Abstract
ovarialcancer er en av de stadig hendelsen maligniteter som er beryktet på grunn av sin evasiveness for tidlig diagnose og høy dødelighet. Epiteliale eggstokk-kreft er svært avhengig av patologisk blodkar og vaskulær endotel vekstfaktor er kjent for å være en av de mest effektive angiogene faktorer. Polymorfismer av VEGF genet, i denne studien, ble vurdert for forbindelse med malignitet og andre klinisk-patologiske forhold. 300 case prøver og 320 alders- og mensus status matchet kontroller ble innprentet i studien. rs699947, rs833061, rs1570360, rs2010963, rs1413711 og rs3025039 var de seks enkeltnukleotidpolymorfi som ble gransket. Genotyping ble utført av polymerase chain reaction og rflp. rs 3025039 viste enorme løftet som en markør for sykdommen aggresjon og tilbakefall og en faktor for dårlig prognose. rs699947 viste minst sammenheng med sykdommen og klinisk-patologisk faktorer undersøkt. rs833061, rs 1570360 viste signifikant sammenheng med noen klinisk-patologiske faktorer som bilateral mishandlet eggstokkene og postoperative CA-125 nivåer. rs2010963 forbundet med tilstedeværelse av ascites i høyere volum. De SNPs under vurdering viste ingen formidabel kobling i studien prøver. En haplotype analyse (unntatt rs699947 og rs1413711) avslørte 5 Frontrunners å være tilstede i 85% av befolkningen med TGGC og CGCC assosiere vesentlig som beskyttende og risikofaktorer hhv. Disse haplotyper viste en doseavhengig additiv effekt av deres tilsynelatende funksjonalitet. Denne studien er unik og en første av sitt slag utført i den indiske befolkningen i Sør-øst Asia
Citation. Janardhan B, Vaderhobli S, Bhagat R, Chennagiri Srinivasamurthy P, Venketeshiah Reddihalli P, Gawari R, et al. (2015) Gransker virkningen av vaskulær endotelial vekstfaktor Polymorfisme i epitelovarialcancer Kreft: En studie i den indiske befolkningen. PLoS ONE 10 (7): e0131190. doi: 10,1371 /journal.pone.0131190
Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, TAIWAN
mottatt: 27 februar 2015; Godkjent: 30 mai 2015; Publisert: 09.07.2015
Copyright: © 2015 Janardhan et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den indiske rådet for medisinsk forskning, Ref No: 5/13/28/2010-NCD-III. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den ledende dødsårsaken fra gynekologiske kreftformer den femte vanligste årsaken til dødelighet hos kvinner i den kaukasiske rase. Overlevelse er direkte relatert til trinn med en 5 års overlevelse på 93% for de diagnostisert med lokalisert sykdom, men bare 31% for de med fjernt sykdom. Dessverre, to tredjedeler av pasientene stede med fjernt sykdom ved diagnosetidspunktet. I India har det vært en lav forekomst, men en jevn økning i alders standardiserte prevalens av eggstokkreft med 3% per år i forskjellige statlige registre over en periode [1].
Flertallet av eggstokkreft kreft (80-90%) er epiteliale ovarietumorer (EOCs). Opprinnelsen og patogenesen av EOC er fortsatt gallingly unnvikende, delvis fordi det er sjelden å finne veldefinerte forstadier, og delvis fordi EOCs tendens til å ha en kompleks og heterogen histologi som trosser en enkel biologisk forklaring. Mangel på praktiske screening metoder og fravær av klare symptomer i tidlige stadier av tumorprogresjon har gjort EOCs vanskelig å behandle med hell. Paclitaxel (Taxol) og platina-basert kjemoterapi (enten cisplatin eller karboplatin) representerer standardbehandling etter kirurgisk debulking. Dessverre, selv med moderne kjemoterapi.
En uunngåelig tilstand som utvikler seg i tumor microenvironments er hypoksi de fleste pasienter med langt fremskreden sykdom tilbakefall og dør av sykdommen. Dette er en viktig stimulerende faktor for angiogenese, som er en driv faktor for aggressive kreftformer. Det er flere angiogene faktorer og likevel vaskulær endotel vekstfaktor (VEGF-A) er blitt sies å være den mest robuste molekyl i ferd med angiogenese. VEGF-A blir utskilt av mange tumorceller in vitro, og er sterkt oppregulert i de fleste humane cancere. Ekspresjon av VEGF-A korrelerer med intratumoral kar tetthet og dårlig prognose i kreftpasienter og hemming er kjent for å redusere tumor kar tetthet og tumorvekst [2, 3].
VEGF-A-genet er lokalisert på kromosom 6p12 og omfatter et 14 kb-kodende område, består av åtte eksoner og viser alternative spleising for å danne en familie av proteiner. VEGF-A-genet inneholder Hypoksi Responsive Elementer (hres) i sine 5`and 3`UTRs. VEGF-A er oppregulert i henhold hypoksiske betingelser ved binding av HIF-1 (hypoksi induserbar faktor-1) til den HRE [4]. Hypoksi medierer også stabilisering av VEGF-A mRNA ved binding av uidentifiserte faktorer til sin 3`UTR. VEGF-A blir også modulert med en rekke vekstfaktorer og cytokiner. Således er genet er underlagt flere nivåer modulering av ekspresjon i henhold hypoksi [5]. Genet er svært polymorfe og ganske mange studier har vist noe av SNPs å modulere genekspresjon og indusere høyere VEGF-A plasmanivåer.
Mange studier har undersøkt hvilken rolle VEGF-A polymorfismer som en genetisk determinant for mottakelighet og utfallet i bryst, prostata, ikke-småcellet lungekarsinom (NSCLC), og tykktarmskreft. Globalt ble flere studier på foreningen av disse polymorfismer med risiko og behandlingsresultat gjort, men oppnådde resultater blant ulike raser og kreft var svært variabel. For eksempel rs3025039 «T» allel formidles beskyttelse mot brystkreft, men omvendt, økt risiko for tykktarmskreft. Likeledes rs2010963 «C» allele predikert høyere risiko for NSCLC og prostatakreft, men forutsagt redusert risiko for tykktarmskreft, [6]. Mangelen på enighet om hvilken rolle disse SNPs kan være på grunn av sin kobling med andre obskure faktorer eller fordi slike SNPs modulere uttrykk av genet som en helhet, som har flere isoformer som omfatter både pro og anti-angiogene isoformer man har en 2 veis modulasjon mulig av disse SNPs. Kanskje vil tilknytning haplotyper være mer intelligent enn individuelle SNPs. Økt forståelse av funksjonaliteten til disse polymorfismer og deres rolle i tumorbiologi er viktig å skjelne årsakene til uoverensstemmelser i litteraturen, som også bidrar i utformingen av assosiasjonsstudier i fremtiden.
Polymorfisme inkludert i denne studien er rs699947, rs1570360, rs833061, rs2010963, rs1413711 og rs3025039 og er kjent som VEGFA-2578 A /C, -1154G /A, -460 C /T, 405 G /C, 674 C /T og 936 C /T, respektivt. VEGFA-2578 A /C har fått navn etter sin stilling i forhold til translasjonsstartsetet (-1540 bp i forhold til transkripsjons-startsetet), og er plassert i den promoter-regionen. Likeledes 405 G /C er også kjent som -634 G /C. Navnene på andre polymorfismer er basert på stillinger i forhold til transkripsjons-start (-460, 405) eller utgangen (936) område, og således disse SNP er plassert i promoteren, 5′-ikke-translatert (UTR) og 3 « -UTR regioner, henholdsvis. 674 C /T er tilstede i intron en region av genet. De SNPs i denne artikkelen er referert til med sine respektive dbSNP id tall. Disse SNP’er er i umiddelbar nærhet til HRE regionen og signale sekvensen av peptidet i genet. Dette setter dem i rampelyset for mulighetene for genekspresjon modulasjon avhengig av allelet stede.
De 6 polymorfismer i VEGF-A-genet har blitt inkludert i våre case-control studie av ovarialcancer med sikte på undersøke hvilken rolle de genetiske varianter som diagnostiske eller prognostiske verktøy og deres sammenheng med sykdomsstatus og clinicopathological faktorer. Vi presenterer en første slik undersøkelse ansette befolkningen fra det indiske subkontinentet i Sør-Øst Asia.
Resultater
Association of polymorfismer med sykdom
De seks polymorfismer genotypet i 300 tilfeller, og 320 kontroller ble alle funnet å være i Hardy-Wienberg likevekt. Den allel distribusjon og foreningen er vist i figur 1 og 2 i form av OR og 95% konfidensintervall. rs 1570360, rs 833 061, rs 2010963 og rs 3.025.039 utstilt meget sterk sammenheng (p-verdi 0,001) med sykdomsstatus. rs 1413711 utstilt signifikant sammenheng med sykdommen også (p-verdi 0,01). rs 699947 viste ingen sammenheng med sykdomstilstand i studiekohorten. Den genotypisk fordeling av SNP er vist på figur 3 og en evaluering under begge de dominerende og recessive modeller for krets ble beregnet. Blant de testede modellene, den dominerende modellen viste høyere betydningen av tilknytning til sykdom (data vist i S1 tabell).
Association of polymorfismer med kreft og andre klinisk-patologiske faktorer
det er totalt elleve clinicopathological faktorer ble inkludert i studien som alder ved diagnose, menstruasjonsstatus, FIGO stadium, klasse, histopatologi, bilateral lidelse av eggstokkene, preoperative plasma CA-125 nivåer, tumortype , tilstedeværelse eller fravær av ascites, nærvær eller fravær av restsykdom og tilbakefall i løpet av en periode på ett år postoperativ kirurgi. (S2 Tabell verver de clinicopathological faktorene som inngår i studien). Post-op CA125 nivåer ble også vurdert for tilknytning til polymorfismer til korrelerer med prognose sammen gjentakelse, selv om dataene for alle prøvene ikke kunne hentes. Likevel ble en forening test gjort for tilgjengelige data undergruppe. På en forening analyse for hele saken kohorten mellom polymorfismer og klinisk-patologiske faktorer, SNPs rs 699947 og rs 1.413.711 viste ingen sammenheng med malignitet eller sykdomsstatus. Alle andre SNPs viste signifikant sammenheng med malignitet med en p-verdi på 0,001. Tabell 1 oppsummerer resultatene oppnådd for foreningen av polymorfisme med hver av de clinicopathological faktorer.
Heis data og haplotype foreninger
Vi kunne ikke observere noen signifikant sammenheng mellom noen av polymorfismer (fig 4). Selv rs1413711 og rs3025039 utstillings en rettferdig grad av kopling til et D «verdi på 0,605, men det er langt bak standard avskåret antatt på D» på 0,8 eller utover. Vurdering av haplotyper inkludert alle SNPs ikke ga noe klart forgrunnen-runner også. Når en haplotype-analyse ble kjørt eksklusiv rs699947 og rs1413711, et sett av 5 haplotyper av 16 generert gjennom PHASE hadde en frekvens på 5%. De haplotyper var under granskning inkluderte SNPs rs833061, rs1570360, rs2010963 og rs3025039. TGGC (37%), CGGC (19%), CGCC (9%), TGCC (12%) og TAGC (8%) utgjorde 85% av studiepopulasjonen. Tabell 2 surmises disse haplotyper, sin frekvens i kasus-kontroll kohorter og testet foreningen p-verdien av disse haplotyper med sykdommen. Av disse TGGC ble observert ved 50% av den totale befolkningen i kontroller, men bare 24% i saker og tilhørende betydelig som en skjerming faktor. CGCC ble observert å være på 11% i tilfellene, men bare på 6% i kontroller og tilhørende betydelig med sykdomsstatus.
Effekt av haplotyper på sykdom aggresjon og malignitet
de haplotyper nevnte ble gransket for noen tilknytning til sykdom aggresjon og malignitet. Haplotype TGGC assosiert svært betydelig som en beskyttende faktor (p-verdi 0,001) i sin homozygot tilstand. Den heterozygote TGGC tilstand viste ingen effekt eller forening. CGCC forbundet signifikant med malignitet (p-verdi 0,0198). Det ble også observert at høy ondartet potensiale ble observert i bærere av CGCC haplotyper i sin homozygot tilstand, men heterozygositet hadde ingen signifikant effekt. Dette gir opphav til forestillingen om at de haplotyper TGGC og CGCC kan ha en kopi-nummer eller doseavhengig effekt. Vi observerte at pasientene vertskap for CGCC viste høyere forekomst av tilstedeværelsen av 500ml ascites (statistisk signifikans ikke nådd) og høyere preoperative plasma CA-125 nivåer (p-verdi 0,017). Verter til haplotyper CGCC og CGGC også utstilt en høyere tilbøyelighet til aggressiv sykdom og kreft. Tabell 3 gir en oversikt over de haplotype frekvenser i sin homozygot og heterozygot forhold og deres tilknytning til sykdom forekomst er immatrikulert med Yates «korreksjon brukt. Det var ingen observert sammenheng mellom noen av haplotyper med tilbakefall av sykdommen i løpet av en periode på ett år og heller ikke var det i forbindelse med restsykdomsstatus i den aktuelle studien.
Diskusjoner
behov for en vaskulær støttesystem er essensielt for vekst, det være seg tumorceller eller normale celler. Tumor angiogenese er en primær hendelse som tilfredsstiller dette behov uten noe som tumorceller, ikke kan vokse utover 2mm og holde seg sovende [7]. En intrikat balanse mellom pro og anti- angiogene faktorer som er nødvendig for en sunn angiogenese. EOCs, som angiogenese-avhengige, krever en angiogen bryter som vipper balansen favoriserer angiogenese [8]. I avansert eggstokkreft, fører VEGF-A indusert patologisk angiogenese til ondartet ascites produksjon og eventuell sykdomsutvikling og behandlingssvikt. En mengde av SNP i VEGF-A-genet har blitt oppdaget som har vært forbundet med modulerende nivåer av VEGF-A-protein ekspresjon og følsomhet for forskjellige karsinomer [9-13]. Studier avhør effekten av polymorfismer og testing deres gyldighet som prognostiske markører eller risikofaktorer er langt og få, og de fleste av dem i kaukasiske løp. Studier som benytter den asiatiske undergruppe er sparsommelig.
Blant de få studier i eggstokkreft, ble rs3025039 observert å bli assosiert som en risikofaktor i en studie [14] og var assosiert med bedre prognose i en annen studie [15] . Vår studie impliserte SNP med dårlig prognose og risikofaktor som i tidligere studie. rs2010963 forbundet sterkt med bedre prognose, men svak sammenheng i tilfelle rs803361 [16]. Studien viste også at zygosity holdt uavhengig prognostisk betydning. En studie blant rs2010963, rs1570360 og rs699947 viste ingen signifikant sammenheng av polymorfismer med noen klinisk-patologisk parametre, men forbundet med betydelig endring av VEGF-A uttrykk, men ingen sammenheng med progresjonsfri overlevelse eller prognose og foreslo signifikant koblingsulikevekt blant disse polymorfismer [17 ]. Den haplotype Analysen i studien viste ingen signifikant sammenheng med klinisk-patologisk parametre selv om en av sine haplotyper AGCGC (rs699947, rs1570360, rs833061, rs2010963 og rs3025039) viste signifikant sammenheng med progresjonsfri overlevelse.
SNPs i vår studien skjønt oppviste sterk assosiasjon med sykdomsstatus, viste ingen signifikant sammenheng mellom seg som rapportert i flere andre studier [18-22]. Flere av SNPs inkludert viste signifikant sammenheng med visse klinisk-patologisk parametere. rs3025039 viste signifikant sammenheng med malignt potensiale, Figo etapper, bilateral lidelse, post-op CA125 plasmanivåer, ascites og tilbakefall indikerer det å være lovende markør for dårlig prognose. rs1413711 og rs2010963 knyttet betydelig med tilstedeværelse av ascites men signifikans ble ikke sett med økte nivåer av ascites. rs833061 assosiert med bilateral mishandlet eggstokkene og enda sterkere i den maligne undergruppe av case-prøver. rs699947 viste ingen assosiasjon til sykdom status eller andre klinisk-patologisk parametere.
tvetydighet i polymorfi data på tvers av populasjoner kan delvis bli explicated i form av posisjonene til disse godt rapportert polymorfismer og til isoformer av VEGF-A som er kjent for å være anti-angiogen. Så mye som en angiogen bryter oppstår i favør av angiogenese i tilfelle av tumorgenese, er det også en selvregulerende mekanisme i forhold til VEGF-A-genet som opprettholder en fin balanse mellom de pro- og anti-angiogeniske isoformer av VEGF- -A-genet.
Exon 8 av VEGF-A-genet har en unik evne til å produsere både pro og anti-angiogeniske isoformer av VEGF-A. Mens exon 8a overfører pro-angiogenecity, overfører ekson 8b anti-angiogenecity. Alternativ spleising som produserer mRNA med 8b kodoner fremstille et helt sett av isoformer av VEGF-A som er helt motstridende effektene av mRNA fra 8a undergrupper. Perrin et al har rapportert at ekspresjon av VEGF-A
xxxb isoformer bidra til konkurrerende inhibering av binding til reseptorer, men ikke å stimulere tyrosinfosforylering vesentlig for nedstrøms angiogen aktivitet som forårsakes av VEGF-A
xxxa isoformer. VEGF-A
xxxb isoformene er dermed endogene anti-angiogene midler dannet av alternativ spleising og sies å være påvirket av andre vekstfaktor forhold og spleise faktor ledige plasser. VEGF-A
165b isoformer har blitt rapportert å bli nedregulert i ulike cancerformer så som nyrecellekreft, prostatakreft og tykktarmskreft [23-25].
Dette aspektet av VEGF-A skjøting og alternative isoform produksjon er definitivt verdt en detaljert studie siden eksplorerende studier av SNPs hele verden ikke har gitt en konsensus data som er implicative. Del grunn til dette er den varierende tilstand in-vivo hos kreftpasienter. EOCs er enda mer komplisert siden en fersk rapport viste seg å være av mer blandet opprinnelse snarere enn bare overflaten epitel [26]. Denne heterogene Invivo mileu gjør modulering av VEGF-A genekspresjon svært intrikate.
SNPs rs 699947, RS 833061 og rs 1550360 på promoter regionen er felles for både VEGF-A
xxxa og VEGF -A
xxxb isoformer og dermed en sammenslutning av disse SNPs med sykdommen kan bety enten måter. One, kan det stemme at de pro-angiogene isoformer er i økende grad uttrykt eller det kan også bety at de anti-angiogene isoformer blir undertrykt. SNP rs 2010963 er innenfor 5 «UTR regionen. VEGF-A-genet er enestående i det faktum at den har et 1038bp 5’UTR region som har 2 IRES (intern ribosomale inngangs sider) elementer (IRES-A og IRES-B) som er differensielt tas i bruk, avhengig av de intracellulære betingelsene av normoxia og hypoksi [27]. Derfor effekten av rs 2010963 kunne slå utydelig vurderer romanen faktum at en lang form av VEGF-A mRNA (med en ekstra 180 aminosyresekvens) er produsert som modulerer den videre uttrykk for VEGF-A mRNA. rs 1413711 er inkludert i denne studien, er ikke godt undersøkt som de andre polymorfismer, men er likevel verdt en klokke, å være i intron en region. I vår studie, det gjorde ikke utøve noen signifikant sammenheng med clinicopathological faktorer, men klarte forbinder med stor betydning (p = 0,01) med sykdomsstatus. SNP rs 3025039 er godt dokumentert, er i 3»-UTR-regionen til VEGF-A-genet. Det er kjent for å påvirke de utskilte nivåer av VEGF-A-proteinet, og har vist seg å ha sterk forening i de fleste av de case-kohort studier. Denne SNP, i vår studie også utstilt meget sterk tilknytning til sykdomsstatus og dårligere prognose.
Dette undersøkende studie er den første i sitt forsøk i denne populasjonen og i sammendraget viser rs3025039 å bli assosiert som en svært lovende markør for prognose mens andre polymorfismer i studien var forbundet med noen klinisk-patologisk parametere og var usikker om deres prognostiske evner. De polymorfismer gjorde viser en sterk sammenheng med kreft og dermed kan være innblandet som risikofaktorer. Dette er summarisk den eneste papir som løser effekten av VEGF-A polymorfismer i epitelial eggstokkreft i Sørøst-asiatiske befolkningen, spesielt pan-indisk.
Materialer og metoder
Prøvetaking
totalt 300 pasienter diagnostisert med primær epiteliale ovarietumorer på Kidwai Memorial Institute of Oncology, Bangalore, India, ble inkludert i studien.
den første institusjonelle diagnostisering av ovarialcancer ble bekreftet av gjennomgang av patologiske slides av senior patologer. Av de 300 sakene, 202 (67,3%) var ondartede tilfeller, 31 (10,3%) var borderline eller Lave malignitetspotensiale (LMP) svulster og 67 (22,4%) var godartede svulster. Av disse antall forhånds mensus prøver stod på 88 (29,3%) og post-mensus prøvene på 212 (70,7%). 320 friske kontrollpersoner, matchet for alder og menopausal status, ble rekruttert til studien. Gjennomsnittsalderen for saken kullet var 51 ± 12 år og 48 ± 17 år for kontroller. 30,9% (99/320) av kontrollene var pre-menopausale og 69,1% (221/320) var menopausen. 65,8% tilfeller var høye scenen og høy klasse, og 63,8% tilfeller var serøs epitelial eggstokkreft. 64.9% tilfeller hadde bilateral lidelse og 86,6% tilfeller viste høye CA125 nivåer. Ascites ble observert i 80% av tilfellene. S2 Tabell i gir en in-detalj syn på demografi av sakene som tas opp i studiet. 5 ml blod ble samlet inn fra alle fag, før behandling i heparin vacutainers og behandlet umiddelbart der etter. Cellen pellet ble lagret i -20 ° C for DNA isolering og genotyping.
Alle svulster ble gradert i henhold til WHO kriterier og iscenesatt ifølge Federation of gynekologi og fødselshjelp (FIGO) klassifisering. Informasjon om kreftdiagnose, sykdomsstadiet (FIGO), histologisk grad og subtype, pre operative CA-125 nivåer, restsykdom og tilbakefall ble abstrahert fra journaler.
Study godkjenning ble gitt av Institutional Review Board og medisinsk etikk-komiteen og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne.
DNA
Genomisk DNA ble ekstrahert fra perifer blodprøve ved hjelp QIAamp® DNA-ekstraksjon kits (QIAGEN) som per produsentens protokoll. DNA-konsentrasjonen ble målt ved hjelp av Nanodrop fra Thermo Scientific.
genotyping
Polymerase Chain Reaction-rflp (PCR-RFLP) ble anvendt for å bestemme de seks VEGF-A-polymorfismer ved hjelp av tidligere publiserte protokoller med mindre modifikasjoner.
PCR ble utført i et 30 ul reaksjonsblanding med 50-100ng mal DNA, 1U av Taq polymerase enzym (Bangalore Genei) og 1X buffer leveres sammen med enzym. 0.3μM av de respektive primere (Sigma), 0,5 mM dNTP-blanding og 1,5 til 2 mM MgCl
2 utgjøres av PCR-miksen. PCR ble utført i en Eppendorf-PCR termosykler med en innledende denaturering ved 95 ° C i 5 minutter etterfulgt av 35-40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 40 sekunder, annealing i 40 sekunder, forlengelse ved 72 ° C i 20 -40 sekunder og en avsluttende forlengelse i fem minutter ved 72 ° C. PCR-primere og respektive annealing temperaturene som brukes for hver SNP i oppført i tabell 4.
De oppnådde DNA amplikonene ble fordøyd over natten med restriksjonsenzymet. De restriksjonsenzymer ble anskaffet fra New England Biolabs og begrensning temperaturforhold følges produsentens protokoll. De brukte enzymer var BglII (rs699947), BstUI (rs833061), MnlI (rs1570360), BsmFI (rs 2010963), BaeGI (rs 1413711) og NlaIII (rs3025039). BstUI ble anvendt ved 2U konsentrasjon, mens resten av enzymene ble brukt ved en konsentrasjon 1U i en reaksjonsblanding volum på 25 ul. Det fordøyde amplikonene ble separert i en etidiumbromidgel fra 1,5 til 3% agarose, avhengig av amplikonet størrelse. Bandet størrelser ble konstatert med bruk av en 50bp og 100bp stige.
Armer, haplotype og statistisk analyse
hydraulikk og haplotype analyse ble gjennomført ved hjelp av haploview 4.2 og fase 2.1.1 versjon. Den χ
2 test ble brukt for å avgjøre om genotypen distribusjoner var innenfor Hardy-Wienberg likevekt. Chi kvadrat og logistisk regresjon ble brukt for å undersøke sammenhengen mellom transport av markører og sykdomsstatus og andre clinicopathological faktorer. Alle statistiske analyser ble gjort ved hjelp av SPSS versjon 21.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. En analyse av polymorfismer under dominante og recessive modeller
doi:. 10,1371 /journal.pone.0131190.s001 plakater (DOC)
S2 Table. Demografi og clinicopathological aspekter av tilfellene (totalt 300)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0131190.s002 plakater (DOC)
Takk
Vi er takknemlige for pasientene med hvis samarbeidet denne studien var mulig. Vi takker Dr. V. Shanmugam, Ms Lakshmi Subramaniam og Ms Anisha Raju for deres verdifulle innspill og hjelp i dataanalyse.
