Abstract
Head and Neck plateepitelkreft (HNSCC) er den femte vanligste kreft årlig rammer over en halv million mennesker over hele verden. For tiden er det ingen akseptert biomarkører for klinisk påvisning og overvåking av HNSCC. I dette arbeidet, ble en omfattende genom-wide analyse av epigenetiske forandringer i primær HNSCC svulster ansatt i forbindelse med kreftspesifikke uteligger statistikk for å definere nye biomarkør gener som er forskjellig metylert i HNSCC. De 37 identifiserte biomarkør kandidatene var topp-scoring uteligger gener med fremtredende differensial metylering i svulster, men med noe signal i normalt vev. Disse antatte kandidater ble godkjent i uavhengige HNSCC kohorter fra vår institusjon og TCGA (The Cancer Genome Atlas). Ved hjelp av de beste kandidatene,
ZNF14
,
ZNF160
, og
ZNF420
, en analyse ble utviklet for påvisning av HNSCC kreft i grunnskolen vev og spyttprøver med 100% spesifisitet når sammenlignet med normale kontrollprøver. Gitt den høye deteksjons spesifisitet, kan analysen av ZNF DNA metylering i kombinasjon med andre DNA metylering biomarkører være nyttig i klinisk setting for HNSCC deteksjon og overvåking, særlig hos høyrisikopasienter. Flere andre kandidater som er identifisert gjennom dette arbeidet kan bli ytterligere undersøkt mot fremtidig utvikling av en multi-gen panel av biomarkører for overvåking og påvisning av HNSCC
Citation. Gaykalova DA, Vatapalli R, Wei Y, Tsai HL, Wang H, Zhang C, et al. (2015) avvikende analyse Definerer Sink Finger Gene Familie DNA Metylering i Svulster og Spytt på hode og hals kreftpasienter. PLoS ONE 10 (11): e0142148. doi: 10,1371 /journal.pone.0142148
Redaktør: Kwok-Wai Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hongkong
mottatt: 10 februar 2015; Godkjent: 18 oktober 2015; Publisert: 06.11.2015
Copyright: © 2015 Gaykalova et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Affymetrix Expression data . tilgjengelig i GEO33205 og Illumina Metylering data i GEO33202
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Dental og kraniofaciale Research and National Institute of Health Challenge Grant (RC1DE020324); National Institute of Dental og kraniofaciale Research and National Cancer Institute stipend (P50 DE 019 032 Head and Neck Cancer SPORE) til JAC. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Head and Neck plateepitelkreft (HNSCC) påvirker anslagsvis 60.000 personer i USA og 600.000 personer over hele verden hvert år [1, 2]. HNSCC er ofte forårsaket av tobakk og alkohol eksponering, samt av humant papillomavirus (HPV) [1]. Til tross for fremskritt i forståelsen av HNSCC biologi, omtrent halvparten av alle pasienter med HNSCC bukke for sykdommen innen fem år etter diagnose [2-4].
Det er nå allment observert at hel-genom hypometylering, ledsaget av -gen-spesifikke promoter hypermethylation, er en generell karakteristikk av faste tumorer [5, 6]. Arrangøren hypermethylation har blitt beskrevet for en omfattende rekke gener, og ofte resulterer i tumor-suppressor genet transcriptional undertrykkelse [3]. Gitt den høye frekvensen av metylering unormalt DNA i kreftceller, samt DNA metylering signal stabilitet under celledeling, påvisning av DNA metylering er et verdifullt verktøy i utviklingen av biomarkører for kreft gjenkjenning og prognose [7-9]. Flere hel-genom metylering analyser har blitt utført for å definere DNA metylering underskrift av HNSCC [5, 10-14]. DNA metylering av
DCC
,
EDNRB
,
DAPK
,
CCNA1
,
p16
,
HOXA9
og
KIF1A
gener har blitt påvist i primær vev og biologiske væsker, inkludert spytt og plasma [7, 10, 15, 16], som stammer fra HNSCC pasienter. DNA metylering av flere andre gener, inkludert
MINT31
,
MGMT
,
NID2
,
ERCC1
, og
TIMP3
, har foreslått som biomarkører for HNSCC som kan oppdages i en pasients biofluids [11, 16]. Andre gener, som
CYGB
,
RASSF1A
,
SPARC
,
GSTM1
,
cyclinA1
,
MX1
,
WIF1
,
GNG7
,
CYP1A1
,
ZNF132
,
ZNF154
, og
ZNF447
har vist høy forekomst av DNA metylering i primær HNSCC svulster [13, 14, 16-23] og er kandidater for videre validering av DNA metylering påvisning i kroppsvæsker. Genome-wide identifisering av epigenetiske endrede gener i HNSCC forsterker en forståelse av mekanismene for kreftutvikling. I tillegg kan disse tilnærmingene avdekke nye kreftspesifikke DNA metylering hendelser som kan brukes for molekylær deteksjon strategier i kirurgiske marginer eller kroppsvæsker [7, 24-27].
Nyere data tyder på at påvisning av arrangøren metylering av
EDNRB Hotell og
DCC
hos pasienter med høy risiko munnsår har en tilsvarende ytelse i diagnose som ekspert klinisk evaluering [25]. Likevel, tester utnytte
DCC Hotell og
EDNRB
promoter metylering er begrenset til 46% sensitivitet og 72% spesifisitet for kreft deteksjon i spytt skyller [25]. Mens lav følsomhet kan begrenses av infrequency av kreftrelaterte endringer [11, 25, 28], hever lav spesifisitet av tekniske begrensninger. Selv om økende testen deteksjonsgrensen kan øke spesifisitet [10, 25], krever dette ekstra cut-off verdi manipulasjoner som ikke er praktisk i klinisk setting. Derfor kan påvisning av nye DNA markører med absolutt spesifisitet for kreftvevet forbedre dagens biomarkør paneler og forbedre potensialet klinisk anvendelse av molekylære deteksjons strategier [7, 24-26]. Lav følsomhet av individuelle biomarkører som er svært spesifikk for kreftvevet kan overvinnes ved å kombinere flere svært spesifikke gener i platene uten å ofre generelle spesifisitet [11].
Gitt omfattende innholdet i høye gjennomløps teknikker, tusenvis av differensielt denaturert regioner kan detekteres mens sammenligne tumor og normale prøver [10]. Den heterogenitet av genetiske og epigenetiske forandringer i solide tumorer har gitt utfordringer i å bruke konvensjonelle statistiske metoder, som t-tester eller signal-til-støy-tester. Disse vanskeligheter kan minimeres ved bruk av uteligger-baserte analyser for å gi en grad av statistisk signifikans for heterogene endringer i tumorer. Uteliggeren basert analyse har gitt en mekanisme for å definere viktige, men ulike, endringer i kreft. Standard metode som anvendes innen kreftforskning for avvikende analyse er Cancer avvikende Profil Analyse (COPA [29]), som sammenligner uteliggere til en empirisk null. For å eliminere lav signal uteliggere, dette arbeidet gjennomføres COPA-baserte statistikken med en rank sum avvikende tilnærming så vel som å sette et minimumsnivå for kall av en avvikende [30]. Dette er den første papir benytte avvikende analyse [30] for biomarkører.
Materialer og metoder
Vevsprøver
Primær tumorvev og matchet spyttskylleprøver ble samlet inn fra HNSCC pasienter ved Johns Hopkins Hospital etter informert, ble skriftlig samtykke innhentes. Denne studien ble godkjent av Johns Hopkins Medicine Intern Review Board (JHM IRB) og utføres under forskningsprotokoll NA_00036235. Totalt sett to uavhengige kohorter av HNSCC pasientprøver og normale kontrollprøver ble brukt. Alle mennesker som deltok i denne studien ble avidentifisert etter den kliniske datainnsamling. Oppdagelsen kohorten besto av 44 primær HNSCC vev og 25 normale slimhinneprøver fra uvulopalatopharyngoplasty (UPPP) operasjoner av ikke-kreft påvirket kontrollpasienter fra tidligere publiserte studier [31-33]. Den uavhengige validerings kohorten inkluderte primær tumorvev og matchet spyttskylleprøver fra 59 HNSCC pasienter, 31 normale prøver UPPP vev og 35 spyttskylleprøver fra ikke-kreft pasienter. Alle primære vev og kroppsvæskeprøver ble lagret ved -140 ° C inntil bruk. Alle primær vevsprøver ble analysert av etterforskere fra patologi Avdeling for Johns Hopkins Hospital (WHW og JAB). Tumorprøver ble bekreftet å være HNSCC og ble deretter microdissected til å gi minst 75% tumor renhet. Kliniske kjennetegn ved de to kohorter er oppført i S1 og S2 tabeller. Fordelingen av HNSCC sub-typer i begge kohorter er representativ for fordelingen av hode og nakke kreft både i USA og over hele verden, inkludert ~ 30% av HPV-relaterte (HPV +) orofaryngeal SCC tilfeller. Gyldigheten av denne oppdagelsen årsklasse, og den er egnet for flere analyser har blitt vist i flere tidligere publikasjoner [31-34]. I et forsøk på å redusere skjevhet og få robuste kreft upåvirket kontroller, ble kontrollpasienter tilfeldig valgt fra tilgjengelige vevsprøver UPPP og spytt skyller, men kliniske karakteristikker var ikke i stand til å bli matchet.
DNA forberedelse
microdissected tumor vevsprøver eller 250 pl aliquoter av spyttprøver ble kuttet i 1% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) -løsning (Sigma) og 50 ug /ml proteinase K (Invitrogen) oppløsning ved 48 ° C i 48-72 timer. DNA ble renset ved hjelp av fenol-kloroform-ekstraksjon og etanolfelling som tidligere beskrevet [35]. DNA ble resuspendert i Lote-buffer, og DNA-konsentrasjonen ble kvantifisert ved hjelp av Nanodrop spektrofotometer (Thermo Scientific).
RNA-fremstilling
RNA ble isolert fra de microdissected vevsprøver med den Mirvana miRNA Isolation Kit ( Ambion) i henhold til produsentens anbefalinger, og RNA konsentrasjon ble kvantifisert ved hjelp av Nanodrop.
Arrays
ti mikrogram RNA og DNA ble sendt til Johns Hopkins Kjerne Facility for kvalitetskontroll spørring og analyse av prøver av high-throughput arrays. Prøvene ble kjørt på Affymetrix HuEx1.0 GeneChips (som inneholder 1,4 millioner prober) for uttrykk analyse og Illumina infinium HumanMethylation27 BeadChips (sondering 27,578 CpG dinukleotider) for metylering analyse følgende bisulfit konvertering. Alle matriser ble kjørt i henhold til produsentens protokoller og data ble rapportert tidligere [31-33]. Affymetrix Expression data er tilgjengelig i GEO33205 og Illumina Metylering data er tilgjengelig i GEO33202. Begge datasettene er tilgjengelig i GEO superSeries GSE33232. Dataene kan nås på https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE33232.
HPV analyse
Patologi rapporter om HPV status av orofaryngeal SCC svulster ble hentet fra Johns Hopkins Hospital Pathology avdeling. I tillegg ble HPV-status for alle oropharynx SCC primære tumorvev uavhengig bekreftet ved kvantitativ PCR (qPCR) ved anvendelse av HPV16 primere og prober på real-time PCR maskin [7] i forhold til CaSki (ATCC) cellelinje, som er kjent for å ha 600 kopier av HPV16 per genom. Prøver med HPV kopi nummer ≥ en kopi /genom /celle ble identifisert som HPV positive.
Bisulfite Behandling og Bisulfite Genomisk sekvense
EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) ble brukt til å konvertere unmethylated cytosines i genomisk DNA til uracil. Bisulfite behandlet DNA ble forsterket med primere utformet ved hjelp MethPrimer [36, 37] (S3 tabell). Primerpar ble utformet i CpG island rundt promoter-regionen med nærhet til metylering array-sonder. Den representativ prøve fra oppdagelsen kullet ble valgt på basis av forskjeller i høyeste metylering og samtidig uttrykk som beregnet i løpet av avvikende analyse for hver enkelt gen. Bisulfitt-sekvensering ble valgt for dette trinn for å fastslå den absolutte (ikke relativ eller normaliserte) metylering status av flere CpG-dinukleotider i CpG øy nær promotoren av hvert gen. Touch-down PCR ble utført [38]. PCR-produktene ble renset ved anvendelse av QIAquick 96 PCR Purification Kit (Qiagen) og rensede PCR produktene ble sekvensert (Genewiz). Gene metylering status ble bestemt som en trichotomous variabel (unmethylated, hemimethylated, eller hypermethylated) i henhold til sekvensen leses.
Kvantitativ metylering-spesifikk PCR (QMSP)
For QMSP, primere ble utformet for å spesifikt omfatter CpG-dinukleotider som viste forandringer i metylering som sett av bisulfitt sekvensering. QMSP ble utført på real-time PCR maskin med normalisering til unmethylated
β-aktin
referanse kontroll [39]. Den Taqman PCR maskinen ble satt på 38 sykluser maksimalt for å eliminere falske positive signaler. Bisulfitt-konvertert leukocytt-DNA fra en frisk person ble anvendt som en negativ kontroll. Det relative nivå av metylert DNA i hver prøve ble bestemt som et forhold av den forsterkede genet til
β-actin product: [40] og multiplisert med 100. Sekvenser av primere og prober som brukes kan finnes i Tabell S3.
Reverse Transcription og Kvantitativ real Time PCR
en mikrogram av RNA fra valideringen kohorten var revers transkribert ved hjelp av High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit. Kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp av gen-spesifikke uttrykk analyser (S3 tabell) og Universal PCR Master Mix på 7900HT real-time PCR maskin (alt fra Applied Biosystems) per produsentens anbefalinger. Ekspresjon av genet av interesse ble kvantifisert i tre paralleller i forhold til
GAPDH Hotell og
18S
uttrykk ved hjelp av to-ΔΔCT metoden [41].
Statistisk analyse
metylering data normalisering.
for promotor metylering data, p-verdier (andel av metylering) ble beregnet fra unmethylated (U) og metanoldenaturert (M) målinger på en sonde nivå basis. estimater Gene nivå ble produsert ved å velge de høyeste metylering nivået blant alle sonder knyttet til det samme genet (14,477 gener totalt).
Betydelig nålsonden besluttsomhet.
genuttrykk data ble normalisert med robust multi -array gjennomsnitt (RMA) analyse bruker Bioconductor oligo pakken [42, 43]. estimater Gene nivå ble produsert av RMA hjelp kjerne sonder, som gir 22,011 gener for analyse [31, 32].
avvikende analyse.
standard metode som anvendes innen kreftforskning for avvikende analyse er Cancer uteliggeren Profil Analyse (COPA), som sammenligner uteliggeren utdelinger til en empirisk null generert ved permutasjon av klasse etiketter [29]. En modifisert rank sum avvikende tilnærming, endres fra Ghosh [44], ble brukt, i hvilke minimumsendringsnivåer ble satt for definisjonen av en avvikende [30]. Dette eliminerte mange utliggere hvori forandringen var ikke biologisk meningsfull (f.eks metylering endring på mindre enn 10% mellom hvilke som helst to prøver). Denne statistikken ble brukt til oppdagelsen DNA metylering datasettet, som inneholder 14,477 gener for 44 tumorvev, hvor signaler fra 25 normale prøver ble brukt til å etablere grunnlinjen cut-off point for hvert gen. Venstre-tail og høyre-tail uteliggere ble bestemt ved bruk av rang-sum-metoden [45]. Uteliggeren score ble beregnet for både høyre-tail og tilfeller venstre hale, som tillot definisjonen av uteliggere som ble hypermethylated og hypomethylated på svulster, henholdsvis [30, 45]. Gitt at uteliggeren analyse ikke har en score cut-off, ble en terskel valgt å gi ca 50 topp-scoring gener. Denne poengsummen cut-off på 13,2 identifiserte 37 toppkandidater for videre validering (S4 tabell).
Expression-metylering korrelasjon.
Normalisert genekspresjon data var korrelert med arrangøren metylering nivåer i metylering kandidatene bruker Spearmans rank korrelasjon (tabell 1).
sammenheng og Konkordans av DNA Metylering Detection.
Korrelasjoner av ZNF DNA metylering signaler mellom primære tumor vev og spytt rinses (oppdaget av QMSP analyse ) blant HNSCC pasienter fra valideringen kohorten ble evaluert via Spearmans koeffisient og kappa koeffisient. Avtalen konkordans ble beregnet ved bruk av kappa statistikk.
Følsomhet og spesifisitet Kvantitering.
De QMSP metylering verdier for spyttprøver ble beregnet ved hjelp av en standardkurve metode og ble normalisert til en metylering uavhengig DNA lasting kontroll (
β-aktin
). Metylering nivå av hvert gen ble behandlet som en binær variabel (metylert vs. unmethylated) ved dichotomizing metylering ved null DNA-metylering deteksjon ved QMSP. Emner med en diagnose av HNSCC ble definert som «forekomst av sykdom», og «fravær av sykdom» fag ble definert ved normale kontroller. Sanne positive, sanne negative, falske positive og falske negative priser ble deretter fastsatt for de enkelte genene. For kombinasjonen av markører, ble pasienten klassifisert som «test positiv» hvis noen av markørene var positive, og «test negative» hvis alle merkene var negative. Følsomhet ble anslått som andelen pasienter som var testen positiv blant de med sykdom, og spesifisitet ble beregnet som andelen pasienter som var testen negativ blant de uten sykdommen. Den 95% konfidensintervall (KI) for sensitivitet og spesifisitet ble beregnet forutsatt binomialdistribusjon [46].
Resultater
Identifikasjon av ulikt denaturert genet uteliggere
Fra genom-wide differensial DNA-metylering analyse av 44 primærsvulster og 25 kontroller normalt vev, biomarkør kandidater ble valgt basert på skjemaet vist i figur 1. basert på antallet uteligger prøver og den relative signalintensitet, ble 37 av de beste kandidatene rangerings valgt for ytterligere analyse (S4 tabell). Korrelasjon av uttrykket og metylering array-data er tillatt for oppdagelsen av 24 kandidatgener (av 37 innledende gener) med biologisk relevant negativ korrelasjon mellom DNA metylering og genekspresjon (tabell 1). Spesielt, alle 24 kandidatgener viste hypermethylation og redusert uttrykk i tumorprøver. I tillegg er alle kandidatene viste minimal DNA metylering signal i normalt vev, med maksimal gjennomsnittet av β-verdi for normale prøver av 0,058, eller 6% metylering (S1 fig og S5 Table). Standard t-test viste at 23 av 24 gener (96%) var statistisk signifikant forskjell i DNA-metylering mellom normale og alle tumorprøver og mellom normale og HPV-tumorprøver. Ett gen,
CCND2
, nådde ikke statistisk signifikans basert på en t-test, men dette gjorde demonstrere en forskjell mellom tumor og normale prøver av en Fisher Exact test basert på tilstedeværelse av hypermethylated uteliggere i tumorprøver.
Skjematisk skisse av integrerende tilnærming benyttet i denne studien, som kombinerer høy gjennomstrømming screening av DNA metylering og genuttrykk for oppdagelsen kohort av HNSCC: ansettelse av DNA metylering array-data med 27,578 sonder totalt; normalisering av dataene i R, 14,477 gener totalt; avvikende analyse og cut-off for å motta ca 50 topp gener (13,2 avvik scorer; 37 beste rangerte gener gikk, se Metoder for detaljer); Integrasjon av de normaliserte data fra uttrykket assay (22,011 gener); Spearmans korrelasjonskoeffisient beregninger (24 gener overføres); 7 ZNFs bisulfite sekvensevaliderings; QRT-PCR, 5 ZNFs genekspresjon validering; Validering av tre ZNF QMSP deteksjon i spytt og tumorprøver i ulike kohorter.
Økt metylering og redusert genekspresjon endringer i HPV-pasienter
Det er kjent at HPV + og HPV HNSCC tilfeller ulik landskapet av genetiske og epigenetiske forandringer [5, 12, 47, 48]. Ved å skille 44 HNSCC pasienter med HPV-status, ble det bestemt at 92% (22 av 24) gener hadde signifikant høyere metylering i HPV HNSCC, sammenlignet med normale prøver (S5 Table). Kun 4% (1 av 24) kandidatene hadde DNA metylering i HPV + HNSCC prøvene betydelig høyere i forhold til vanlige prøver (S5 Table). De fleste, 54% (13 av 24) gener hadde signifikant høyere metylering i HPV HNSCC, sammenlignet med HPV + prøver, i samråd med publiserte data [12]. Tumorprøver hadde en tilsvarende nedgang på kandidat genekspresjon (S1 figur og S6 tabell). Således, 71% (17 av 24) gener som viser en signifikant reduksjon i gen-ekspresjon i alle HNSCC-prøvene sammenlignet med normale prøver; 75% (18 av 24) gener viste en signifikant reduksjon i genekspresjon i HPV-prøvene sammenlignet med normale prøver; og 21% (5 av 24) gener hadde betydelig redusert genekspresjon i HPV-prøvene i forhold til HPV + prøver. Den reduserte genuttrykk i tumorprøver var i samsvar med den generelle økte arrangøren metylering i tumorprøver (S1 Fig og tabell 1).
Validering av arrangøren hypermethylation av kandidatgener
For å validere differensial metylering status av CpG øyer nær promoter-regionen i de 24 utvalgte kandidat gener, ble bisulfite sekvensering utført på 5 representative prøver av normale slimhinneprøver og 5 primær HNSCC tumorprøver fra første oppdagelsen kohort. Av de 24 gener, 22 (92%) viste økt metylering i tumorer i forhold til normale prøver (figur 2). Tjue kandidatgener (84%) viste metylering i mer enn 50% av primærtumor, inkludert
ADFP
,
FUZ
,
ZNF71
,
ENPP5
ZNF211
,
og ZNF14 plakater (figur 2). Bisulfite sekvense data sterkt korrelert med resultatene fra array-data, der minimal DNA metylering ble oppdaget i vanlige prøver (S1 fiken og fig 2).
Bisulfite sekvense Resultatene er vist i 5 HNSCC tumorprøver og 5 normale vev den opprinnelige funn kohorten for de 24 topp-ledelsen kandidat gener (tabell 1). Skraverte svarte boksene representerer helt denaturert arrangører, grå boksene representerer hemimethylated arrangører, og hvite bokser representerer unmethylated arrangører.
Sink Finger Protein kandidater
Det ble bemerket at 7 av 24 kandidatgener var medlemmer av Zinc Finger Protein (ZNF) gruppe, og ytterligere analyser ble utført i denne gruppen. For å utdype ZNF kandidater, ble DNA metylering analysert i en egen kontroll kohort av 59 svulster og 31 normalt vev (S2 Table). Ved hjelp av bisulfitt-sekvenseringsmetoder, ble signifikant økning av DNA-metylering for fem av de gener påvist i denne kohort (S7 tabell). Men redusert DNA metylering av
ZNF141
promoter i valideringen kohort motsa de funn gruppedata, og ingen DNA metylering ble oppdaget i
ZNF211
i prøver fra valideringen kohort. Av alle resterende fem ZNF proteingener,
ZNF14
,
ZNF160
,
ZNF71
,
ZNF420 Hotell og
ZNF585B
, DNA metylering var betydelig høyere i tumorprøver, sammenlignet med normale kontroller (S7 tabell).
ZNF downregulation er assosiert med arrangøren metylering
for å validere hypotesen om at uttrykk for individuelle ZNF proteingener påvirkes av metylering av sine arrangører, ble senere utført QRT-PCR-analyse for
ZNF14
,
ZNF71
,
ZNF160
,
ZNF420 Hotell og
ZNF585B
uttrykk på prøvene fra en uavhengig validering kohort (S2 fig). Alle bortsett fra
ZNF71
demonstrert betydelig nedregulering av uttrykk i tumorprøver i forhold til normalt vev, noe som var i samsvar med økte metylering nivåer. Separasjon av tumorprøver i henhold til HPV tumorstatus viste at ZNF uttrykk var ikke signifikant forskjellig i HPV og HPV + pasientgrupper (S2 Fig og S7 Table).
ZNF DNA metylering påvisning er svært spesifikk for primær HNSCC vev
Basert på DNA-metylering resultatene, ble det antatt at ZNF metylering kan potensielt brukes som en klinisk anvendelig biomarkør for HNSCC. Dermed ble QMSP primere og probe analyser designet for
ZNF14
,
ZNF160 Hotell og
ZNF420
. En svært spesiell QMSP analyse for
ZNF585B
kan ikke utformes på grunn av sin høye CpG tetthet.
QMSP analysene ble først godkjent for alle tre ZNF gener i vevsprøver. I likhet med bisulfit sekvense resultater, gjorde QMSP analyser ikke påvise DNA metylering i alle normale prøver, men DNA metylering ble oppdaget i
ZNF14
,
ZNF160 Hotell og
ZND420
i 44,1% , 39% og 32,2% av tumorer hhv. I det minste en ZNF ble metylert i 57,6% av tumorvev. (Tabell 2). Spesielt, 17% av pasientene (10 av 59) hadde metylering oppdaget på alle tre ZNF arrangører. Litt høyere forekomst av DNA metylering ble sett i HPV-gruppen, men forskjellen var ikke statistisk signifikant (figur 3).
Synlig er ZNF QMSP resultater i 59 HNSCC primærtumor og spyttskylleprøver sammenlignet med normal plasma og spyttskylleprøver fra valideringen kohorten. ZNF promoter metylering ble kvantifisert i forhold til Bact metylering og multiplisert med 100. Pluss (+) eller minus (-) refererer seg til sin HPV status av kreftpasienter. NS = normal spyttskylleprøve (n = 35), N = normal primære vev (n = 31), TS = spyttkylling fra HNSCC pasienter (n = 59, 41 av HPV + [TS +] og 18 av HPV [TS-] ), T = primærtumorprøver fra HNSCC pasienter (n = 59). Det var ingen påvisbar ZNF DNA-metylering i normale prøver. Signifikant (p 0,05). Forskjellen mellom gruppene er merket med en stjerne (*), som beregnet av den eksakte Fisher test
ZNF DNA metylering deteksjon i TCGA kohort
for å validere ZNF DNA metylering og dens korrelasjon med uttrykk i ulike HNSCC kohorter ble Illumina infinium HumanMethylation450 BeadChip matrise og RNA-Seq data lastet ned og analysert fra Kreft Genome Atlas (TCGA) HNSCC kohort, som inneholder 279 HNSCC svulster, inkludert 36 HPV +, med matchet normale prøver. ZNF DNA metylering var minimal i TCGA normale prøver (S3 Fig og S10 Table), i overensstemmelse med funn og validering kohort data. Alle tre ZNFs hadde sterk negativ korrelasjon av DNA metylering og uttrykk, spesielt
ZNF420 plakater (S3 fig). Spesielt, ut av alle DNA metylering sonder tilgjengelige fra TCGA, prober innenfor
ZNF420
arrangøren hadde den høyeste frekvensen av DNA metylering i HNSCC prøver med minimal metylering deteksjon i normale prøver. Samlet, observerte vi en høy samsvar mellom funn, validering og TCGA kohorter for påvisning av ZNF arrangøren metylering ved hjelp av fire ulike teknikker for DNA metylering deteksjon (S9 tabell).
ZNF DNA metylering deteksjon som potensielle HNSCC biomarkører
for å teste ytelsen til utviklede QMSP analyser for ZNFs for påvisning av DNA metylering i kroppsvæsker, matchet spytt skyll prøver fra HNSCC validerings kohort pasienter ble brukt. Sammenligning av DNA-metylering signaler i spyttkylle prøver av HNSCC og ikke-kreft pasienter viste at spesifisiteten av den kombinerte ZNF panelet for å detektere HNSCC i slike kroppsvæsker var 100% (95% CI: 89.9% – 100%), og den sensitiviteten var 22% (95% KI: 12,3% – 34,73%) (tabell 3). Spesielt gjorde utforskning av ZNF metylering sammenheng med kliniske data av ulike statistiske analyser ikke viser noen signifikante sammenhenger.
Diskusjoner
Til tross for utviklingen av høy gjennomstrømning teknologier og identifisering av lovende DNA-metylering markører, ingen har HNSCC biomarkør for tiden blitt akseptert for klinisk påvisning og overvåking. En viktig bekymring i nylig foreslåtte HNSCC biomarkører er den høye falskt positive. Som HNSCC er en svært heterogen sykdom, er det vanskelig å definere en enkelt biomarkør med både høy sensitivitet og spesifisitet [10, 11, 25]. Mange forslag biomarkører har rimelig sensitivitet, men relativt lav spesifisitet, og kombinasjoner av disse biomarkørene vil trolig føre til økt forekomst av falske positiver [25]. Bruk av konvensjonelle statistiske metoder kan undervurdere heterogene endringer i malignitet; Men kan disse utfordringene løses ved hjelp av nyutviklede avvikende analyse tilpasset fra COPA. Så vidt vi vet, er dette den første publiserte verk som benytter avvikende analyse for DNA metylering biomarkør utvikling. Mens ZNF gruppe kandidater undersøkt i dette arbeid forutsatt 100% spesifisitet, men ytterligere undersøkelser kan øke følsomheten ved å validere flere metylerte gen-kandidater for utvikling av en multi-gen-DNA-metylering baserte panel av biomarkører HNSCC.
Det er en rekke publikasjoner som bruker høy gjennomstrømming DNA metylering analyse, men mange har begrenset kohort størrelser [11-13]. Denne studien var i stand til å bruke en tidligere utgitt kohort bestående av 44 svulsten og 25 normale kontroller for oppdagelsen av potensielle denaturert biomarkører. Videre biomarkører ble i tillegg validert i et større selvstendig kohort (med 59 tumorprøver) og i TCGA (279 tumorprøver). Bruken av Illumina 27 DNA metylering array, som har vært brukt med hell av andre [10-14], tillatt for definisjonen av svært spesifikke potensielle biomarkører for HNSCC. Det er imidlertid erkjent at mer omfattende DNA-metylering plattformer kan muliggjøre oppdagelse av et større antall kandidat forandringer.
Korrelasjon av metylering, og uttrykket er et kraftig verktøy som ble anvendt i denne studie for å identifisere biologisk relevante metylering endringer sannsynlig inntreffe tidligere i kreftutvikling [10, 14]. Bare metylering endringene som skjer tidligere i svulst utvikling vil gi rom for utvikling av senere genuttrykk endringer. DNA metylering endringer som ikke korrelerer med genuttrykk ble eliminert for å definere en mer fokusert panel av 24 kandidat metylert genet biomarkører. Videre korrelasjon av DNA metylering med uttrykk fra tilgjengelige genuttrykk rekke bidrar til å redusere enkelt plattform bias. Flere validerings trinn ble utført i denne studien som inkluderte totalt tre kullet HNSCC prøver, samt fire forskjellige deteksjonsteknikker for DNA-metylering (Illumina arrayer 27 og 450, bisulfitt sekvense og QMSP) og tre forskjellige teknikker for genekspresjon (Affymetrix array, RNA-Seq fra TCGA og QRT-PCR). Konsistente resultater ble observert mellom ulike kohorter og teknikker (S9 Table). Disse validerings skritt bekreftet høy spesifisitet og pålitelighet av de oppdagede ZNF DNA metylering baserte biomarkører for HNSCC.
Det ble observert Høyere nivåer av arrangøren metylering i HPV-pasienter i flere antatte tumorsuppressorgener inkludert Sink Finger familiemedlemmer, konsekvent
