Abstract
Activation-indusert cytidindeaminase (AID) er et enzym som er nødvendig for antistoff diversifisering, og det forårsaker DNA mutasjoner og trådbrudd. Konstitutiv AID uttrykk i mus alltid forårsaket lungelesjoner morfologisk ligner menneskelige atypisk adenomatøs hyperplasi (AAH), som kan være en forløper for bronchioloalveolar karsinom. I likhet med AAH, mus AAH-lignende lesjon (mall) viste tegn til alveolar differensiering, bedømme fra uttrykk for alveolar type II (AT2) cellemarkør surfaktant protein C (SP-C). Men elektronmikroskopi indikerte at Mall, som besatt visse funksjoner i en slimete celle, er forskjellig fra en AAH eller AT2 celle. Selv MALL utviklet i alle individer innen 30 uker etter fødselen, lungesvulster skjedde i bare 10%; Dette tyder på at det store flertallet av kjøpesentre ikke klarer å vokse inn i synlige svulster. MALL uttrykte flere nylig beskrevet markører for lunge alveolar regenerering som p63, keratin 5, keratin 14, leucin-rik gjenta inneholder G protein-koblet reseptor 5 (Lgr5), og Lgr6. Økt celledød ble observert i lungene til AID transgene mus sammenlignet med villtype mus. Basert på disse observasjonene, spekulerer vi at kjøpesenteret er en regenererende vev kompensere for cellulær tap forårsaket av AID cytotoksisitet. AID uttrykk i en slik regenerere vev bør disponere celler til malign transformasjon via sin mutagen aktivitet
Citation. Kitamura J, Uemura M, Kurozumi M, Sonobe M, Manabe T, Hiai H, et al. (2015) Kronisk lungeskade ved konstitutiv ekspresjon av Activation-indusert cytidindeaminase fører til Focal Slimete Cell Metaplasi og kreft. PLoS ONE 10 (2): e0117986. doi: 10,1371 /journal.pone.0117986
Academic Redaktør: Jean-Pierre Vartanian, Institut Pasteur, FRANCE
mottatt: 18 juni 2014; Godkjent: 04.01.2015; Publisert: 06.02.2015
Copyright: © 2015 Kitamura et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Grant-i-Aid for Scientific Research av departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan (KAKENHI 23390097) . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1,2], og røyking står for ca 80% av lungekreft tilfellene [3]. På den annen side, lungesykdommer så som kronisk obstruktiv lungesykdom, infeksiøs lungebetennelse, idiopatisk interstitiell lungebetennelse, og tuberkulose-som alle forårsake betennelse i vev-vekst lunge risikoen for lungekreft uavhengig av tobakksbruk [4]. Med nedgangen i røyking har forebygging av tobakksuavhengig lungekreft blitt relativt viktig [2,3]. Det største spørsmålet som skal besvares er hvordan onkogene mutasjoner forekommer i tobakk uavhengig lungekreft.
Nyere studier tyder på involvering av cytidin deaminaser i utviklingen av kreft i mage-tarmkanalen, melkekjertlene, og prostata [5- 9]. Aktivering-indusert cytidindeaminase (AID), et medlem av cytidindeaminase familien, er et viktig enzym for somatisk hypermutasjon og klasse-bryteren rekombinasjon av antistoffgener. Vi har tidligere rapportert at AID ble uttrykt i flere typer gastrointestinale og galle kreft som oppstår i bakgrunnen av kronisk betennelse [5-7]. Transgen uttrykk for AID i mus forårsaker ulike typer svulster, inkludert de av lunge, lever og mage og leukemi [10,11]. AID ekspresjon ble også rapportert i human lunge adenokarsinom [12]. Disse observasjonene tyder på mutagene rolle AID i betennelse-assosiert kreft.
Om lag 10% av AID transgene mus utvikler makroskopisk lunge svulst innen 90 uker etter fødselen [11]. Men alle individer (inkludert de uten lungesvulster) har mikroskopiske lungelesjoner morfologisk ligner menneskelige atypisk adenomatøs hyperplasi (AAH), en forløper for bronchioloalveolar carcinoma [10,13]. Vi først spekulert i at denne musen AAH-lignende lesjon (mall) er en neoplastisk lesjon som etter hvert utvikler seg til adenokarsinom i AID transgene mus. Vi begynte å analysere MALL håper å få et innblikk i mekanismen av AID-indusert lungetumor i mus og betennelse-assosiert lungekreft hos mennesker. Men våre data antydet at MALL er ikke en neoplastisk lesjon, men en forbigående struktur uttrykker nylig beskrevet markører for lunge alveolar regenerering. I denne studien undersøker vi årsaker og kjennetegn ved Mall, beskrive hvordan AID fører Mall og lunge svulst i mus, og tar for seg konsekvenser av menneskelig lunge kreftutvikling.
Materialer og metoder
Mus
bruken av betingede transgene C57BL /6-mus som innehar en enkelt kopi av transgenet inneholdende CAG promoter-drevet floxed grønt fluorescerende protein (GFP) kodende sekvens, etterfulgt av mus AID-kodende sekvens (AID CTG) er tidligere beskrevet [14] . Ved å krysse denne musen en gang med en Cre transgene mus drevet av vev uspesifikke alkalisk fosfatase (TNAP) promoter (TNAP-Cre mus med blandet bakgrunn av C57BL /6 og 129 /Sv etter tre tilbakekrysninger med C57BL /6 [15]), dermed konstituerende AID uttrykk (Aidon)-var oppnådd mus med germline sletting av GFP segment-og. Aidon mus av C57BL /6 bakgrunn med et lite bidrag fra 129 /Sv, fortynnet med tilbakekryssing mer enn seks ganger, ble brukt. C57BL /6J mus ble kjøpt fra Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japan). Alle musene ble foret ad libitum og ble avlivet ved cervikal dislokasjon etter censoring, eller observeres umiddelbart etter spontan døden. Alle dyreforsøk ble godkjent av etisk komité for dyreforsøk og utført i henhold til retningslinjer for dyreforsøk av Shiga Medical Center.
genmutasjon analyse
Lung vev ble dissekert, forankret i oktober sammensatte (Sakura Fineteck Japan Co., Ltd., Tokyo, Japan), og frosset umiddelbart i løpet av flytende nitrogen. Deretter ble 10-mikrometer tykke seksjoner farget med hematoxylin og eosin (HE). Individuell MALL ble isolert ved laser mikrodisseksjon hjelp LMD 6000 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Tyskland). Genomisk DNA ble isolert fra hver kjøpesenter ved hjelp av QIAamp DNA Micro kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland).
Trp53
ekson 5-8,
Kras
ekson 2, og
EGFR
exon 19-21 ble forsterket ved hjelp av en nestet polymerase chain reaction (PCR) med følgende primere :
Trp53
; frem 5 «GCG CCA TGG CCA TCT ACA A 3», reversere 5 «TCT TCT GTA CGG CGG TCT CT 3», nestet frem 5 «TGG CCA TCT ACA AGA AGT CAC 3», og nestet revers 5 «CAG GGC AGG CAC AAA CA 3 «.
Kras
; frem 5 «CGG GTG TGT CCA CAG GGT ATA GCG T 3», reversere 5 «AGT TGA GTT CTA GGC CGG TCA 3», nestet frem 5 «GTG TGT CCA CAG GGT ATA GCG TAC T 3», og nestet revers 5 «GTT GAG TTC TAG GCC GGT CAG G, 3 «.
EGFR
ekson 19; frem 5 «CCC TTT CTG CCT Tags CAT GTC 3», reversere 5 «GGC ACA TCC CTC AGT CAC TTA ACA C 3», nestet frem 5 «CTC TTG GAT TTG TAA TGT AGA GCC 3», og nestet revers 5 «ATT GGG TGT AAT TTA TTA GTG CAT C 3 «.
EGFR
ekson 20; frem 5 «GAA GAT AGT GGC ATT TCC TAA ACT C 3», reversere 5 «GCA TGA ACA CCA GGC TCG ATG 3», nestet frem 5 «ACA TCC CAC AGT GTA TTA GCA TTT A 3», og nestet revers 5 «CTG CTT TTC TTA GTG CTC TTA CCA 3 «.
EGFR
ekson 21; fremover 5 «GCC CAA GGA ACG TGA CGA AAG 3», 5 «AGG GTG CTA CTG AAT CCG TGG TCA T 3′, nestet fremover 5»-TTG TCA TTC ATG CCA GAT AAT TCC A 3 «, og nestet revers 5»-TTA CTA CTC CCA CCG AAA TCC A 3 «. PCR-produktene ble renset med en eksonuklease /fosfatase blanding (ExoSAP-IT, USB Corporation /Affymetrix, Inc., Cleveland, OH, USA) og sekvensert ved hjelp av nestede PCR primere og Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Sekvense produkter ble behandlet med Big Dye xTerminator Purification Kit (Applied Biosystems) og analysert ved hjelp av ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
histologi og immunhistokjemi
Vevsprøver fra mus ble løst i 10% (vekt /volum) formaldehyd, innstøpt i parafin og farget med HE for histologisk undersøkelse. For immunhistokjemi, ble vevsprøver løst via HOPE Fixative (Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA). Prøvene ble innstøpt i parafin. Immunhistokjemi ble utført ved anvendelse av avidin-biotin-peroksidasekompleks (ABC). Monoklonale anti-AID antistoff (MAID-2) ble beskrevet [16]. Andre antistoffer ble kjøpt: keratin 5 (sc-17090, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), Abcam, Cambridge, MA, USA) , overflateaktive protein C (SP-C, sc-13976, Santa Cruz Biotechnology), Lgr6 (sc-99123, Santa Cruz Biotechnology), keratin 14 (PRB-155P, Covance, Berkeley, CA, USA), og podoplanin (53- 5381; eBioscience, San Diego, CA, USA). Hver seksjon ble kontra med hematoksylin
Estimering av antall kjøpesentre i hele lungen
Totalt antall kjøpesentre ble estimert som følger:. Tetthet av kjøpesenter på seksjonen (N, per cm
2) ble beregnet som en middelverdi for 11 deler av 4-mikrometer tykkelse (T = 0,0004 cm) er samlet inn ved 100-um intervaller. Antall og areal av kjøpesenter og arealet av alveolære region i hver seksjon ble målt på hel del bilder ved hjelp ScanScope skanner og ImageScope programvare (Aperios Technologies, Inc., Vista, CA, USA). Midlere diameter av Mall (D, cm) ble beregnet til 0,005 cm. En hypotetisk kubisk vev masse med en side på 1 cm kan skiver i 1 /T-profiler. Derfor det totale antall KJØPESENTER teller i alle 1 /T seksjoner vil være N /T. En enkelt Mall er skiver i D /T stykker og regnet D /T ganger. Oppdeling av total MALL tall (N /T) med denne redundans faktor (D /T), kan tre-dimensjonale tetthet av Mall uttrykkes som N /D per cm
3. Ved hjelp av disse verdiene (N = 4.3, D = 0,005, bilateral lungevolum på 1,0 cm
3) for en 37 uker gammel mus, det totale antall kjøpesenter i lungene er beregnet som N /D × lungevolum = 4,3 /0,005 x 1,0 = 860.
elektron~~POS=TRUNC mikros~~POS=TRUNC
for elektronmikroskopi-analyser, ble Aidon mus perfusert fra høyre hjertekammer med fosfat-bufret saltvann (PBS) for å fjerne blod. Deres lunger ble deretter perfusjon-fiksert med en blanding av 1,4% paraformaldehyd og 1% glutaraldehyd i PBS, og deretter skåret i 2 mm kuber for transmisjonselektronmikroskopi og nedsenking fiksert i det samme middel som brukes for perfusjon fiksering ved 4 ° C over natten . Seksjonene ble deretter etter-fiksert i 1% osmiumtetroksyd i 0,1 M fosfatbuffer i 1,5 timer. Prøvene ble så dehydrert i en gradert etanol serien, klarert med propylenoksid, og innebygd i Epon. Blokker var fra første stund som semithin (1 mikrometer) deler og farget med toluidinblått å identifisere Mall. Supertynne (60-90 nm) snitt ble farget med uranylacetat og føre citrate og undersøkt ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskop, H7650 (Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan).
apoptose analysen
terminal deoksynukleotidyltransferase (TdT) -mediert dUTP nick endlabeling (TUNEL) ble utført for å påvise apoptotiske DNA pauser i lunge og lever vev ved hjelp av TACS 2 TdT-DAB In Situ apoptose Detection Kit (Trevigen Inc., Gaithersburg, MD, USA ). Skinnene ble kontra med 1% metyl grønn. For å måle celledød i lungene og leveren, ble TUNEL-positive og -negative alveolare vegg-celler og hepatocytter tellet til n et totalt antall på 1000 celler i 9-24-overlappende, tilfeldig valgt x 400 felt. Cellene ble telt ved hjelp av bildeanalyse programvare fra VH Analyzer (Keyence, Osaka, Japan). Data ble samlet inn fra tre individuelle mus.
spredningsanalyse
Aidon mus fikk en daglig intraperitoneal injeksjon av 1 mg 5-etynyl-2′-deoxyuridine (Edu) i 0,4 ml PBS for 7 dager. Musene ble så undersøkt ved 1 og 20 dager etter den siste injeksjonen. Celleproliferasjon i 10-mikrometer tykke frosne deler av lungene ble oppdaget ved hjelp av klikke-iT Edu Alexa Fluor 488 Imaging Kit (molekylære prober, Invitrogen, Eugene, OR, USA). Snittene ble fiksert i 3,7% (volum /volum) formaldehyd i 10 min. Neste vev ble permeabilisert med 0,5% Triton X-100 i PBS ved romtemperatur i 20 min. Click-iT Edu reaksjon cocktail inkludert Alexa Fluor 488 azid ble fremstilt i henhold til produsentens instruksjoner og lagt for å dekke lysbildet og inkubert ved romtemperatur i mørket i 30 min. Kjerner ble visualisert med Hoechst 33342 flekken. Lysbilder ble undersøkt under et DM 5000B fluorescens mikroskop (Leica Microsystems). Edu positive celler i lungene ble oppdaget. Data ble samlet inn fra to mus ved hvert tidspunkt.
Cellekultur og pro-inflammatorisk cytokin stimulering
Menneske alveolære epitelceller (A549 cellelinje) ble kjøpt fra Riken Cell Bank (Tsukuba, Japan ) og opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i 5% CO
2. En 2 ml cellesuspensjon (1 x 10
5-celler /ml) ble podet inn i 6-brønners kulturplater og inkuberes i 24 timer for å tillate cellefesting. Cellene ble behandlet med human tumornekrosefaktor α (TNFa Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA), interleukin-1β (IL1β Peprotech), og lymfotoksin-α2 /β1 (LTα2 /β1, R AID, aktivisering-indusert cytidindeaminase; Tg, transgene; MALL, mus AAH-lignende lesjon.
MALL telling ble undersøkt ved gjennomsnitt tettheten i 11 deler av høyre lunge ved 100-mikrometer intervaller for mus mellom 12 og 75 ukers alder (Fig. 2A ). Mall var knapt synlig i 12- og 17-ukers gamle mus, men ble påvist ved 26 uker. Antallet kjøpesentre økte med alderen. På 37 uker, MALL tetthet på seksjonering var 4,3 ± 0,8 /cm
2 (gjennomsnitt ± standard feil, n = 3), tilsvarende et estimat av 860 kjøpesentre i bilaterale lungene (se metoder for beregning). Blant de 64 Aidon mus undersøkt, bare 7 (11%) utviklet makroskopisk synlige lungesvulster (3 adenomer og 4 adenokarsinomer), som kan sammenlignes med lungetumor forekomst i den opprinnelige linjen av AID transgene mus [11]. Tatt i betraktning det store antallet kjøpesentre i alderen mus lunge, spekulerer vi at de fleste kjøpesentre ikke klarer å vokse som makroskopiske tumorer.
A, I venstre panel, mener tetthet av kjøpesentre i snitt per 1 cm
2 er plottet mot mus alder i uker. En solid tråd med lukket symbol og en grå linje med åpen symbol representerer Aidon og villtype mus, henholdsvis. Feilstolpene representerer standardfeil for data fra tre mus, med unntak av en villtype-mus og en 75-ukers gamle Aidon mus hver ble analysert enkeltvis. Areal av en stiplet rektangel ble utvidet i panelet til høyre. B, Cross-sectional med individuelle sentre plottet. Middelverdier er angitt med røde linjer. P-verdier beregnet ved t-test mellom grupper er angitt med klammer.
varierende størrelser (basert på tverrsnittsarealet) av de enkelte sentre fra mus av forskjellig alder er plottet i fig. 2B. Den midlere størrelse av et kjøpesenter syntes å være relativt konstant over tid. Selv ble påvist statistisk signifikante forskjeller mellom 26 uker og 37 uker (p = 0,002), og mellom 37 uker og 75 uker (P 0,0001), middelverdien forskjellen var liten, og synes ikke å ha biologisk betydning. Den sporadiske forekomsten av store kjøpesentre i 75 uker gamle mus kan tyde på at et begrenset antall kjøpesentre fortsetter å vokse, til slutt blir synlige svulster på brutto inspeksjon.
Lungekreft relaterte genmutasjon analyse i kjøpesentre
Menneske AAH velig med vesentlig forhøyede frekvenser av mutasjoner i tre lungekreftrelaterte gener:
Trp53
,
Kras
, og
EGFR product: [17-23] . For å undersøke om MALL har mutasjoner sammenlignes med AAH, ble mutasjoner analysert i hotspot regioner av de tre gener:
Trp53
eksoner 5-8,
Kras
ekson 2, og
EGFR
eksoner 19-21. Vi microdissected 110 kjøpesentre, der DNA ble renset individuelt og utsatt for gen-spesifikke PCR og direkte sekvensering. Mens fire (10,5%) av 38 kjøpesentre viste fem missense mutasjoner i
Trp53
genet, ingen missense mutasjon av
Kras
eller
EGFR
genet ble funnet. Mutasjonen frekvensen til
Trp53
genet var sammenlignbare med tidligere publiserte data på menneskers AAH i lungene [17,18], men
Kras Hotell og
EGFR
mutasjoner var mye færre enn i menneskelig AAH [19-23] (tabell 1). Fire av de fem missense
Trp53
mutasjoner er spådd til å kompromittere protein funksjon, selv om det er uklart om disse skadelige mutasjoner spilte noen rolle i utviklingen av kjøpesentre (S1 A og B Fig.).
tall i parentes angir antall kjøpesentre med genmutasjon versus antall kjøpesentre undersøkt.
Inkludert intronic mutasjoner, 14, 3 og 0 single-basen erstatninger ble funnet i
Trp53
,
Kras Hotell og
EGFR
genet, henholdsvis. Substitusjonsmønstre cytosin (C) -til-tymin (T) og guanin (G) -til-adenin (A) endres typisk å Cytidine deaminering ble ikke dominerende i
Trp53
genet (14% [2 /14], S1C fig.). I begge tilfeller mutert Cs var 5′-innledes ved G, som var i samsvar med AID signatur [24]. Som vist i S1D fig., 2 ut av 3 substitusjoner sett i
Kras
gen var C-i-T forandring i et dinukleotid sammenheng med C 5′-innledes med T, som er et foretrukket mål for APOBEC3 deaminering [25]. Men lite antall observerte mutasjoner i kjøpesentre utelukker slutning av mutasjonsprosessen.
Immunhistokjemi for luftveiene epiteliale cellemarkører
For å karakterisere differensiering status for kjøpesenteret, vi utført immunhistokjemi for tre markører spesifikke for tre typer distale luftveis epitelceller: podoplanin i alveolære type-1 (AT1) celler, SP-C i alveolære type-2 (AT2) celler, og CC-10 i Clara celler. Sentre var delvis positive for SP-C, men negativt for CC-10 og podoplanin (Fig. 3A-C). Dette funn tyder på at AT2-celler kan være tilstede i mall.
A, CC-10, clara-cellemarkør og B, podoplanin, alveolar type I-cellemarkør, var negative. C, SP-C, var alveolar type II-cellemarkør delvis positiv i MALL celler. D, E, keratin 5; F, keratin14; G, E-cadherin; H, Lgr5; og jeg var Lgr6 alle positive i kjøpesentre. Brown signal indikerer positiv farging av diaminobenzidine og blått signal indikerer atom teller farging av hematoxylin. Mall er angitt med en pilspiss. CC-10, Clara celle 10kd protein; SP-C, overflateaktivt protein C; E-cadherin, epitelial cadherin; LGR, leucine-rik gjenta inneholder G protein-koblede reseptorer.
Den sovende natur Mall og det sparsommelige mutasjoner i lungekreftrelaterte gener bedt oss å spekulere i at MALL kan være en regenerativ lesjon heller enn en tidlig svulst. Nylig ble det regenererende markører for fjerntliggende luftveisceller rapportert. I en musemodell som viser lunge regenerering etter H1N1 influensavirusinfeksjon, p63, keratin 5, og keratin 14 er uttrykt i regenererende alveolare celler [26]. I en annen undersøkelse med humane lunge-avledede celler, celler som uttrykker E-cadherin, Lgr5, og Lgr6 besatt en stamcelle-lignende evne til selvfornyelse og bronchioalveolar differensiering [27]. Immunhistokjemi også avdekket at MALL uttrykt ΔNp63, keratin 5, keratin 14, E-cadherin, Lgr5, og Lgr6 (Fig. 3D-I), og dermed indikerer at MALL beholder en signatur av alveolar regenerativ vev.
Electron mikroskopisk funnene
for ytterligere å undersøke MALL egenskaper, vi vurdert lungene av Aidon mus via transmisjonselektronmikroskopi. Mall besto av et monolag av celler på en basalmembran. Cellene ble søyle med langstrakte kjerner (fig. 4A). Interessant, alle cellene inneholdt umodne sekretoriske vesikler i den apikale delen av cytoplasma uten lamellære legemer (Fig. 4B). Disse vesiklene var positive for PAS-farging, noe som indikerer tilstedeværelse av mucin (fig. 4C). Disse funnene tyder på at MALL celler er, faktisk, umodne slimete celler. Som menneske AAH inneholder lamellær organer [28], er MALL struktur forskjellig fra AAH, innledende nomenklatur tross
Electron mikroskopiske funn av Mall. A, Oversikt over MALL celler. B, forstørret bilde av den apikale delen av MALL celler. Pilene viser umodne sekretoriske vesikler i cytoplasma i MALL celler. En stjerne indikerer en basal cell tilknytning til kjøpesenter celler. C, viser PAS flekker som positivt fargede materialer er i toppen av MALL celler (pilspisser). D, elektronmikroskop viser en phagocytic epitelcelledifferensiering innen MALL (stjerne). Inset, høyere makt visning av fagocytisk epitelceller. Piler indikerer basalmembranen. Pilspisser angir gjenværende organer innen cellen. AS, alveolar plass; PAS, periodisk-syre Schiff.
I tillegg har vi oppdaget basalcellelignende celler, som normalt ikke er sett i den distale lunge muse [29], på den basale siden av MALL celler (fig. 4A). Sterkt uttrykk av keratin 5 og 14 tyder på at MALL stammer fra denne basalcellelignende celle. Videre har vi noen ganger funnet phagocytic celler i kjøpesentre (fig. 4D). Disse cellene hadde direkte kontakt med basalmembranen og rest organer i cytoplasma. Med denne observasjonen, konkluderte vi med at disse cellene var faktisk fagocytterende epitelceller. Disse cellene representerer en fysiologisk reaksjon på apoptose av sine naboer epiteliale [30,31]. Derfor foreslår dette funnet at clearance av dødt vev av epitelceller skjer i distal luftveisepitelet i Aidon mus.
Forbedret celledød i vevet av Aidon mus
Tilstedeværelsen av fagocyterende epitelceller i kjøpesentre bedt oss å spekulere i at lunge celledød oppstår oftere i Aidon mus enn WT mus. I tunel analysen, vi tidvis funnet død celler i kjøpesentre (Fig. 5A). Imidlertid døde celler ble gjenkjent selv i området utenfor kjøpesenteret. Forekomsten av døde celler utenfor kjøpesenter i Aidon mus lungene (0,43%) var signifikant høyere enn i WT mus (0,09%, P = 0,013, Fig. 5B, tabell 2). For å undersøke hvorvidt AID cytotoksisitet er bestemt til lungen, utførte vi TUNEL-farging av levervev. Antallet TUNEL-positive hepatocytter økte i Aidon mus sammenlignet med WT mus (6,0% mot 4,8%, p = 0,036, Fig. 5C, tabell 2). Dette funnet viser tydelig at AID-indusert celledød er ikke spesielt for lunge
TUNEL farging av A, Mall.; B, Lung fra AID Tg mus; og C, Lever av AID Tg mus. Pilspisser indikerer Tunel positive celler. Celleproliferasjon analysen av Edu merking i lungen av bistand Tg mus og WT mus: D, representant figur av Edu-positive MALL på dag 1. En pilspiss indikerer EDU-positive Mall (området er omgitt av en stiplet linje). E, representant figur av lungen av AID Tg mus på dag 20. En pilspiss indikerer EDU-positive kjøpesenter og en pil indikerer EDU-negative Mall. Regionen hver Mall er omgitt av en stiplet linje. TUNEL, terminal deoksynukleotidyltransferase (TdT) -mediert dUTP nick endlabeling; EDU, 5-etynyl-2′-deoxyuridine.
Tall i parentes angir forholdet mellom tunel positive celler til tunel negative celler.
Cell spredning i kjøpesentre
Mall består av flere umodne slimceller og et begrenset antall av basale celler morfologisk lik de i bronkiene, som fungerer som stamceller for bronkial epitel. Hvis umodne mukøse celler er avledet fra disse basalcellene, kan den hypotese at genereringen av Mall skal følge celledeling. For å bekrefte denne hypotesen, gjennomførte vi en spredning analyse av 5-etynyl-2′-deoxyuridine (Edu) innlemmet i replikere DNA. Først må vi gitt én gang daglig intraperitoneale injeksjoner av Edu til Aidon mus i 7 påfølgende dager. Halvparten av musene ble avlivet for lunge inspeksjon en dag etter den siste injeksjonen EDU (dag 1). Vi fant noen edu-positive celler i kjøpesentre, noe som indikerer at disse lesjonene har potensial til å bære prolifererende celler. Etter kvantitativ analyse av oppkjøpte bilder, 91,1% (41/45) av kjøpesentre ble funnet å inneholde Edu positive celler (fig. 5D).
Deretter undersøkte vi lungene av den resterende halvparten av Aidon mus på dag 20. Interessant, bare 44,2% (19/43) av kjøpesentre hadde edu positive celler (P 0,01 ved chi-kvadrat test, figur 5E.). Denne reduksjonen i edu positivitet i løpet av de første 19 dagene kan tolkes av et scenario der etablerte kjøpesentre slå inn normal alveolar vev som nye, umerkede kjøpesentre er generert. Denne transformasjonen antas å senke Edu positivitet. Et annet scenario er at MALL celler gjennomgår celledød og er eliminert. Disse to mulighetene er ikke gjensidig utelukkende. Hvilke utfall er dominant er uklart i dag.
Skal vi dømme ut fra den gradvise økningen i antall kjøpesentre (fig. 2A), virker det sannsynlig at frekvensen av KJØPESENTER generasjon litt overskrider forsvinningen rate.
MALL og lunge svulst
Våre data tyder på at kjøpesenteret er ikke en svulst, men en voksende slimete celle metaplasi med begrenset levetid. For å undersøke sammenhengen mellom kjøpesenteret og lunge svulst, som utvikler seg i omtrent 10% av Aidon mus, må vi først bekreftet AID uttrykk i MALL ved immunhistokjemi (Fig. 6A). Dette resultatet var i overensstemmelse med en kvantitativ RT-PCR resultat, som viser tre ganger høyere AID-ekspresjon i senter enn omgivende vev alveolar (S2 fig.). Deretter undersøkte vi deler av adenom fra Aidon mus lunge. Interessant, fant vi at kjøpesentre er tidvis innebygd i tumorous vev (Fig. 6B og C). Videre er de fleste av tumorceller uttrykte lungen restitusjon markører p63, keratin 5/14 og 5/6 LGR (fig. 6, D-H). Ekspresjon av disse restitusjon markørene ble ofte begrenset til en subpopulasjon av tumorceller, som sannsynligvis gjenspeiler en forekomst av intratumoral heterogenitet. Tilstedeværelsen av kjøpesenter innen en kreftsvulst og dens proliferativ potensial antyder at lunge svulst kan ha sin opprinnelse fra Mall i AID transgene mus.
A, Immunhistokjemi for AID i kjøpesentre. Mall er angitt med en pilspiss. B, HE farging av lunge av AID Tg mus med lunge adenom. En adenom er avgrenset av en stiplet linje. Region indikert med et rektangel er forstørret i C. C, Pilspisser indikere sentre innen lunge adenom. Immunhistokjemi for D, ΔNp63: E, keratin 5; F, keratin 14; G, LGR 5; og H, LGR 6 i lunge adenom.
Induksjon av AID uttrykk i menneskelige alveolære epitelceller
Hvis AID uttrykk blir indusert i alveolære epitelceller av proinflammatoriske cytokiner, som var vist for human kreft i mage-tarmkanalen [5-7], ville muligheten for å AID engasjement i human lungekreft dukke opp. For å undersøke hvorvidt inflammatoriske stimuli forbedre AID ekspresjon i alveolære epitelceller ble fremgangsmåten analysert ved kvantitativ RT-PCR i human lunge adenokarsinom-avledede A549-celler. A549-celler ble stimulert med TNFa, IL1β eller LT α2 /β1 for 12 og 24 timer. RNA ble deretter analysert for AID mRNA uttrykk av kvantitativ RT-PCR. AID uttrykk ble vellykket indusert 12 timer etter å ha lagt TNFa eller IL1β, mens induksjon av LTα2 /β1 var marginal (Fig. 7).
Plottet viser resultatet av kvantitativ real-time revers transkripsjon PCR for AID mRNA fra A549 human lunge adenokarsinom-avledede celler stimulert med tumornekrosefaktor (TNF) α, interleukin (IL) 1β eller lymfotoksin (LT) α2 /β1 for 12 og 24 timer. Dataene er gjennomsnitt ± SE; n = 3. SE, standard feil.
Diskusjoner
I denne studien, foreslo vi at kjøpesenteret er en slimete celle metaplasi som utvikler etter AID-indusert lunge alveolar skade og kunne være en forstadier lesjon for lungekreft. I tillegg viste vi at AID uttrykk er indusert i menneske alveolære celler ved proinflammatoriske cytokiner, noe som tyder på involvering av AID i human lunge kreftutvikling. Vi startet denne studien fra en antakelse om at MALL kan være et svært tidlig stadium svulst mye som menneske AAH.
