Abstract
Kombinasjon av immunterapi og kjemoterapi har vist lovende for kreft. Interleukin-7 (IL-7) kan potensielt øke immunresponser mot tumor, mens oksaliplatin (OXP), en platinabasert medikament, kan fremme en gunstig immunmikromiljøet og stimulerer antikreftimmunresponser. Vi evaluerte den anti-tumor aktivitet av IL-7 som kombinerer OXP mot en murine colon carcinoma in vitro og in vivo og undersøkt tumorImmunmikromiljøet for å undersøke hvorvidt den kombinerte behandling innvirkning på de lokale immuncellepopulasjoner. Utnytte lunge og underliv metastasemodeller ved inokulering av mus CT26 tykktarmskreftceller, evaluerte vi den anti-tumor effekten av å kombinere IL-7 og OXP i mus modeller. Tumorimmunmikromiljøet ble evaluert ved flowcytometrisk analyse og immunhistokjemisk farging. Vår studie viste at in vivo administrering av IL-7 kombinert med OXP markert hemmet veksten av svulster i lunge og mage metastase modeller av tykktarmskreft. IL-7 alene hadde ingen effekt på tumorvekst hos mus og IL-7, ikke endret celle-sensitivitet overfor OXP i kultur. Anti-tumoreffekten av å kombinere IL-7 og OXP korrelert med en markert økning i antallet tumor-infiltrerende aktiverte CD8 + T-celler og en markert reduksjon i antall regulatoriske T (treg) celler i milten. Våre data antyder at OXP pluss IL-7-behandling inhiberer tumorcellevekst ved immunregulering i stedet for direkte cytotoksisitet. Våre funn rettferdiggjøre nærmere vurdering av å kombinere IL-7 og kjemoterapi som en roman eksperimentell kreftbehandling
Citation. Gou HF, Huang J, Shi HS, Chen Xc, Wang YS (2014) Chemo-Immunterapi med Oxaliplatin og interleukin-7 Hemmer Colon Cancer Metastase til Mus. PLoS ONE 9 (1): e85789. doi: 10,1371 /journal.pone.0085789
Redaktør: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanita, Italia
mottatt: 16 september 2013; Godkjent: 05.12.2013; Publisert: 21 januar 2014
Copyright: © 2014 Gou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
oksaliplatin (OXP), som er mye brukt i. kolorektal kreft, har nylig blitt funnet å øke immunogenisiteten til kreftceller og indusere immunogene celledød [1]. I tillegg har det blitt funnet at OXP kan forsterke immunrespons mot tumorer ved å redusere regulatoriske /suppressorceller: regulatoriske T (treg) celler og myeloide-avledede suppressorceller (MDSCs) og øke forholdet av cytotoksiske CD8 + T-lymfocytter (effektorceller ) versus immunsuppressive cellepopulasjoner i tumor microenviroment [2], [3], [4].
interleukin-7 (IL-7) er en av de interleukin-2 (IL-2) -relaterte cytokiner som deler og signal gjennom γ-kjeden for å påvirke T-celle proliferasjon, utvikling og homeostase [5], [6], [7], [8]. IL-7 fremstilles ved en rekke av stromale celler i thymus og benmarg, og også ved vaskulære endotelceller, tarmepitelet, keratinocytter, og follikkeldendrittceller [9], [10]. IL-7 representerer en potensiell behandling for å øke T-celle rekonstituering og vaksineeffektivitet som den har forskjellige virkninger på forskjellige undersett av T-celler [11]. IL-7 fremmer også antigen-spesifikk T-celle-cytolytisk aktivitet [12], [13], [14]. IL-7 var gjennomgående like effektiv som IL-2 i å opprettholde T-celler [13], [14]. For eksempel har det blitt vist at tumorcellelinjer transfektert med IL-7-genet redusert T-celle-avhengig tumorgenisitet i murine modeller [15], [16]. Tilsvarende lokal eller systemisk administrering av IL-7 har anti-tumoreffekter ved å styrke immunrespons mot tumorer [17], [18], [19], [20], [21], spesielt når det kombineres med andre immunbehandling. Evnen til å forsterke immunresponsen mot maligne av IL-7 har stor betydning for immunterapi ved behandling av tumorer.
kombinasjon av kjemoterapi med immunresponsmodifiserende midler så som interleukin 2 (IL-2) eller interferon-α (IFN-α), referert til som chemo-immunterapi, har vist lovende antitumoraktivitet til melanom [22], [23]. Cytotoksiske kjemoterapeutiske midler har tradisjonelt vært ansett for å ha immunosuppressive bivirkninger, og være til skade for anti-tumor-immunitet på grunn av deres ikke-spesifikke cytostatiske og cytotoksiske virkninger. Det er imidlertid akkumulere bevis som viser at under visse betingelser noen av disse midler kan påvirke tumor immunologiske microenviroment og stimulere immunresponser mot kreft [3], [4], [24], [25], [26]. Det er en rasjonell utvikling å kombinere disse immun-stimulerende cytotoksiske kjemoterapeutika med immunresponsmodifiser.
Basert på ovennevnte, hypotese vi at kombinasjonen av IL-7 og OXP kan øke deres anti-tumor aktivitet ved å indusere ekspansjon av T-celler og blokkering av T-celle-hemmende baner i svulsten immuno-mikromiljøet. I vår studie, vurderte vi antitumoraktivitet til IL-7 i kombinasjon med OXP mot en murine colon carcinoma in vitro og in vivo og undersøkt tumorImmunmikromiljøet for å undersøke hvorvidt denne kombinerte behandling påvirker lokale immuncellepopulasjoner. Våre data viser OXP pluss IL-7 er signifikant mer effektivt enn IL-7 eller OXP alene for inhibering av tumorvekst in vivo. Våre data tyder på at OXP pluss IL-7 behandling hemmer tumorcellevekst av immunregulering i stedet for direkte cytotoksisitet.
Materialer og metoder
Cell linje
Colon carcinoma cellelinje CT26 ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC). Celler ble rutinemessig dyrket som monolag i 75-cm
2 firkant vevskulturflasker i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 i luft. Kulturmediet inneholdt RPMI 1640 (Life Technologies, Bedford, MA) supplert med 10% FBS, 100 U /ml penicillin. Cellelinjen var mycoplasma gratis.
tumorigenesis modell
Patogen fritt BALB /c (6-8 uker gamle) mus ble kjøpt fra Vital River Laboratory Animal Science and Technology Co Ltd, Beijing. Protokollen ble godkjent av dyreetikk komité Sichuan University. Alle dyreforsøk ble utført under patogenfrie forhold i henhold til institusjonelle retningslinjer.
Før in vivo injeksjon i mus, kreftcellene i eksponentiell vekstfase ble høstet, vasket tre ganger med PBS, telles og fortynnet i denne oppløsning før in vivo injeksjon. Å etablere en lungemetastase modell, totalt 1 × 10
6 CT26 tykktarmskreftceller ble injisert i halevenen av syngene BALB /c mus. Å etablere en magemetastase modell, totalt 1 × 10
6 CT26 tykktarm kreft celler ble injisert intraperitonealt. Tumor-bærende mus ble deretter overvåket for tumorutvikling og progresjon
På dag 6 etter post-tumorinokulasjon hver modell ble randomisert inn i 4 grupper med 8 mus i hver gruppe for videre administrasjon som følger:. Gruppe av kontroll ( fosfatbufferløsning, PBS), gruppe av IL-7, gruppe OXP, og gruppen av IL-7 kombinert med OXP. I magemetastase modell OXP ble gitt ip i en dose på 5 mg /kg hver 3. dag i 12 dager. I metastase modell lunge, ble OXP gitt intravenøst i en dose på 5 mg /kg hver 3. dag i 12 dager. IL-7 (5 ug /dag) ble administrert i.p. daglig i 12 dager.
Dyrene ble avlivet på dag 13 etter første behandling. Metastatisk tumor knuter i subpleural regioner i lungene ble talt under et dissekere mikroskop og vektet. Seeding metastatisk tumor knuter i bukhulen ble talt av nakne øyne og vektet.
Reagenser
Rekombinant humant IL-7 (IL-7) ble kjøpt fra Shanghai PrimeGene Bio-Tech Co., Ltd og fortynnet i sterilt destillert vann. OXP ble kjøpt fra Sanofi-Aventis (Frankrike) og fortynnet i sterile glukose. Fluorescent-konjugert flowcytometri anti-mus antistoffer (Abs) CD4, CD8, CD69, CD11b, CD11c, Gr-1, og isotype-matchet antistoffer ble oppnådd fra BD Pharmingen. F4 /80 ble oppnådd fra BioLegend. Mus Regulatory T Cell Farging Kit ble hentet fra eBioscience. Immunhistokjemi antistoffer par for murine CD8 ble kjøpt fra ABGENT. Ki-67 ble kjøpt fra Novus Biologicals, og apoptose Detection Kit ble kjøpt fra (Promega Corp., Madison, WI).
3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5- difenyltetrazoliumbromid assay (MTT)
3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, ble 5-difenyltetrazoliumbromid 96-brønns plate test som benyttes for å bestemme de relative mengder av celler i brønner etter eksponering for ulike agenter. De CT26 celler ble sådd ut ved 1,000cells /brønn i 96-brønners plater, og deretter inkubert i ytterligere 24 timer. Fem replikate brønner ble benyttet i disse analyser. Deretter forskjellige konsentrasjonsgradienter av IL-7 (25 ng /ml, 50 ng /ml, 75 ng /ml, 100 ng /ml) og OXP (10 pmol /l, 30 pmol /l, 50 pmol /l) ble tilsatt i brønner og inkubert i 24 timer, 48 timer i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C. Alle analyser inkludert hensiktsmessige kontroller. Ved slutten av inkubasjonen ble levedyktige celler kvantifiseres ved bruk av 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT). I korthet, ble 20 ul av MTT-stamløsning (5 mg /ml) tilsatt til hver brønn av en analyse. Etter 2 timers inkubasjon ble mediet fjernet og omdannet fargestoff ble solubilisert med DMSO (150 pl /brønn). Absorbansen av omdannet fargestoff ble målt ved en bølgelengde på 540 nm. Omdannelsen til celletallet var basert på en standardkurve. Prosentandelen av celleoverlevelse (overlevelse) ble beregnet ved å dividere absorbansverdien av den behandlede prøve med den for den ubehandlede kontroll i hver gruppe.
flowcytometrisk analyse
Ved de angitte tidspunkter , svulstene og miltene ble høstet fra mus, hakket opp i små fragmenter og mekanisk dispergert i 3-5 ml kald RPMI-medium. Tumorene Cellene ble spaltet i 1 mg /ml kollagenase IV (Sigma), 0,1 mg /ml DNase (Sigma) i RPMI 1640 ved 37 ° C i 1 time. Miltcellene ble tømt av erytrocytter ved osmoticlysis og justert til en konsentrasjon på 10 x
5 celle i 100 ul PBS. Etter dette ble enkeltcellesuspensjoner av tumorceller og splenocytter farget i 30 minutter på is med 1 ug av de følgende fluorokromkonjugerte merkede antistoffer, CD4, CD8, CD69, CD11b, CD11c, F4 /80, eller passet isotypy kontrollantistoffer og deretter vasket en gang med PBS. Intracellulær farging for foxp3 ble utført ved hjelp av musen regulatoriske T cellefarging kit, i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene ble kjøpt på et FACSCablibur flowcytometer (BD Biosciences), og 10,000_20,000 gated hendelser ble samlet. De innsamlede data ble analysert ved FlowJo programvare 7.6. I cytometri analyse, vi portdata med FSC og SSC bivariate plot, deretter tegne en region rundt klyngen av lymfocytter og deretter gate fluorescens histogrammet på dem. Denne port, i FSC vs SSC vis, når etablert, blir så brukt til analyse av alle etterfølgende prøver. Tre mus fra hver gruppe ble drept for å evaluere immunocytt CD markør uttrykk.
immunhistokjemisk farging
De skåret svulster faste i 10% formalin ble innstøpt i parafin og seksjonert i 4 um tykkelse. Seksjonene ble anvendt for analyse av ekspresjon av CD8, og Ki-67 immunhistokjemi ved farging med relevant monoklonalt antistoff. Prøvene ble immunostained av standard merket streptavidin-biotin protokollen. Kort sagt ble deler av 4 um som er montert på silaniserte objektglass og tillatt å tørke over natten ved 37 ° C. Etter deparaffinization og gjenfinning antigen, ble vevssnitt inkubert med CD8-antistoff (1:250 fortynning) og Ki-67 antinbody (1:200 fortynning) ved 37 ° C i 1 time og deretter ved 4 ° C over natten. Snittene ble deretter inkubert med biotinylert geit-anti-immunoglobulin G (Zymed Laboratories Inc., USA) og deretter inkubert med pepperrot-merket streptavidin (Zymed Laboratories Inc., USA). 3, 3′-diaminobenzidin ble anvendt som kromogen og hematoxylin som motfarget. Tre mus per gruppe ble analysert.
Evaluering av immunhistokjemiske fargings
Graden av CD8 + infiltrasjon ble observert i mer enn 10 uavhengige høyeffekts (× 200) mikroskopiske felt for hver vevsprøve. De fem mikroskopiske felt med den mest tallrike fordeling ble valgt innenfor kreftcellen reir. Det gjennomsnittlige antall CD8 + T-celler ble tellet i de fem mikroskopiske felt [27]. Bestemmelse av proliferativ aktivitet av Ki-67 imunohistochemistry ble utført kvantitativt ved telling av immunreaktive tumorceller i de mest intense fargeområder. I hver prøve, ble et minimum på 1000 tumorceller mottok de mikroskopiske områder som viser den høyeste grad av farging, og resultatene ble uttrykt som prosentandelen av positive celler [28].
terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick ende merking (TUNEL) analyse
Snittene, de samme som de som brukes for immunkjemi analyse, ble anvendt for in-situ analyse av apoptose ved TUNEL. Tunel farging ble utført med en in situ apoptotisk celle deteksjon kit følge produsentens protokoll. Platene ble observert under en Olympus fluorescens mikroskop koblet til et CCD-kamera. Bildene ble tatt inn under × 10 og × 40 mål ved hjelp av Image-Pro-programvaren. Apoptotiske indeksen ble bestemt ved å beregne gjennomsnittlig antall kjerner apoptotiske celler i 5 høyeffekts mikroskopiske felt (× 400) er valgt fra en sentral region i levedyktige kreft områder, unngå områder med nekrose [29].
Statistisk analyse
PRISM versjon 5.0 (GraphPad programvare) ble brukt for å tegne grafer og statistisk analyse. Resultatene er rapportert som gjennomsnitt ± standardfeil (SE). Dual sammenligninger ble gjort ved hjelp av uparet Student
t
test.
P
0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
In vitro
effekten av OXP pluss IL-7 på veksten av CT26. cellene
å bestemme hvorvidt IL-7 direkte påvirker veksten av CT26 celler eller forbedrer deres følsomhet for OXP in vitro effekt av IL-7 alene og av IL-7 pluss OXP på CT26 celler ble bestemt i kultur . CT26 celler ble dyrket in vitro med IL-7 (25 ng /ml, 50 ng /ml, 75 ng /ml, 100 ng /ml) alene eller i kombinasjon med OXP ved tre konsentrasjoner fra 10 pmol /ml til 50 umol /ml . De relative antall av levedyktige celler ble så vurdert henholdsvis senere 24, 48 timer. OXP indusert den forventede konsentrasjonsavhengig hemming av cellevekst. Frekvensen av tumorcellevekst var ikke signifikant forskjellig ved en hvilken som helst dosenivå av IL-7 fra de som ble observert i kontrollkulturer. Og tilsetningen av IL-7 har ikke i betydelig grad endrer CT26 cellevekst eller deres følsomhet overfor OXP (fig. 1).
CT26 celler ble dyrket in vitro med IL-7 (25 ng /ml, 50 ng /ml, 75 ng /ml, 100 ng /ml) alene eller i kombinasjon med OXP ved tre konsentrasjoner fra 10 pmol /ml til 50 umol /ml, og de relative antall av levedyktige celler ble bestemt 24 og 48 timer henholdsvis senere. Hver søyle representerer gjennomsnitt ± S.E. (N = 5). en. OXP indusert den forventede konsentrasjonsavhengig hemming av cellevekst. b. IL-7 alene hadde ingen effekt på CT26 cellevekst in vitro. Frekvensen av tumorcellevekst var ikke signifikant forskjellig ved en hvilken som helst dosenivå av IL-7 fra de som ble observert i kontrollkulturer. c og d. Tilsetning av IL-7 ikke vesentlig endre CT26 cellevekst eller deres følsomhet for OXP.
Kombinasjon med IL-7 øker anti-tumor effekt av OXP in vivo
Å undersøke hvorvidt IL-7 kan øke den anti-tumor effekt av OXP i tumor-bærende mus, ble to modeller etablert. Murine CT26 tykktarmskreftceller ble injisert inn i BALB /C mus i.v. å etablere lungemetastase modell og i.p. for å etablere den abdominale metastase modell. Musene mottok følgende behandlinger: PBS; IL-7 (5 ug /injeksjon); OXP (5 mg /kg /injeksjon); og IL-7 (5 ug /injeksjon), kombinert med OXP (5 mg /kg /injeksjon), i henhold til den ovennevnte plan. Musene ble avlivet på dag 13 etter den første behandlingen.
I den metastasemodellen lungen, ble lungene fjernet og veid. De totale antallet lungemetastatiske knuter i under-pleural områder av lungene ble talt under disseksjon omfang. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.E. Resultatene viste tydelig at kombinasjonen av IL-7 og OXP oppnår den beste terapeutiske effekt, som målt ved hjelp av anti-tumor effekt. Som vist på fig. 2a (n = 3), IL-7, når det gis i forbindelse med OXP, hadde større enn 2,55 ganger, 1,73 ganger, 2,07 ganger reduksjon i antallet av metastatiske noduler i lungene sammenlignet med PBS, IL-7 og OXP grupper henholdsvis. Lungene ble vektet. Forholdsmessige reduksjoner i lungevekt ble også observert. Som vist på fig. 2b, IL-7, når det gis i forbindelse med OXP, hadde større enn 1,88 ganger, 1,52 ganger, 1,82 ganger reduksjon i vektene i lungene sammenlignet med henholdsvis PBS, IL-7 og OXP grupper. Behandling med IL-7 alene resulterte i en signifikant reduksjon i lungevektene og en liten, ikke signifikant reduksjon i antallet av metastatiske noduler i lungene sammenlignet med PBS. Administrasjonen av OXP alene ikke ga noen anti-tumor effekt i forhold til PBS i lungen metastase modell.
På dag 6 etter tumorinokulasjon hver modell ble randomisert inn i 4 grupper med 8 mus i hver gruppe for videre administrasjon som følger: PBS, IL-7, OXP, IL-7 i kombinasjon med OXP. Metastatisk tumor knuter i under-pleural områder av lungene ble talt under et disseksjon mikroskop. De metastatisk tumor knuter i bukhulen ble talt av nakne øyne og vektet. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.
P
verdier: *,
P
0,05, **,
P
0,01; en. Metastatisk tumor knuter nummer i lungemetastase modell. b. Vekt av lungene i lungemetastase modell. c. Metastatisk tumor knuter nummer i magen metastase modell. d. Vekt av tumor knuter i magen metastase modell. Alle av a, b, c, d viser IL-7, når det gis i forbindelse med OXP økte antitumoreffekt in vivo sammenlignet med PBS, IL-7 og OXP grupper indolene administrering av IL-7 alene resulterte i en signifikant reduksjon i lungevektene og en liten, ikke signifikant reduksjon i det endelige tumorvolum sammenlignet med PBS i lungemetastase modell. Administrasjonen av OXP alene ikke ga noen anti-tumor effekt i forhold til PBS i lungen metastase modell. I mage implantasjonsmodell, administrering av OXP alene resulterte i en betydelig reduksjon i vekt av tumorknuter og en liten, ikke signifikant reduksjon i antall tumorknuter i bukhulen i forhold til PBS. Administrasjonen av IL-7 alene ikke ga noen anti-tumor effekt i forhold til PBS i mage implantasjon modell.
I abdominal implantering modell, svulst i bukhulen ble fjernet og veid, og tumornoduler ble talt og veid. IL-7, når det gis i forbindelse med OXP økte antitumoreffekt in vivo sammenlignet med henholdsvis PBS, IL-7 og OXP grupper (
P
0,001, n = 6~7). Administreringen av OXP alene resulterte i en betydelig reduksjon i vekt av tumorknuter og en liten, ikke signifikant reduksjon i antall tumorknuter i bukhulen i forhold til PBS. Administrasjonen av IL-7 alene ikke ga noen anti-tumor effekt i forhold til PBS i mage implantasjon modell. (Fig. 2c, 2d)
Kombinasjon av OXP med IL-7 hemmet spredning og indusert apoptose hos mus kolon svulsten
Vi analyserte antall prolifererende celler ved hjelp spredning markør Ki-67. Den kombinerte behandlingen med OXP og IL-7 presenteres færre Ki-67 positive celler, sammenlignet med IL-7 eller OXP alene og kontroll (
P
0,05) (Fig. 3). Videre TUNEL-analysen viste at den kombinerte behandling med OXP og IL-7-induserte signifikant økt apoptose av tumorceller (Fig. 4). Gruppen som fikk kombinasjonsbehandling viste den høyeste apoptotiske indeksen (
P
0,01). Disse resultatene tyder på at kombinasjonen av OXP med IL-7 betydelig redusert celleproliferasjon og apoptose
in vivo
.
resekterte tumorer i hver gruppe ble analysert ved immunhistokjemisk farging for formeringen markeringen ki- 67. en. De representative lysbilder av hver behandlingsgruppe vises. Original forstørrelse, × 200. b. Den proliferative aktivitet ble evaluert ved Ki-67 farging. I hver prøve, ble et minimum på 1000 tumorceller mottok de mikroskopiske områder som viser den høyeste grad av farging, og resultatene ble uttrykt som prosentandelen av positive celler. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.E. (N = 3).
P
verdier: IL-7 + OXP sammenlignet med de andre behandlingsgruppene, *,
P
0,05, **,
P
0,01. Den kombinerte behandlingen med OXP og IL-7 presenteres færre Ki-67 positive celler, sammenlignet med IL-7 eller OXP alene og kontroll.
a. Parafinsnitt ble farget med tunel analyse for å påvise apoptotiske celler winthin CT26 svulst. De representative deler av hver gruppe er presentert. Original forstørrelse, × 200. b. Apoptotiske indeksen ble bestemt ved å evaluere gjennomsnittlig antall kjerner apoptotiske celler i 5 høyeffekts mikroskopiske felt. Gruppen av kombinasjonsbehandling viste den høyeste apoptotiske indeksen. Data representert apoptosic indeksen ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.E. (N = 3).
P
verdier:. IL-7 + OXP sammenlignet med de andre behandlingsgruppene, *,
P
0,05, **,
P
0,01
kombinasjon av OXP med IL-7 induserte signifikante aktiverte T-celler inn i tumorene
CD69 er en T-celleaktivering markør. Vi har fastslått derfor om IL-7, og /eller OXP behandling forbedret nærværet av aktiverte CD8 + T-celler (CD8 + CD69 + -populasjonen) i de to modeller murine colontumorer. I lungemetastase modell på dag 13 etter den første behandling, ble enkeltcellesuspensjoner av tumorvev fra hver gruppe analysert for aktiverte CD8 + T-celler ved flow cytometri. Som vist på fig. 5, IL-7 alene hadde ingen effekt på CD8 + CD69 + -populasjonen. OXP alene har økt betydelig de CD8 og CD69 positive celler i tumorer sammenlignet med PBS kontroller og IL-7 også. IL-7 kombinert med OXP har økt betydelig de CD8 og CD69 positive celler i tumorer sammenlignet med PBS kontroller og IL-7 eller OXP alene. En immunhistokjemisk undersøkelse ble utført på tumorprøver oppnådd fra hver gruppe av mus. Undersøkelsen ble utført for å evaluere mengden av CD8 + -T-celler i tumorvevet. Resultatene evealed at svulster fra IL-7 og OXP kombinasjonsbehandlede mus ble tungt infiltrert med CD8 + T-celler, sammenlignet med PBS, IL-7 eller OXP alene behandlede mus (
P
0,05) (fig. 6). Lignende resultater ble observert i mage implantasjon modellen (Fig. 6).
a. I cytometri analyse, vi portdata med FSC og SSC bivariate plot, deretter tegne en region rundt klyngen av lymfocytter og deretter gate fluorescens histogrammet på dem. Denne port, i FSC vs SSC vis, når etablert, blir så brukt til analyse av alle etterfølgende prøver. Representative flowcytometri i hver gruppe ble presentert. b.IL-7 kombinert med OXP har betydelig økt CD8 + /CD69 + positive celler i tumor sammenlignet med PBS kontroller og IL-7 eller OXP alene lunge modell. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.E. (N = 3).
P
verdier:. IL-7 + OXP sammenlignet med de andre behandlingsgruppene, *,
P
0,05, **,
P
0,01
a. De representative lysbilder av immunhistokjemisk farging av CD8 hver behandlingsgruppe vises. Original forstørrelse, × 200. b. Graden av CD8 + infiltrasjon ble observert i mer enn 10 uavhengige høyeffekts (× 200) mikroskopiske felt for hver vevsprøve. De fem mikroskopiske felt med den mest tallrike fordeling ble valgt innenfor kreftcellen reir. Det gjennomsnittlige antall CD8 + T-celler ble tellet i de fem mikroskopiske felt. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.E. (N = 3).
P
verdier:. IL-7 + OXP sammenlignet med de andre behandlingsgruppene, *,
P
0,05, **,
P
0,01
tumor-forbundet makrofager og dentritic celler (DCS) er viktige bestanddeler av leukocytt infiltrere i solide svulster. Vi undersøkte også antallet makrofager i tumoren ved flowcytometri med F4 /80-antistoff og CD11b antistoff og antall tumor-infiltrerende modne dentritic celler med CD11b antistoff og CD11c antistoff i lungemetastase modell. Imidlertid, IL-7 og OXP behandling hadde ingen virkning på antallet av CD11b + F4 /80 + celler og DCS i tumorer sammenlignet med dem fra IL-7 alene, OXP alene, og PBS-behandlede mus i lungemetastase modell (fig. 7).
a. og b. Representative flowcytometri i hver gruppe ble presentert. c. og at d. IL-7 i kombinasjon med OXP hadde ingen effekt på antall CD11b + F4 /80 + celler og DCS i tumorer sammenlignet med dem fra IL-7 alene, OXP alene, og PBS-behandlede mus i lungemetastase modell.
kombinasjon av OXP med IL-7 reduserte treg celler i milten
Vi har evaluert om IL-7 og OXP kombinert behandling hadde en effekt på immundempende cellepopulasjoner. Milter fra hver gruppe av dyr ble samlet, og treg populasjoner (CD4 + foxp3 + populasjon) ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. I lungen metastase modell, har vi funnet at kombinasjonen-behandlede CT26 colon tumorbærende mus hadde en lavere prosentandel av treg-celler blant CD4 + T-celler i milten, i sammenligning med IL-7 alene, OXP alene, og kontrollmusene (Fig. 6 ) (
P
0,05). Lignende resultater ble oppnådd i mage implantasjon modellen (
P
0,05). (Fig.8)
a. Representative flowcytometri i hver gruppe ble presentert. b. IL-7 i kombinasjon med OXP har redusert foxp3 + populasjonen i CD4 + T-celler i milt, sammenlignet med PBS-kontroller og IL-7 eller OXP alene i både lunge og magemetastasemodeller. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.E. (N = 3). P-verdiene:. IL-7 + OXP sammenlignet med de andre behandlingsgruppene, *,
P
0,05, **,
P
0,01
MDSCs er heterogene populasjoner av suppressor celler definert fenotypisk i mus ved sin co-uttrykk for CD11b og Gr-1 [30], [31], [32]. Vi undersøkte også antallet MDSCs i milt i lungen metastase modell ved strømningscytometri med CD11b antistoff og Gr-1-antistoff med tanke på deres evne til å undertrykke T-celle immunresponser. IL-7 og OXP ikke signifikant reduserer antallet MDSC i milt, sammenlignet med den til IL-7 alene, OXP alene eller kontroll i lungemetastase modell (fig. 9).
a. Representative flowcytometri i hver gruppe ble presentert. b. IL-7 og OXP ikke signifikant redusere antall MDSC i milten sammenlignet med IL-7 alene, OXP alene eller kontroll i lungemetastase modell.
Diskusjoner
effekten av OXP pluss IL-7 behandling mot meget inngripende metastatisk mus CT26 colon adenokarsinom ble evaluert basert på frekvensen av responsen i eksperimentet vårt. Våre data viser at når det er gitt i samme dose, OXP pluss IL-7 er signifikant mer effektivt enn IL-7 eller OXP alene for inhibering av tumorvekst. Vårt studium viser at den OXP pluss IL-7 kombinasjonsbehandling signifikant hemmet tumorvekst i murine modeller av tykktarmskreft.
Våre funn viser at IL-7 alene hadde ingen effekt på tumorvekst hos mus og IL-7 gjorde ikke endre celle følsomhet for OXP i kultur. Derfor er det lite sannsynlig at IL-7 har en direkte effekt på svulsten. Flowcytometri data indikerer at kombinasjonen av OXP med IL-7-induserte signifikant infiltrering av aktiverte T celler i svulster og hadde en lavere prosentandel av treg-celler i milten. Disse data antydet at OXP pluss IL-7 behandling hemmet tumorcellevekst av immunregulering snarere enn direkte cytotoksisitet. Antitumoreffekter av OXP pluss IL-7 ble forbundet med økt prosentandeler og antallet aktiverte CD8 + T-celler. Det var også forbundet med hemmet utviklingen av treg-celler.
IL-7 kan potensielt øke immunresponser mot tumor gjennom en rekke mekanismer [8]. Mange studier har funnet at IL-7 ekspanderer og opprettholder effektive T-celler i tumorbærende mus. For eksempel kan IL-7 forbedre vaksine-formidlet antitumorimmunitet ved å fremme ekspansjon CD8 [21]. Den markant antitumoraktivitet av administreringen av IL-7 /HGFb in vivo korrelerte med en betydelig økning i antall tumor-infiltrerende CD4 + og CD8 + T-celler [18]. IL-7 synergizes med IL-12 eller IL-21 for å forbedre antitumorimmunitet ved forøkning av cytotoksiske T-celler funksjon [33], [34]. Forbedret produksjon av aktiverte dendrittceller ved hjelp av IL-7 i kombinasjon med andre faktorer er en annen mekanisme som IL-7 kan forsterke antitumor immunrespons [18], [20]. Videre IL-7 kan forbedre antitumorimmunitet ved å motvirke inhibitoriske nettverk: favorisere differensiering Th17, downregulating transformerende vekstfaktor (TGF) -β produksjon, noe som begrenser TGF-β assosierte signalisering, og å gjengi effektorceller ildfaste å Treg celler [21] , [35], [36], [37]. Evnen til adjuvans IL-7 for å motvirke inhibitoriske nettverk ved den cellulære og molekylære nivå har store implikasjoner for immunterapi ved behandling av tumorer.
De fleste anti-tumor aktivitet av IL-7 ble funnet når det ble kombinert med andre terapeutiske metoder. Anti-tumor effekt var nominelt når IL-7 ble benyttet alene [16], [17], [18], [19], [20], [21], [35], [36], [38]. IL-7 alene er blitt funnet å ha noen effekt på human colon carcinoma xenografter [38]. Kjemoterapeutika kan indusere anti-tumor immunitet og disse funnene åpne muligheter for å integrere immunterapi med kjemoterapi. Antitumoraktiviteten av å kombinere IL-7 og kjemoterapi er ikke undersøkt. Det har blitt rapportert at OXP kan fremme en gunstig immun mikromiljøet, for å stimulere immunresponser mot kreft [3], [4]. Eksponering av calreticulin på celleoverflaten og frigjøring av HMGB1 har blitt foreslått som viktige elementer i immunstimulerende egenskaper OXP [1].
OXP kan styrke immunrespons mot svulster ved å vippe balansen mellom effektor og regulerende /suppressorceller i favør av effektorcellene, som tidligere er beskrevet for andre kjemoterapeutiske medikamenter [2], [3]. Et gunstig forhold mellom T-effektor og T-suppressor-celler har vært assosiert med forbedret immunrespons mot tumorer [2], [39]. Mangel på effekt av OXP alene i aggressive-modeller in vivo er blitt beskrevet [3], [40].
