko [21] – [24],
in vitro
dyre- og humane studier har vist at forhøyede nivåer av
RXRA
øker antiproliferative virkningene av 1,25 (OH)
2D
3 [25], [26].
In vitro Kjøpe og dyrestudier tyder at vitamin D og dets metabolitter kan hemme carcinogenese ved å stimulere celledifferensiering, inhibering av celleproliferasjon typisk kjennetegnet ved G0 /G1 cellesyklus-stans, apoptose, og undertrykkelse av invassion, angiogenese, metastase og [3] – [6]. I laboratorieforsøk har 1,25 hydroksyvitamin D blitt vist å signifikant redusere tumorvekst i en rekke kreftformer, inkludert tykktarm, bryst, prostata og lunge [18]. Bruken av vitamin D eller dets analoger som chemopreventive midler hos mennesker, selv om begrenset, har vist gunstige effekter. I en klinisk studie for pasienter med inoperable avansert leverkreft en daglig dose på 10 mg Seocalcitol (en vitamin D analog) i inntil ett år resulterte i en reduksjon i tumor dimensjon [27]. I tillegg er blant 37 pasienter med metastatisk androgen-uavhengig prostatacancer, som ble behandlet med en høy dose behandling av oral kalsitriol /docetaxel (aktiv form av vitamin D /mitotisk inhibitor), prostata-spesifikt antigen reduksjon på minst 50% ble observert [ ,,,0],28].
Selv om omfanget av sammenhengen mellom RCC risiko og
VDR Hotell og
RXRA
genvarianter i vår studie kan være små, noen av disse variantene er relativt vanlig i befolkningen og derfor kan være forbundet med en mye høyere risiko henføres som helhet sammenlignet med sjeldne høy penetrans gener. Videre
VDR
varianter assosiert med RCC risiko i denne studien var intronic og var ikke i nærheten av intron-exon grenser som kan produsere spleise feil. Disse alleler ser ut til å ha noen effekt på uttrykket nivåer eller aktivitet av oversatte
VDR
protein, og det er en hypotese at de er korrelert med andre varianter med funksjonell relevans. Synonymt SNPs blir ofte ignorert i mange genetisk mottakelighet studier basert på antagelsen om at de ikke endrer aminosyresekvens, som senere vil påvirke proteinstruktur og funksjon, og heller protein uttrykk [29]. Likevel er listen over synonymt mutasjoner assosiert med menneskelige sykdommer vokser [29], [30]. Nyere genetiske studier har vist at synonyme mutasjoner er ikke tilfeldig, og kan spille en betydelig rolle i etiologien sykdom siden synonyme SNP’er kan påvirke protein ekspresjon og funksjon ved å endre mRNA-stabilitet [29], [31], [32]. Studier utelukkende fokus på genetiske variasjoner innenfor exonic regioner av DNA som fører til endringer i protein sekvens kan være enkle og kan ikke representere det større bildet som utvikler seg mellom genetisk variasjon og sykdom [33].
I tillegg til å være en av de første genetisk mottakelighet studier omfattende undersøke sammenhengen mellom
VDR Hotell og sju andre vitamin D pathway gener i forhold til RCC risiko, inkluderer en ekstra styrke vår studie bruk av HapMap data til å merke gener av interesse ved hjelp av høy (80-90%) genomisk dekning av tagging genomiske regioner, både oppstrøms (20 kb) og nedstrøms (10 kb) for å redusere sjansen for falske negative funn. I denne studien har vi også observert høy deltakelse, brukt nydiagnostiserte tilfeller inkluderte bare histologisk bekreftet kreft, og samlet inn biologiske materiale fra en høy andel individer. Den store prøven størrelse med denne studien gitt tilstrekkelig statistisk styrke til å påvise relativt små assosiasjoner mellom genotyper og risiko. Analyse av gener med betydelige globale p-verdier redusert risiko for type I feil i vår studie, mens bruk av to forskjellige haplotype-baserte metoder (HaploWalk og HaploStats) redusert muligheten for å finne betydelige resultater basert på sjanse. Videre, mens sykehusbaserte case-control studier har potensielle begrensninger på grunn av mangel på befolkningskontroll, kan disse studiene forbedre responsrater for intens innsamling av biologiske prøver og dermed redusere sjansene for skjevhet i vurderingen av gen-miljø interaksjoner [ ,,,0],34]. Til slutt, vi ikke ansette en direkte markør for vitamin D blant disse forsøkspersonene. Mens det er generell enighet om at serum 25 (OH) D-nivå er den beste indikatoren på aktuell vitamin D-status, har biokjemisk markør en kort halveringstid, og vil ikke nødvendigvis reflektere langsiktig vitamin D-status, spesielt for case-kontrollstudier hvor sakene har nylig blitt diagnostisert [35].
i konklusjonen, vår
a priori
hypotesen ble støttet og vi observert at genetiske variasjoner i
VDR Hotell og
RXRA
var signifikant assosiert med RCC risiko. Men siden våre resultater er observert innenfor introner i stedet eksoner og fordi vi er bare begynnelsen for å forstå rollen av genetisk variasjon i intronic regioner og deres effekt på sykdomsutvikling, er flere studier av genetiske varianter av disse to genene og RCC risiko garantert.
Materialer og metoder
forsøkspersonene
Detaljer om Sentral- og Øst-Europa nyrecellekarsinom (CEERCC) studie har tidligere blitt rapportert [36]. Kort fortalt er det CEERCC studien en sykehusbasert case-control studie av nyrecellekreft gjennomført mellom 1999 og 2003 i sju sentre i fire sentral- og østeuropeiske land (Moskva, Russland, Bucuresti, Romania, Lodz, Polen, og Praha, Olomouc , Ceske-Budejovice, og Brno, Tsjekkia). Hvert senter fulgt en identisk protokoll og var ansvarlig for å rekruttere en sammenhengende gruppe nydiagnostiserte tilfeller av nyrekreft, samt en tilsvarende gruppe av sykehus kontroller. Kontroller i alle sentrene ble valgt blant pasientene innlagt som inn- eller ut-pasienter i samme sykehus som tilfellene, med vilkår som ikke er relatert til tobakk eller urin lidelser. Ingen enkelt sykdom består mer enn 20% av kontrollgruppen. Alle fag var innbyggerne i studieområdene i minst ett år på tidspunktet for rekruttering og var av kaukasisk avstamming.
Cases mellom 20 og 79 år ble konstatert gjennom en rivende rapporteringssystem. Deltakende lege og andre profesjonelle medarbeidere besøker urologi, kirurgi, radiologi, eller patologi avdelinger av deltagende sykehus regelmessig identifisert pasienter innlagt for nyrekreft work-up. Alle pasienter med mistanke om nyrekreft ble kontaktet for intervju, men bare histologisk bekreftede tilfeller ble inkludert i den endelige analysen. Alle svulster var sentralt anmeldt for å bekrefte diagnosen og histologi. Flertallet av nyresvulster var klare cellekreft (83,4%), mens andre undertyper inkludert papillær (7%), chromophobe (2,4%), oncocytoma (2,3%), oncocytic svulster (0,2%), overgangscellekreft (1,1%) og Uklassifisert (3,6%). Kontrollene ble frekvens-tilpasset tilfeller på alder (± 3 år), kjønn og studiested. Totalt 1,097 bekreftet hendelsen RCC tilfeller og 1476 kontroller ble inkludert i denne studien. Genomisk DNA ble fremstilt fra 987 av 1097 (90%) av tilfellene og 1298 av 1476 (88%) av kontrollene. Responsratene over studiesentre blant kvalifiserte personer som ble bedt om å deltar, varierte 90,0 til 98,6% for saker og 90,3 til 96,1% for kontroller.
Intervju
Vesker og kontroller ble intervjuet med samme spørreskjema [37]. Informasjon om demografiske karakteristika, medisinsk historie, og livsstilsfaktorer ble innhentet gjennom i-person intervjuer av opplært personell som benytter standardiserte livsstil og mat frekvens spørreskjema. Tilfeller ble intervjuet innen tre måneder etter diagnose. Skriftlig samtykke til deltakelse ble innhentet fra alle forsøkspersonene, og etisk godkjenning ble innhentet for alle studiesteder.
laboratorieprosedyrer
Genomisk DNA ble ekstrahert fra fullblod buffycoat ved hjelp av en standard fenol kloroform metode . Genotyping ble utført med en GoldenGate® Oligo Pool Alle (OPA) analyse av Illumina® (www.illumina.com) ved National Cancer Institute (NCI er) Kjerne genotyping Facility (CGF) hvor lab ansatte var blindet for saker /kontroll status. Passende mengde og kvalitet av genomisk DNA ble innhentet fra en undergruppe av 777 (70,8%) RCC tilfeller og 1,035 (70,1%) kontroller, på grunn av strenge kvalitet og kvantitet kriterier for analyse ved hjelp av Illumina® OPA panel.
En litteraturgjennomgang av vitamin D i forbindelse genene bidro til å identifisere åtte kandidatgener (
VDR, RXRA, RXRB, CYP24A1, GC, STAT1, THRAP4 Hotell og
THRAP5
) som til slutt ble valgt for deres engasjement i vitamin D metabolismen, transport, binding, funksjon og /eller uttrykk, som kan påvirke mekanismene gjennom hvilke vitamin D kan påvirke kreftrisiko. Siden det er velkjent at
VDR
frembringer et transkripsjons-reaksjon ved å danne en heterodimer sammensatt med retinoid-X-reseptor, i denne studien både
VDR
og
RXR
var de viktigste genene mistenkt
a priori
å endre nyrekreftrisiko. Gruppen bestemte komponenten
(GC)
vitamin D bindende protein ble valgt for sitt engasjement som den største transportør av vitamin D i plasma [38]. Cytokrom P450, familie 24, underfamilien A, polypeptid 1 (
CYP24A1
) ble valgt for sitt engasjement i nedverdigende og regulerings 1,25 (OH)
2D
3 nivåer [39], [40 ]. Til slutt, signal svinger og aktivator av transkripsjon 1 (
STAT1
) og skjoldbrusk hormon reseptor assosiert protein 4 og 5 (
THRAP4 Hotell og
THRAP5
) gener ble valgt siden studier tyder på at disse genene kan indusere eller undertrykke transkripsjon ved å samhandle med
VDR-RXR
kompleks [41], [42].
Tag SNPs ble valgt for å gi 80-90% genomisk dekning på tvers av de genomiske regioner av interesse. For å sikre grundig dekning av målrettede regionen, ekstra dekning av områder både oppstrøms (20 kb) etter start av transkripsjon og nedstrøms (10 kb) for den siste ekson bruker HapMap CEU data (https://www.hapmap.org) blant SNPs med mindre allelfrekvensene på minst 5% og en r
2≥80% ble valgt. I tillegg ble ikke-synonyme SNP’er eller de korrelert med polymorfismer med potensiell funksjonell betydning inkluderes i analysen. I alt ble 139 SNPs i åtte vitamin D-relaterte pathway målgener valgt for analyse. Den totale lengden på sekvensen analysert på tvers av alle genene var 495,664 baser (
VDR
: 37,421 baser,
RXRA
: 144,022 baser,
RXRB
: 36,257 baser,
CYP24A1 product:: 50,537 baser,
GC
: 72,479 baser,
STAT1
: 75,061 baser,
THRAP4
: 39,862 baser, og
THRAP5
: 40025 baser). Replikere kontrollprøver kvalitet (5% prøver) ble ispedd blant genotyping plater. Den genotyping strykprosent for de valgte SNPs var 4,8% (7/146). Den samstemmighet mellom dupliserte DNA-prøver varierte 93-100% og gjennomførings varierte 98-100%. Genotypefrekvensene blant kontrollene ikke avvike fra den forventede Hardy-Weinberg likevekt proporsjoner (p 0,05). Alle SNPs og analyseinformasjon er rapportert i NCI sin SNP500Cancer Database (https://snp500cancer.nci.nih.gov) [43].
Statistical Analysis
De distribusjoner av utvalgte egenskaper og kjent RCC risikofaktorer (kjønn, alder, røykevaner hypertensjon, BMI, familiehistorie med kreft, og bostedsland) ble sammenlignet mellom genotypet saker og kontroller ved hjelp av Chi-kvadrat test. Disse egenskapene ble videre undersøkt for å fastslå om sammenhenger mellom SNPs og RCC ble endret; men ble ikke observert noen signifikante interaksjoner mellom kreftrisiko, RCC risikofaktorer, og SNPs (data ikke vist).
De assosiasjoner mellom individuelle SNPs og RCC risiko ble beregnet ved å beregne odds ratio (ORS) og 95% konfidensintervall intervaller (95% KI) ved hjelp ubetinget logistisk regresjon. Interaksjoner ble testet sammenligne regresjonsmodeller med og uten interaksjon vilkår ved hjelp av en likelihood ratio test (LRT). Alle regresjonsmodeller ble justert for alder (kontinuerlig), sex, studiesenter, og røyking vane (noensinne, aldri). Andre risikofaktorer (det vil si hypertensjon, BMI, og familiehistorie med kreft) ble også vurdert, men disse variablene ikke påvirke risiko anslag med minst 10%. For å unngå unødig analyser, bare en SNP ble evaluert da ble det observert en høy korrelasjon mellom to SNPs (r
2 0,85). Av de 139 SNPs genotypet, to par SNPs i
VDR
genet ble funnet å være sterkt korrelert (r
2 = 0,95 for rs1544410 (
BsmI
) og rs731236 (
TaqI
); r
2 = 0,89 for rs2248098 og rs2239185) og derfor bare en SNP ble brukt per par (rs1544410 (
BsmI
) og rs2248098)
Siden. den vanligste formen for nyrecellekreft er klart celletype, assosiasjoner mellom individuelle SNPs og RCC risiko ble også evaluert blant tilfeller histologisk diagnostisert med denne subtype av nyrekreft. Imidlertid begrenser saker til de med klare celletype påvirker ikke risiko anslag med minst 10% (data ikke vist). Tilsvarende analyser begrenset til tilfeller med bare høye karakterer svulster påvirket ikke risikoestimater (data ikke vist).
Risiko estimatene ble beregnet for heterozygot og homozygot variant genotyper i forhold til den vanlige homozygot genotype forutsatt en additiv modell. Når frekvensen av den homozygote varianten allelet var mindre enn 5% mellom kontroller, ble en dominant modell anvendes for å bestemme risiko anslag for nærvær og fravær av varianten allelet. Assosiasjoner mellom SNP varianter og RCC ble vurdert ved hjelp av en additiv modell (dvs. lineær test av trend for antall eksemplarer av varianten allelet (0, 1, 2)) eller en dominerende modellen (dvs. Wald chi-kvadrat test for tilstedeværelse eller fravær av varianten allelet (0, 1)). For å vurdere globale betydningen av samarbeid med gener, et minimum p-verdi permutasjon (Min-P) test ble benyttet for analyse fordi den korrigerer for flere tester samtidig regnskap for sammenhenger mellom SNPs innen et gen [44]. Gener som hadde en betydelig Min-P test på en cut-off-nivået på 10% ble valgt ut for videre analyse. Analyse for gener som ikke oppfyller dette kriteriet er tilgjengelig i Supplemental Figur S1, S2, S3, S4, S5, S6.
HaploWalk, en haplotype basert glidende vindu analytisk metode, ble brukt til å evaluere kandidat gener med N =
K
SNPs. Den HaploWalk prosedyre anses som en tre SNP vindu for hvert SNP fra SNP
2
gjennom SNP
K-1
. For hvert vindu, ble haplotype frekvenser i saker og kontroller rekonstruert ved hjelp av EM-algoritmen [45], og en Wald test ble brukt til å screene for tilknytning til case-control status [44]. I den innledende screening fase, ble ingen justering gjort for potensielle confounders. Wald test anvendes en terskelverdi på 5%, slik at haplotyper i tilfeller og kontroller som hadde en antatt frekvens under grenseverdien i kontrollene ble slått sammen til en «andre» sjeldne haplotype kategori for testing. For å ta høyde for flere tester på tvers av
K
SNPs,
K-2
p-verdier (ett for hvert vindu) ble justert for multiple sammenligninger ved hjelp av falske Discovery Rate (FDR) -controlling prosedyren for Benjamini og Hochberg [46]. Haplotype vinduer med en FDR justert verdi. 10% ble forfremmet til den andre fasen
I fase to, ble haplotype blokker identifisert med HaploWalk analysert i forhold til RCC risiko ved bruk Haplostats (R versjon 2.4.0 ; https://www.r-project.org) [47], justert for alder, kjønn, studiesenter, og røyking vane. I tillegg brukte vi standardmetoder for å identifisere haplotyper bruker Haploview programversjon 3.32 [48]. Koblingsulikevekt mellom markører ble vurdert ved å beregne parvise Lewontin s D «og r
2 bruker Haploview blant befolkningskontroll [48]. Heterogenitet genotypefrekvensene mellom landene ble evaluert ved hjelp av likelihood ratio test for å sammenligne tilpasning av modeller med og uten interaksjon vilkår, men vi fant ikke bevis for heterogenitet på tvers av populasjoner. Ingen bevis for befolkningen stratifisering var tydelig fra en rektor komponenter analyse av et genom bredt forening studie utført i denne pasientgruppen [49], og sannsynligheten for dette er liten blant europeiske befolkninger [50]. Assosiasjoner mellom vanlige haplotyper ( 5% frekvens) og RCC risikoen ble vurdert ved å beregne ORS og 95% CI’er bruker den vanligste haplotype kategori for sammenligning. Alle analyser ble utført i STATA 9.0 mindre annet er spesifisert (STATA Corporation, College Station, TX).
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
SNP-baserte analyse viktigste effektene for vitamin D pathway gener
Doi: 10,1371 /journal.pone.0007013.s001 plakater (1,73 MB DOC)
Figur S1.
RXRB HaploWalk og Haploview analyse. Top: HaploWalk analyse identifiserte ingen kromosomale regioner av interesse i retinoid-X-reseptor-beta (RXRB) gen som var betydelig på en FDR på 10%. Min-P test for dette genet var ikke statistisk signifikant (p-verdi = 0,20). Bunn: Haploview analyse identifisert to haplotype blokker; ingen ble assosiert med RCC risiko når analysert i Haplostats
doi:. 10,1371 /journal.pone.0007013.s002 plakater (0,24 MB TIF)
Figur S2.
CYP24A1 HaploWalk og Haploview analyse. Top: HaploWalk analyse identifiserte ingen kromosomale regioner av interesse i cytokrom P450, familie 24, underfamilien A, polypeptid 1 (CYP24A1) genet som var betydelig på en FDR på 10%.
