Abstract
For å utforske mangfoldet og konsistensen av signalveier som regulerer svulst celle migrasjon, vi valgte tre humane tumorcellelinjer som utvandret etter behandling med EGF. Vi kvantifisert deretter effekten av femten inhibitorer på nivåene av ekspresjon eller fosforylering nivåene av ni proteiner som ble indusert av EGF stimulering i hver av disse cellelinjene. Basert på data oppnådd i denne studien og kjemisk-biologisk antagelser, utledet vi celle migrasjonsveier i hver tumor cellelinje, og deretter sammenlignet med dem. Som et resultat, har vi funnet at både MEK /ERK og JNK /c-Jun banene ble aktivert i alle de tre trekkende cellelinjer. Videre ble GSK-3 og p38 funnet å regulere PI3K /akt banen i bare EC109 celler, og JNK ble funnet å crosstalk med p38 og Fos relaterte banen i bare TT celler. Til sammen kan våre analysesystem lett å skille mellom vanlige og celletypespesifikke trasé ansvarlig for svulst celle migrasjon
Citation. Magi S, Saeki Y, Kasamatsu M, Tashiro E, Imoto M (2014) Chemical genetisk baserte Pathway Analyser for epidermal vekstfaktor-mediert signalering i Migrere kreftceller. PLoS ONE 9 (5): e96776. doi: 10,1371 /journal.pone.0096776
Redaktør: Laszlo Buday, ungarske Academy of Sciences, Ungarn
mottatt: 10 november 2013; Godkjent: 11 april 2014; Publisert: 12 mai 2014
Copyright: © 2014 Magi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in-Aid for Utfordrende Utforskende forskning og JSP Fellows, departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi, Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
celle~~POS=TRUNC migrering~~POS=HEADCOMP er sentralt i mange fysiologiske prosesser, inkludert embryonisk utvikling, sårheling, immunresponser, samt tumorcelleinvasjon og metastase [1]. Når en tumorcelle trekk er flere signalveier initiert gjennom reseptor-tyrosin-kinaser (RTK), G-protein-koblede reseptorer (GPCR), integriner, og andre reseptorer. Et kjent eksempel på en RTK er den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR), som aktiveres ved binding av dens ligand, epidermal vekstfaktor (EGF) [2]. Aktiveringen av EGFR fører til aktivering av en eller flere mellomsignaleringsnett grener som regulerer celle motilitet, slik som det ekstracellulære-regulerte kinase (ERK) pathway [3], den fosfoinositid 3-OH-kinase (PI3K) pathway [4], Janus kinase (Jak) veien [5], c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) vei, og p38 sti [6], [7].
kjerne~~POS=TRUNC elementene~~POS=HEADCOMP i den intracellulære migrasjon-signalering nettverk er påvist i tidligere studier. Det er imidlertid sannsynlig at signalmolekyler som regulerer cellemigrering i en kreftcelle ikke kan regulere cellemigrering med andre genetisk distinkte kreftceller. Flere tidligere rapporter har antydet at hver type kreftcelle initierer migrasjon i forskjellige sammenhenger ved bruk av distinkte molekylære repertoar, selv om den samme grunnleggende prosessen av cellemigrering indusert [8], [9]. Derfor forstå mangfoldet og generelle i signalveier som regulerer svulst celle migrasjon i ulike celletyper er viktig ikke bare for grunnleggende forskning på celle migrasjon, men også for utvikling av anti-metastatiske anti-svulst narkotika.
for å løse dette problemet, vi tidligere undersøkte effekten av små molekyl hemmere på ti cellemigrasjon systemtyper. Vi skilt mellom de felles og celletypespesifikke signaler som er ansvarlige for cellevandring [10]. Tidligere forskning har indikert hvilke molekyler er faktisk er involvert i cellemigrering av hver kreftcelletype. Imidlertid signalerings nettverk av disse molekylene som regulerer cellemigrering uklare. I denne rapporten for å løse dette problemet, benyttet vi en tilnærming som kombinerer kjemiske genetikk og systembiologi, som etter hvert har blitt anerkjent som en nyttig metode for å utlede signalveien nettverk [11]. I vår forrige rapport, fant vi at tre kreftcellelinjer (dvs. epidermal karsinom A431 celler, esophageal carcinoma EC109 celler, og thyroideakarsinom TT-celler) kjøpt cellemotilitet av EGF stimulering, men kjemosensitivitet cluster analyse viste at A431 celler og EC109 celler er gruppert i det samme område, på den annen side, blir TT celler klassifisert i de forskjellige klyngen. Derfor, i denne studien, for å avsløre mangfold og alminnelighet av EGF-induserte signalveien regulering av cellemigrering i disse tre celler, vi undersøkt kvantitativt effekten av kjemiske inhibitorer av EGF-induserte ekspresjonsnivå eller fosforylering nivået av flere signalmolekyler for å identifisere som signaliserer molekyl virker oppstrøms andre signalmolekyler. Ved å bruke resultatene fra disse eksperimentene, tilordnede vi en cellemigrering bane i hver kreftcellelinje, og sammenlignet pathway kartene for å avsløre nettverkstopologi som enten er felles for alle kreftceller eller spesifikke for visse celletyper.
resultater
de forskjellige aktiveringsmønstre EGF signale blant tre kreftcellelinjer
det første vi oppdaget fosforylering eller uttrykk for signalmolekyler indusert av EGF i tre kreftcellelinjer enn en gang kurs (Figur 1 og S1). Autofosforylering av EGF-reseptoren og påfølgende EGF-indusert fosforylering av p38 ble begge observert i alle cellelinjer etter 5 min etter stimulering EGF, noe som er velkjent. Økningen i ekspresjon av c-Fos og fosforylering av c-Jun ble observert i alle cellelinjer 1 time etter at EGF-stimulering. På den annen side er flere andre molekyler viste forskjellige tidsavhengig aktivering profiler mellom de tre kreftcellelinjer. For eksempel ble fosforylering av Akt (p-Akt, S473 og T308 rester) induseres mellom 5 minutter og 1 time etter EGF-stimulering i EC109 celler og TT-celler. Imidlertid fosforyleringen nivåene av p-Akt (S473) og p-Akt (T308) på A431-celler var noe konstant, selv etter at EGF-stimulering av opp til 12 timer. I tillegg er den relative intensitet av p-Akt (T308) viste en maksimal intensitet 5 min etter EGF-stimulering i TT-celler, men etter 1 time i EC109 celler. Mønsteret av ERK-fosforylering (p-ERK) er også forskjellig blant de tre kreftcellelinjer. ERK ble transient fosforyleres av EGF-stimulering i alle tre celler, mens dens topp ble observert 5 minutter etter EGF-stimulering i A431-celler og EC109-celler, og etter 1 time i TT-celler. Ekspresjonsnivået av EGFR begynte å avta etter EGF stimulering i EC109 celler og TT-celler, men ikke i A431-celler.
A431-celler, EC109 celler, og TT-celler ble stimulert med EGF (30 ng ml
-1) til angitt tid og de totale cellelysatene ble underkastet western blotting. A.U., vilkårlig enhet normalisert ved intensiteten av aktin. Midlene og SDS av tre uavhengige eksperimenter er vist. Grafen farger representerer hver cellelinje data: A431 celler (rød), EC109 celler (grønn), og TT-celler (blå). Den stiplede linjen viser at EGF stimulering ikke føre til en betydelig endring av A.U. av hvert molekyl (En-veis ANOVA). Originale Immunoblotanalyse bilder er vist i figur S1.
Effektene av migrasjons hemmere på EGF-indusert migrering signal
Deretter undersøkte vi effekten av 15-hemmere, som påvirket evnen til celler til å migrere i vår tidligere rapport [10], på EGF-indusert fosforylering eller ekspresjon av disse signaliseringsmolekyler ved dette tidspunkt som viser den høyeste intensitet av hver signaleringsmolekyl som antydet med tidsforløpet data (Tabell S1) i hver kreftcellelinje ( Figur S2). Tabell S2 viser navnene og de eksperimentelle anvendte konsentrasjoner av de kjemiske inhibitorer av signaltransduksjon brukt i denne studien, og deres virkningsmåter. Immunoavtrykket bildene i fig S2 omfatter bånd for hver av fire tilstander: negativ kontroll (EGF – og inhibitor -, spor 1), positiv kontroll (EGF + og inhibitor -, spor 2), både EGF og inhibitor-behandlet tilstand (EGF + og inhibitor +, spor 3), og inhibitor-behandlet tilstand (EGF – og inhibitor +, spor 4). For å kvantifisere effekten av inhibitorer, så normalisert vi signalintensiteten slik at spor 1 (dvs. ikke-behandlede tilstand) ble betegnet som 0, og felt 2 (dvs. EGF-behandlet tilstand) ble betegnet 1. På grunnlag av disse standardene, kvantifisert vi den relative signalintensiteten av baner 3 og 4, og til slutt fikk vi kvantitative datasett av effekten av kjemiske inhibitorer på EGF-indusert migrering signalisering i hver cellelinje (figur 2).
Varme kart skildre effektene av små molekyl hemmere på EGF-indusert signalisering i A431-celler (øverst), EC109 celler (i midten), og TT-celler (nederst). Data ble normalisert ved sentre ikke-treat tilstand som 0, og skalering EGF-behandlet tilstand til 1. Alle cellelinjer ble behandlet med EGF etter forbehandling med inhibitorer i 15 minutter. Etter den angitte tid, ble cellene samlet opp og underkastet Western blotting. AMD; Actinomycin D, CHX; Cycloheximide, HMA; Herbimycin A. Konsentrasjonen av kjemiske inhibitorer er oppført i Tabell S2. Originale Immunoblotanalyse bilder er vist i figur S2.
Fradrag for migrasjon signalisering i tre kreftcellelinjer
Vi deretter forsøkte å utlede signalnettverk regulere cellemigrasjon i hver kreftcellelinje basert på kjemosensitivitet profilene erholdt på ekspresjonen status av EGF-induserte signalmolekyler. På området kjemisk biologi, kan en signalveien utledes ved bruk av konseptet beskrevet i figur 3 (se også, eksperimentelle fremgangsmåter). For å avgjøre om hemmere opprørt de signalmolekyler eller ikke, vi definert ± 0,5 som en terskel. I tilfellet med figur 3a, MEK-inhibitor U0126 trykkes den EGF-induserte fosforylering av ERK (p-ERK) med mer enn 50%. I slike tilfeller vi definert to positive signal regler; en fra EGFR til MEK, og den andre fra MEK til p-ERK. I tilfellet med figur 3b, den PI3K-inhibitor LY294002 øket EGF-indusert c-Fos-ekspresjon av mer enn 50%. I slike tilfeller vi definert at det eksisterer en positiv relasjon regulering fra EGFR til c-Fos og en negativ regulering forhold fra PI3K til c-Fos. I tilfellet på figur 3c, er GSK-3-inhibitor SB415286 øket c-Jun ekspresjon uten EGF stimulering. I slike tilfeller vi definert at det eksisterer en positiv relasjon regulering fra EGFR til c-Jun og en negativ regulering forhold fra GSK-3 til C-juni På denne måten, basert på semi-kvantitativ profil (figur 2 og konseptet beskrevet i figur 3), utledet vi et signaleringsnett for hver kreftcellelinje som et signert rettet graf (figur 4). EGF-indusert migrering banen i A431-celler besto av 19 noder og 39 kanter (figur 4A), at banen i EC109 celler besto av 22 noder og 62 kanter (figur 4b), og reaksjonsveien i TT-celler besto av 21 noder og 51 kanter (figur 4c). Grunnen til at antallet veier i A431-celler er mindre enn i de andre to cellelinjene kan være at nivåene av p-Akt (T308) og p-Akt (S473) ikke kunne bli evaluert i A431-celler.
Detaljert beskrivelse presenteres under resultatene og eksperimentelle prosedyrer delen.
EGF-indusert migrering signalnettverk i (a) A431 celler, (b) EC109 celler, og (c) TT celler. Terskelen ble satt til ± 50% av positiv kontroll. Kanten fargen er bestemt basert på skiltet kanter; rødt indikerer positiv signal og blått indikerer negativ signalering. Størrelsen av noden angir antall forbindelseskanter. Fargen på noden angir antall utgangs veier: a. Gradient fargeskala fra grønt til rødt, interpolert over gul
Sammenligning av signalveier i hver kreftcellelinje
Basert på følgende spredningsveier kartene, ekstrahert vi den felles struktur av signalveier for cellemigrering i alle tre kreftcellelinjer som ble undersøkt i dette studiet. Figur 5a viser den felles topologien blant de tre cellelinjer. Denne felles reaksjonsvei omfatter MEK /ERK /c-Fos veien og JNK /c-Jun vei, som har begge blitt vidt undersøkt innen cellevandring [6], [7], [12], [13]. Vi fant også at MEK regulert uttrykk nivåer av c-Fos og P21, og at PI3K trykt uttrykket nivåer av c-Fos i de tre kreftcellelinjer. På den annen side, andre EGFR-regulerte signaler slik som ROCK og CysLT1 ikke har noen utgangsveier, noe som tyder på at nedstrømssignalene til disse molekylene, kan variere mellom hver cancercellelinje. Deretter evaluerte vi de spesifikke strukturene av migrasjonsrelaterte signalbaner i hver av cancercellelinjer (figur 5b~d). Den spesifikke pathway i A431 celler inneholder bare 11 baner, inkludert p-JNK → c-Jun uttrykk og 5-lipoksygenase (5-LO) → c-Fos. Antallet av spesifikke baner i EC109 celler og i TT-celler er 24 og 13, henholdsvis, noe som indikerer at omtrent en femtedel til en tredjedel av baner i disse cellene er celle-type-avhengige reaksjonsveier.
(a ) Felles EGF-indusert signalnettverk mellom tre kreftcellelinjer. (B~d) Spesifikk EGF-induserte signaleringsnett i (b) A431-celler, (c) EC109 celler, og (d) TT celler. Kanten fargen er bestemt basert på skiltet kanter; rødt indikerer positiv signal og blått indikerer negativ signal.
I en tidligere studie, spådde vi at lignende trasé indusere og regulere cellemigrasjon i A431 celler og EC109 celler, men disse banene kan være forskjellig fra TT celler [10]. For å klargjøre forskjellen i signalveier mellom de to gruppene, vi deretter sammenlignet de signalveier av EC109 celler og TT celler som inneholder alle de samme nodene (figur 6). Figur 6a viser de overlappende reaksjonsveien topologi i begge cellelinjer. Denne veien kartet omfatter PI3K → p-Akt, JNK → p-Akt (S473) og ROCK → p-p38, noe som tyder på at disse banene spille en konsekvent rolle i celle migrasjon. Figur 6b, presenterer c de spesifikke pathway topologier i EC109 celler og TT celler, henholdsvis. Til sammen 29 baner (47% av trasé i EC109 celler), for eksempel MEK → c-Jun, GSK-3 → p-Akt (S473) og HMG-CoA → Pakt (T308), er spesifikke for EC109 celler, og 18 baner (35% av trasé i TT-celler), inkludert p-JNK → p-p38, og ROCK → c-Fos, er spesifikke for TT celler. Fosforylering av p-Akt er oppregulert ved p38, GSK-3, og HMG-CoA i EC109 celler, mens det var ingen spesifikk positiv vei til p-Akt i TT-celler. På den annen side er JNK kreves for økning av både c-Fos ekspresjon og fosforylering av p38 i TT-celler, mens en slik regulering ikke ble observert i EC109 celler. Videre er det en EGFR-p38-positiv tilbakekoplingssløyfe i TT-celler, men det er ingen slike reaksjonsveien i EC109 celler. Disse resultater indikerer at aktivering av Akt kan være avgjørende for cellemigrasjon av celler EC109, men Akt aktiveringsveien avhenger av kreft celletyper. Videre kan stress responsive MAPK veien være dominerende i regulatorisk vei av celle migrasjon av TT celler.
(a) Felles signale nettverk mellom EC109 celler og TT celler. (B) Spesifikk EGF-induserte signaleringsnett i EC109 celler. (C) Spesifikk EGF-induserte signaleringsnett i TT-celler. Kanten fargen er bestemt basert på skiltet kanter; rødt indikerer positiv signal og blått indikerer negativ signal.
Diskusjoner
I denne studien har vi kartlagt de regulatoriske signalveier for cellemigrasjon i epidermal karsinom A431 celler, spiserørskreft EC109 celler og thyroideakarsinom TT celler. Ved å sammenligne dem, avslørte vi de samme virkningsmekanisme som i de tre cellelinjer og identifiserte celletypespesifikke signalveier, basert på et kjemisk og genetisk systembiologi tilnærming. For å oppnå dette målet, kan vi for det første sammen den tidsavhengige aktivering mønstre av signalmolekyler i hver cellelinje som er involvert i EGF-indusert cellemigrering. Aktiverings mønstre av enkelte signaliseringsmolekyler er delvis forskjellig mellom de tre kreftcellelinjer (figur 1). For eksempel, aktiverings mønstre av c-Fos og p-p38 er ganske lik blant de tre cancercellelinjene som ble testet, mens mønstre av p-ERK og p-c-Jun er forskjellige. De relative intensitetene av vedvarende p-ERK og p-c-Jun i TT-celler er høyere enn de i A431-celler og EC109 celler. Interessant nok er denne forskjellen i overensstemmelse med tidligere rapporterte klassifiseringer av de kjemosensitivitet profiler av disse tre cellelinjer [10], som tyder på at vedvarende ERK og c-Jun-fosforylering er involvert i celle-typespesifikke trasé for cellemigrering in TT celler. Vurderer en positiv feedback mekanisme som vedvarende JNK aktivitet kan fremme ERK signaliserer gjennom IRS-2 [14] ble rapportert, kan disse mekanismene opererer også i TT celle migrasjon. I motsetning til dette ble fosforyleringen av Akt indusert av EGF stimulering i EC109 celler og TT-celler, men fosforyleringen nivåene av Akt var noe konstant i A431-celler etter stimulering EGF. Tidligere rapporterte vi at EGF-indusert migrering av A431-celler undertrykkes ved tilsetning av PI3K-inhibitorer [10]. Derfor, selv om EGF ikke signifikant induserer fosforylering Akt, steady-state fosforylert Akt og aktivert som kreves for den EGF-induserte migrering av A431-celler. En annen forskjell i tidsforløpet data mellom de tre cancercellelinjer er vist med ekspresjonsnivået av EGFR. EGF stimulering redusert ekspresjonsnivået av EGFR i EC109 celler og TT-celler, men ikke i A431-celler. Når EGF bindes til EGFR, er EGFR kjent for å være raskt internalisert fra celleoverflaten via flere veier, deriblant klatrin-belagte groper [9], [15]. Internalisert reseptorer er enten resirkuleres til celleoverflaten eller transporteres til lysosomer for degradering. Det er velkjent at skjebnen til reseptorene er kontrollert av en rekke proteiner ved internalisering, for eksempel CBL og LRRK1 [16], [17]. Dermed kan våre resultater indikerer at regulering av EGF-reseptor-induserte nedbrytning er forskjellig blant de tre kreftcellelinjer, og denne forskjellen dikterer den vedvarende aktivering av nedstrøms signalerings mål.
Regulerings trasé for cellemigrasjon i hvert cancer cellelinje ble bestemt ved å undersøke effekten av cellemigrerings inhibitorer på signaloverføringsmolekyler (figur 4). Den overlappende sti topologi i alle tre testede cellelinjer omfatter JNK → p-c-Jun, som er spådd som en felles regulator i en tidligere studie. Dette tyder på at reguleringssignalering for kreft celle migrasjon av JNK gjennom fosforylering av c-Jun er faktisk en vanlig mekanisme i alle typer kreftceller. Fordi vi ikke kunne oppdage betydelig oppregulering av p-Akt i EGF-stimulerte A431-celler i denne studien, kan EGF signalveien kartet i A431-celler ikke omfatte regulering av p-Akt og derved omfatter færre noder og kanter enn det i EC109 celler og TT celler i vår analysemetode. Derfor må en tolkning av sammenligningen mellom sti Kartene blant tre kreftcellelinjer gjøres med forsiktighet.
For å diskutere og bekrefte resultatene av klyngeanalyse i vår forrige rapport [10], vi endelig i forhold kartet veien ansvarlig for cellemigrasjon mellom EC109 celler og TT-celler, og bestemmes den overlappet eller celletype-spesifikk topologi (figur 6). Akt fosforylering bølger i EC109 cellene er langsommere enn i TT celler (figur 1 og tabell S1), noe som tyder på at flere mellom proteiner regulere Akt fosforylering i EC109 celler enn TT celler. Faktisk, nivået av Akt-fosforylering ble oppregulert ved p38, GSK-3, og HMG-CoA i EC109 celler, mens disse banene ikke ble inkludert i TT-celler (Figur 6b, c). På den annen side, ERK fosforylering bølger i TT-celler er langsommere og mer sammenhengende enn i EC109 celler (Figur 1 og Tabell S1), noe som tyder på at flere mellomliggende proteiner regulere ERK-fosforylering i TT-celler enn EC109 celler. Men vi kunne ikke påvise noen bestemt regulering, som kan opprettholde fosforylering nivå av ERK i TT celler. Vi mener at et annet molekyl vi ikke vurdere i denne studien kan bidra til vedvarende ERK fosforylering. Disse forskjeller i den EGF-induserte signalveien kan reflektere forskjeller i modus for cellevandring basert på cellemorfologi. I vår forrige undersøkelse fant vi at EC109 cellene flyttet samtidig beholde celle-celle kontakter (kollektiv migrasjon), men TT celler flyttet som enkeltceller (individuell migrasjon) [10]. I lys av de ovenfor angitte resultater, er det sannsynlig at kreftcellene beveger seg som en enkelt celle når MAPK-reaksjonsveien er kontinuerlig aktivert, mens celler som migrerer sammen og opprettholde celle-celle adhesjon når PI3K /Akt veien blir kontinuerlig aktiveres av p38 og GKS- 3. Disse forskjellige roller MAPK og PI3K trasé for migrasjons moduser støttes også av følgende tidligere rapporter. MAPK aktivering dermed induserer RhoA aktivering og epitelial-mesenchymale-overgang, mens PI3K aktivering undertrykker RhoA aktivitet i tykktarmskreft [9]. I tillegg er PI3K rekruttert til adhesjons komplekser [18] hvor deres aktivering via cadherin signaleringsvirkninger cadherin funksjon og styrker celle-celle adhesjon [19], [20]. Dette kan innebære PI3K-indusert Rac1 aktivisering, fordi E-cadherin stimulert aktin cytoskeletal omorganisering krever Rac aktivering og PI3P-aktivert GEF Tiam1 [21].
Til sammen vår kjemisk genomisk basert pathway analyse av tre kreftcelle linjene viser konsistens og variasjon i EGF-indusert regulerende signalveien for å regulere kreft celle migrasjon mellom celletyper ved hjelp av en kombinasjon tilnærming av kjemisk biologi og systembiologi. Spesielt GSK-3 og p38 regulere p-Akt i bare esophageal karsinom EC109 celler, på den annen side regulerer JNK p38 og Fos relaterte reaksjonsveien bare i thyroid karsinom TT celler. Disse funnene tyder på at noen celletype-spesifikke signalveien regulerer cellemigrasjon ville være terapeutiske molekylære mål for spesifikke kreftmetastaser celletype: GSK-3- og p38- relaterte trasé i esophageal carcinoma, og stress responsive-MAPK-relaterd trasé i skjoldbruskkjertelen carcinoma . Men for å forstå konsistens og variasjon av regulatoriske signalveien mer presist, er det flere saker som vi bør forholde seg til i fremtiden. Selv om vi brukte en inhibitor mot en signalmolekyl i denne studien, bør flere inhibitorer mot en signalmolekyl brukes for å bekrefte spesifisiteten av inhibitorer. Videre bør den tid da vi vurdere virkningene av inhibitorer for EGF-indusert fosforylering eller ekspresjon av disse signaliseringsmolekyler verifiseres. Det bør også utviklet hvordan å skille regulatorisk vei for cellemigrasjon fra at for andre cellulære responser som cellevekst. Likevel, i denne studien, tilbyr vi en ny tilnærming for å forstå egenskapene til kreft celle migrasjon signalering, og åpner muligheten for å avsløre en ny molekylær vei som et mål for kreftbehandling.
Materialer og metoder
Cell Culture
A431-celler (oppnådd fra ATCC CRL-1555) ble opprettholdt i DMEM supplert med 5% kalveserum (CS), 0,1 gl
-1 kanamycin, 100 enheter ml
-1 penicillin G, 0,6 gl
-1 L-glutamin, og 2,5 gl
-1 NaHCO
3. EC109 (begavet fra Dr. Doki, Osaka University, Japan), TT-celler (begavet fra KIRIN firma, Japan) ble opprettholdt i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium 1640 supplert med 5% FBS, 0,1 gl
-1 kanamycin , 100 enheter ml
-1 penicillin G, 0,6 gl
-1 L-glutamin, og 2,5 gl
-1 NaHCO
3. For rutine kulturen, ble cellene inkubert i en standard fuktet inkubator ved 37 ° C i 5% CO
2.
Reagenser
AG1478 (EGFR-inhibitor), rapamycin (mTOR-inhibitor), og Y27632 (ROCK hemmer) ble kjøpt fra Calbiochem. MK571 (CysLT1 inhibitor) ble kjøpt fra Cayman. AA861 (5-lipoksygenaseinhibitor), Actinomycin D (transkripsjon inhibitor), Cycloheximide (Oversettelse hemmer), LY294002 (PI3K hemmer), mevastatin (HMG-CoA reduktase hemmere), MG132 (Proteasome hemmer), SB203580 (p38 inhibitor), SB415286 ( GSK-3-inhibitor), ble SP600125 (JNK-inhibitor), U0126 (MEK-inhibitor), og epidermal vekstfaktor (EGF) innkjøpt fra Sigma. Herbimycin A (HSP90 inhibitor) ble renset fra kulturer av
Streptomyces
sp. i vårt eget laboratorium.
Western blotting
Etter forbehandling med enten bil eller hemmere for 15 minutter, ble cellene behandlet med EGF for den angitte tiden. Celler ble lysert i RIPA-buffer (25 mM Hepes pH 7,8, 1,5% Triton X-100, 1% natriumdeoksykolat, 0,1% SDS, 0,5 M NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 0,1 mM natrium-vanadat, 1 mM PMSF, og 0,1 mg ml
-1 leupeptin) ved 4 ° C med lydbehandling. Lysatene ble sentrifugert og supernatanten ble gjenvunnet. Etter bestemmelse av konsentrasjonen av proteinet i hvert lysat, og koking i et like stort volum ladningsbuffer (150 mM Tris pH 6,8, 30% glycerol, 3% SDS, 15 mg ml
-1 bromfenol fargestoff, og 100 mM 2- p-merkaptoetanol), ble prøvene deretter elektroforese i en polyakrylamidgel. Proteiner ble overført til en PVDF-membran, og immunoblottet. Antistoffer ansatt for immunoblotting var: anti-EGF reseptor-antistoff (# 2232), anti-Akt antistoff (# 9272), anti-fosfor-Akt (Thr308) antistoff (# 9275), anti-fosfor-Akt (Ser473) antistoff (# 9271), anti-c-Jun-antistoff (# 9165), anti-fosfo-p38-antistoff (# 9211), anti-MAPK (ERK 1/2) antistoff (# 9102), anti-fosfo-MAPK (ERK 1/2 ) antistoff (# 9101) (Cell Signaling); anti-c-Fos-antistoff (sc-7202), anti-p38-antistoff (sc-7972), anti-p21-antistoff (sc-397) (Santa Cruz Biotechnology); anti-fosfor-tyrosin antistoff (05-321) (Upstate); anti-fosfor-c-Jun-antistoff (558036) (BD Pharmingen); anti-β-aktin-antistoff (A5316) (Sigma).
Statistisk analyse
Én-veis ANOVA ble anvendt for å bestemme signifikante forskjeller i tidsserier datasett. En Pearson produkt-moment korrelasjonskoeffisient ble benyttet for å bekrefte reproduserbarheten av dataene. Disse statistiske analyser ble beregnet ved hjelp av R (www.r-project.org/).
Nettverk fradrag basert på kjemisk biologi
Den signerte rettet Nettverket ble utledet fra en forskjell i proteinfosforylering eller uttrykk nivåer mellom mock-behandlet og inhibitor-behandlede data, i henhold til regelen vist i figur 3. Denne regelen omfatter tre enkle forutsetninger som ofte brukes i kjemisk biologi: a) at det eksisterer en positiv regulering fra molekyl X til molekyl Y når nivået av molekylet Y i nærvær av både EGF og en inhibitor for X er mer enn 50% lavere enn i den EGF-behandlede tilstand; b) Det foreligger en negativ regulering fra molekyl til molekyl X Y når nivået av molekylet Y i nærvær av både EGF og hemmer av X er mer enn 50% høyere enn i EGF-behandlet tilstand; c) Det foreligger en negativ regulering fra molekyl til molekyl X Y når nivået av molekylet Y i nærvær av inhibitor av X er større enn halvparten av nivået i EGF-behandlet tilstand. Den databehandling som til slutt sender ut pathway informasjon bestå av kilden node, target node, og regulatoriske type (positiv eller negativ) ble utført ved hjelp av R. Denne filen er importert til Cytoscape programvare (www.cytoscape.org/), og signalveien kart ble generert. Sammenligningen av veien topologi ble også utført med Cytoscape avansert nettverk fusjonere plugin.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Representative Immunoblotanalyse bilder presentert i Figur 1. (a) A431-celler, (b) EC109 celler, og (c) TT celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0096776.s001 plakater (PDF)
Figur S2.
Representative Immunoblotanalyse bilder presentert i figur 2. (a) A431 celler, (b) EC109 celler, og (c) TT celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0096776.s002 plakater (PDF)
Tabell S1. .
Evalueringen tidslinje av effektene av hemmere
doi: 10,1371 /journal.pone.0096776.s003 plakater (docx)
Tabell S2.
Sammensatte konsentrasjoner og mål for hemming brukt i denne studien
doi:. 10,1371 /journal.pone.0096776.s004 plakater (docx)
