Abstract
Tykktarmskreft (CRC) er en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall og pålitelige blodbaserte prognostiske biomarkører er sterkt behov. Oppregningen og molekylær karakterisering av sirkulerende tumorceller (CTCs) har fått økende interesse i klinisk praksis. CTC deteksjon av CellSearch
® allerede er korrelert til et ugunstig utfall i metastatisk CRC. Imidlertid er CTC deteksjonsraten i mCRC sykdom lav sammenlignet med andre tumor enheter. Dermed kan bruk av alternative (eller supplerende) analyser bidra til å spesifisere den prognostiske bruk av CTCs som blodbaserte biomarkører. I denne studien ble blodprøver fra 47 mCRC pasienter screenes for CTCs bruker FDA-ryddet CellSearch
® teknologi og /eller AdnaTest
®. 38 prøver kan behandles parallelt. Vi viser at en kombinert analyse av CellSearch
® og AdnaTest
® fører til en forbedret deteksjon av CTCs i vår mCRC pasient kohort (positivitet sats CellSearch
® 33%, AdnaTest
® 30%, kombinerte 50%). Mens CTCs oppdages med CellSearch
® system var signifikant assosiert med progresjonsfri overlevelse (p = 0,046), kan en signifikant korrelasjon om total overlevelse bare bli sett når begge analysene ble kombinert (p = 0,013). Disse funnene kan bidra til å etablere bedre verktøy for å oppdage CTCs som på-behandling biomarkører for klinisk rutine i fremtidige studier
Citation. Gorges TM, Stein A, Quidde J, Hauch S, Rock K, Riethdorf S, et al. (2016) Forbedret Påvisning av sirkulerende tumorceller i metastatisk kolorektalcancer ved kombinasjon av CellSearch
® System og AdnaTest
®. PLoS ONE 11 (5): e0155126. doi: 10,1371 /journal.pone.0155126
Redaktør: Min-Hsien Wu, Chang Gung University, TAIWAN
mottatt: 03.11.2015; Godkjent: 25 april 2016; Publisert: 16 mai 2016
Copyright: © 2016 Gorges et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering: TMG, SR, og KP ble støttet av City of Hamburg, Landesexzellenzinitiative Hamburg (LEXI 2012; Tumor målgruppe via celleoverflatemolekyler essensielle i kreft progresjon og formidling).. Disse forfatterne ble også støttet av ERC Advanced Investigator Grant dissekere, TRANSCAN ERA-nettverket: Grant CTC-SCAN. TMG og KP ble også støttet fra Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking etter tilskuddsavtalen n ° 115749, ressurser som er sammensatt av økonomiske bidrag fra EUs syvende ramework Programme (FP7 /2007-2013) og EFPIA selskapenes tingsinnskuddet. De bevilgende myndighet gitt støtte i form av lønn for forfatteren TMG, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag». SH er en full tid ansatt i AdnaGen GmbH, Langenhagen, Tyskland. Den AdnaGen GmbH gitt støtte i form av lønn for forfatteren SH, men har ikke noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Den spesifikke rolle denne forfatteren er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser: SH er Site Manager Research . Utvikling av AdnaGen GmbH (Qiagen). Alle andre forfattere har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreft relaterte dødsfall er vanligvis forårsaket av utvekst av aggressive kreftceller på nye steder i kroppen (metastase dannelse) som har blitt formidlet fra de primære svulster. Tykktarmskreft (CRC) er en av de vanligste diagnosen maligniteter og en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall [1]. Omtrent en fjerdedel av pasientene med CRC utstillingen metastaser (mCRC) ved diagnosetidspunktet (synkron sykdom) og ytterligere pasienter vil utvikle metastaser i løpet av sin sykdom, noe som resulterer i relativt høy dødelighet assosiert med CRC [2].
Ulike prognostiske markører kan i dag brukes i mCRC, for eksempel analyser av hvite blodlegemer, laktat dehydrogenase beløp, allmenntilstand, lokalisering av primærtumor og metastaser, molekylære markører (f.eks mutasjoner i BRAF-genet), eller avansert integrerende clustering) [3-7]. Dessuten har svulst vekst dynamikk vist seg å by på behandling informasjon om fremtidig prognose [8, 9].
opplisting og molekylær karakterisering av tumorceller tatt fra en minimal invasiv blodprøve (sirkulerende tumorceller, CTCs) blir i økende grad brukt i klinisk praksis for sykdomsovervåkning og oppdage prognostisk betydning [10]. CTCs er lett å få tak med mindre invasiv perifert blod prøvetaking slik at en kontinuerlig «real-time overvåkning» av tumorprogresjon. Så langt har CellSearch
® -systemet er den eneste tilnærmingen som har blitt klarert av det amerikanske amerikanske FDA (Food and Drug Administration) for CTC deteksjon i metastatisk brystkreft, tykktarm og prostata kreft [11-13]. Påvisning av CTCs bruker CellSearch
® har nylig blitt korrelert til et ugunstig utfall i mCRC [14]. Men studier utført i mCRC pasienter som bruker CellSearch
® viste en mye lavere utbytte av CTCs i denne svulsttypen sammenlignet med brystkreft eller prostatakreft [11-13]. Det er forventet at «bare» 30-40% av pasientene med mCRC havn 3 eller flere CTCs per 7,5 ml blod [15]. Derfor kan bruk av andre (eller supplerende) analyser forbedre vår forståelse av mekanismene for kreft biologi og spesifisere bruken av CTCs som kreft biomarkører i mCRC. For eksempel betydelig uoverensstemmelse mellom CellSearch
® og AdnaTest
® i deteksjon av CTCs fra mCRC pasienter har allerede blitt observert [16]. Den CellSearch
® systemet bruker farging og definerer CTCs som celler som uttrykker både EpCAM og pankeratins og ikke uttrykker CD45, samt å ha en kjerne farget med DAPI (4 «, 6-diamidino-2-fenylindol). I kontrast, AdnaTest
® bruker en RT-PCR plattform rettet mot tre ulike transkripsjoner (
EpCAM
,
EGFR
,
CEA
) for å identifisere kreftceller innen EpCAM-anrikede cellefraksjon.
A kombinert analyse av begge analysene kan derfor forbedre følsomheten CTC påvisning ved å anvende to arbeidsmåter (immunocytokjemi og RT-PCR) og øker utvalget av CTC markører. Dette er en viktig fordel i betraktning av den kjente heterogeniteten til fenotypisk CTCs [10]. Hensikten med denne studien var å analysere den kliniske relevansen av CTCs ved å sammenligne og kombinere to forskjellige analyser for CTC deteksjon i en liten kohort av mCRC pasienter (n = 47). For dette formål, den AdnaTest
® og CellSearch
® system ble ansatt i parallell. Våre data viser at en kombinert analyse av begge analysene fører til økte deteksjon priser av CTCs med ytterligere prognostisk informasjon. Disse funnene kan bidra til å etablere nye diagnostiske verktøy til bruk av CTCs som på-behandling biomarkører for klinisk rutine i fremtidige studier.
Materiale og metode
Pasient serie
Påfølgende pasienter planlagt for palliativ kjemoterapi for CRC fra poliklinikk fra Avdeling for kreftbehandling og blodsykdommer ved University Medical Center Hamburg-Eppendorf ble rekruttert. Pasientens egenskaper er oppsummert i Tabell 1. Hoveddelen av pasientene ble allerede i stor utstrekning forbehandlet, som mottar 3
rd (median) behandling (område: 1-8). Totalt sett, mer enn 80% av pasientene fikk fluoropyrimidiner, oksaliplatin, irinotecan og bevacizumab og ca 40% av pasientene EGFR antistoffer. Demografi og mønstre av metastaser var som forventet, selv om den generelle befolkningen var litt yngre enn medianen metastatisk CRC befolkning, sannsynligvis relatert til universitetssykehuset bakgrunnen. Studien ble utført i samsvar med World Medical Association Helsinkideklarasjonen og retningslinjene for eksperimentering med mennesker av Chambers of Physicians i delstaten Hamburg ( «Hamburger Ärztekammer»). Den eksperimentelle protokollen ble godkjent (Godkjenning nr PVN-3779) av etikkomiteen av Chambers of Physicians i delstaten Hamburg ( «Hamburger Ärztekammer»). Alle deltakerne ga skriftlig informert samtykke før studien startet. I alt ble blodprøver (5 ml og 7,5 ml) fra 47 pasienter samlet inn AdnaCollect
® blodoppsamlingsrør (AdnaGen
®) eller CellSave
® bevaring rør (Janssen diagnostikk) og behandlet innen 24 h (AdnaTest
®) eller 96 h (CellSearch
®) i henhold til retningslinjene for leverandørene.
AdnaTest
®
for berikelse og analyse av sirkulerende tumorceller (CTC) den AdnaTest ColonCancerSelect og AdnaTest ColonCancerDetect, (AdnaGen GmbH, Langenhagen) ble anvendt for å fremstille mRNA, etterfulgt av et RT-PCR for en senere multipleks PCR i henhold til produsentens instruksjoner [16]. All nødvendig informasjon om utvalgets behandling kan bli funnet på nettsiden https://www.adnagen.com. I korte trekk ble 5 ml blod tatt for en anrikning av CTC ved hjelp av antistoff-belagte magnetiske partikler bestående av en blanding av antistoffer mot forskjellige EpCAM-epitoper De anrikede celler ble deretter lysert og mRNA ble renset ved hjelp av oligo-dT-perler som inneholdes i kit etterfulgt av revers transkripsjon (Sensiscript, Qiagen, Hilden). Den resulterende cDNA ble behandlet i en multipleks PCR for tumor-assosiert transkripsjoner (
epidermal vekstfaktor reseptor product: (
EGFR
),
carcinoembryonic antigen product: (
CEA
) og
EpCAM
) samt
Actin
som housekeeping kontroll. PCR ble utført ved hjelp av HotStarTaq Master Mix (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). Visualisering av PCR-fragmentene ble utført med en 2100 Bioanalyzer ved hjelp av DNA1000 analysen (Agilent Technologies, Waldbronn, Tyskland). CTCs ble positivt identifisert dersom minst en av multipleks PCR markører ble oppdaget.
CellSearch
®
Ved isolering av CTCs bruker CellSearch
®, CTC deteksjon ble utført som beskrevet andre steder [17]. Kriteriene for en begivenhet for å bli definert som CTC var: en rund til oval morfologi, en synlig kjerne (DAPI-positiv), og et positivt fargingsmønster for en epitelial bestemt celle (Keratin-positive og CD45-negative). For EGFR besluttsomhet på CTCs, den CellSearch
® Tumor fenotyping Reagens EGFR ble brukt i den fjerde kanalen av systemet [18].
Statistisk analyse
For å kunne sammenligne resultatene fra den CellSearch
® system og AdnaTest
® eksperimenter, CTC teller fra CellSearch
® data ble forvandlet til positiv (≥3 CTCs) eller negativ ( 3 CTCs) siden ≥3 CTCs /7,5 ml blod har vært knyttet til dårlig klinisk utfall [13]. CTC status (positive /negative) og korrelasjon med metastase plassering ble testet med 2×2 Fishers eksakte test [19] og korrigert for multippel testing. McNemar test med Yate korreksjon for kontinuitet ble utført for å finne avtalen mellom de to metodene. Progresjonsfri og total overlevelse (PFS og OS) anslår for begge metodene ble beregnet ved Kaplan-Meyer kurver og sammenlignet med log-rank test [20].
Resultater
Klinisk prøveanalyse ved hjelp den AdnaTest
® og CellSearch
®
Bruke AdnaTest
®, 13 av 43 (30%) analyserte pasientene var positive for CTCs. CTCs ble positivt identifisert hvis minst én av multipleks PCR-markørene ble detektert. CTCs fra 8 pasienter viste positive signaler for
EpCAM
. Fire av disse pasientene viste i tillegg signaler for
CEA
, mens én pasient var positiv for
EpCAM
,
CEA
, og
EGFR
. Fem pasienter viste utelukkende signaliserer for
CEA
uten uttrykk signaler for noen annen markør (figur 1A). For CellSearch
® analyser, bare pasienter med ≥3 CTCs ble klassifisert som «CTC-positive» fordi denne cut-off var korrelert til et ugunstig utfall i mCRC [13, 21]. Fjorten ut av 42 (33%) analyserte prøvene var positive for CTCs (område: 3-44 celler). EGFR-positive celler (moderat til sterkt uttrykk) ble funnet i seks av de 14 pasientene (varierer fra 1-4 EGFR-positive celler i CTC-positive kohort) (fig 1b). I denne studien ble 38 kliniske blodprøver analyseres parallelt. Kombinere AdnaTest
® og CellSearch
® 19 av 38 (50%) analyserte prøvene ble positiv for CTCs (fig 1c). Innenfor denne gruppen,
EGFR Twitter /EGFR signaler korrelerte ikke siden bare én pasient var
EGFR
-positivt med AdnaTest
®, men hadde EGFR-negative CTCs med CellSearch
® (pasient 42). En detaljert oversikt over CTC analyser i Tabell 2. Femten prøvene var CTC-negativ i begge CTC analyser og 5 pasienter var CTC-positive i begge analysene. Syv prøvene var positive i CellSearch
® og negativ for AdnaTest
®, mens sju tilfellene var utelukkende positive for AdnaTest
®. Resultatene av begge analysene korrelerte ikke signifikant (Cohen kappa = 0,1066, p = 0,51) (Fig 1 D).
(A) sammenfattet markør analyser av CTCs oppdages med den AdnaTest
®. CTCs ble positivt identifisert dersom minst en av multipleks PCR markører (
EpCAM
,
CEA
, eller
EGFR
) ble oppdaget. (B) CTC oppregning av CellSearch
® inkludert EGFR besluttsomhet. (C) CTC positivitet rate av AdnaTest
®, CellSearch
®, eller begge deler analysen i kombinasjon. (D) Sammenligning mellom AdnaTest
® og CellSearch
® system.
Korrelasjonen av CTC funn metastatisk nettstedet og terapi
Bruke AdnaTest
®, ble ingen korrelasjon funnet av CTC-positivitet og plasseringen av metastaser (p 0,05). Lignende funn ble observert ved bruk CellSearch
® (p 0,05). Kombinere begge analysene også ikke resulterte i en signifikant sammenheng mellom metastase plassering og CTC status (p 0,05). CTC status ble ikke korrelert med å ha en eller flere metastaser (p 0,05) i en hvilken som helst av de CTC deteksjonsmetoder. Interessant nok var CTC positivitet hastighet assosiert med en høyere linje av terapi, median 2
nd linje i tilfelle av CTC negativitet i forhold til median 4
th linje i tilfelle av CTC positivitet.
Korrelasjonen av CTC funnene til klinisk utfall
Kaplan-Meyer kurver og log-rank statistikken for CTC-negative og CTC-positive tilfeller viste ingen signifikant korrelasjon vedrørende progresjonsfri overlevelse (PFS) når du bruker AdnaTest
® (p = 0,43) (figur 2A). For CellSearch
® ble observert en signifikant sammenheng mellom PFS og CTC status (p = 0,0467) (fig 2B). En kombinasjon av begge analysene igjen ikke viser en signifikant korrelasjon til PFS, men viste en tendens (p = 0,084) (figur 2C).
Vi har også testet om tilstedeværelse av CTCs av AdnaTest
®, CellSearch
® eller de samlede resultatene ble assosiert med redusert total overlevelse (OS) i vår mCRC pasient kohort. Ved hjelp av Kaplan-Meier-analysen en signifikant korrelasjon kunne bare sees når begge analysene ble slått sammen (p = 0,013), mens de enkelte analysene alene ga ingen signifikant prognostisk informasjon (AdnaTest
®: p = 0,31, CellSearch
®: p = 0,080) (fig 3A-3C).
Diskusjoner
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall og pålitelige blodbaserte biomarkører er sterkt behov for å forbedre forhånd behandling valg og endringer under behandlingen. Til dags dato den mest brukte blodbaserte markør i CRC er CEA å få prognostisk informasjon ved oppstart og prediktiv informasjon under behandling [22-24]. Til tross for den utstrakte bruk av CEA som en biomarkør blod er det ingen spesifikk sykdom, påvirket av andre faktorer, og ikke like pålitelig som andre mer nylige blodbaserte biomarkører (f.eks CTCs) [25].
OS er det mest pålitelig endepunkt i kliniske studier, og påvisning av CTCs har allerede blitt vist å ha en prognostisk effekt i mange tumortyper, inkludert mCRC [11, 12, 21, 26-28]. I vår kohort, kunne vi observere høyere CTC deteksjon priser og bedre prognostisk informasjon om OS når grer to forskjellige CTC alarmsystem-FDA-ryddet CellSearch
® teknologi og AdnaTest
®. Prognosen for PFS signifikant korrelert med CTC deteksjon ved bruk CellSearch
® alene (p-verdi 0,046 vs. 0,43 når du bruker AdnaTest
® og 0,084 for kombinerte analyser av begge analysene). Men PFS per definisjon refererer til den dato progresjon oppdages og dessuten avhengig av radiologisk vurdering av lege, noe som gjør PFS en mer upålitelig endepunkt.
Betydelige discordances mellom CellSearch
® og AdnaTest
® i deteksjon av CTCs ble allerede publisert [16, 29, 30]. Imidlertid har ingen av disse studiene korrelert forekomsten av CTCs til klinisk resultat. I denne studien, en kombinasjon av CellSearch
® system og AdnaTest
® økte oppklaringsprosenten fra 30% til 50% (30% ved bruk av AdnaTest
®; 33% ved bruk av CellSearch
® (≥3 CTCs), 50% hvis begge analysene ble kombinert). CTC positivitet sats ser ut til å være forbundet med avansert linjen av behandling (tabell 2), som argumenterer for antagelsen om at høyere CTC teller hjelpe pasientene til å erverve resistens mot systemiske behandlinger. I lys av den markerte heterogenitet av CTCs i CRC [31], tilstedeværelsen av flere CTCs bør øke sjansen til båtplass resistente kloner.
Selv om vi kunne tydelig viser at begge metoder i kombinasjon forbedre positivitet sats for CTCs 50% av pasientene fortsatt negative til tross for tilstedeværelsen av åpenbare metastaser. Foruten tekniske begrensninger analysene (se neste avsnitt) det kan være en interessant biologi bak den observasjon at CTC nivåer i CRC er lavere enn i brystkreft. Man kan argumentere for at tumor celle spredning i CRC er mindre uttalt, som også ville forklare hvorfor CRC pasienter med levermetastaser kan bli kurert ved kirurgi i ca 20%, mens en slik kur er sjelden oppnås ved samme behandling ved brystkreft.
Begge analysene som benyttes i våre studier er avhengige av ekspresjonen av epitel-celleoverflatemarkører, og er derfor sannsynlig å savne CTC populasjoner som har gjennomgått en fullstendig epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) [32-34]. Imidlertid har nyere arbeid vist at kreftceller med en mellom fenotype er trolig den mest aggressive i stand til å spre og vokse på fjerne områder på grunn av sin høye plastisitet [35, 36]. Den CellSearch
® system og AdnaTest
® er begge i stand til å oppdage EMT-forbundet CTCs [37, 38]. Dermed blir CTC analyser som brukes i denne undersøkelsen målet epitel og mellom CTCs, mens rene mesenchymale CTCs (mangler noen uttrykk for epiteliale markører) trolig tapt. Påvisningen av rene mesenchymale CTCs er allikevel meget vanskelig, fordi selv om etikett-fri (dvs. EpCAM-uavhengig) fange systemer brukes (f.eks filter) epiteliale markører slik som keratin er vanligvis brukes for påvisning av CTCs på grunn av manglende mesenchymale markører som ikke er uttrykt på de omkringliggende blodlegemer. I denne sammenheng Plastin-3, ikke en actin-kobling av protein nedregulert i løpet av EMT på CRC og brystkreftceller og ikke-uttrykt på leukocytter-kan være et stort fremskritt [33, 34].
Cell-free nukleinsyrer (f.eks cellefri tumor DNA eller mirnas) er også for tiden diskutert for å være egnet som nye blodbaserte biomarkører [39]. Endringer i deres konsentrasjon, så vel som DNA-forandringer ble vist allerede å bli brukt for diagnose, behandling overvåking, prediktive eller prognostiske formål [40-43]. Imidlertid er de fleste av ctDNA avledet fra apoptotiske tumorceller, mens CTC analyse har den fordel å studere levedyktige tumorceller, som også kan forbedre vår nåværende forståelse av tumorcellespredning hos kreftpasienter. Videre så langt ingen standardisert analyse /protokoll for påvisning av cellefrie nukleinsyrer eller mirnas kunne etableres i mCRC sykdom og forskjellige metoder for oppdagelse av slike biomarkører brukes i laboratorier over hele verden. Bare nylig, ble en standardisert arbeidsflyt strategi foreslått for normalisering av miRNA uttrykket data som en roman utgangspunkt for standardiserte prosedyrer for å tillate data sammenligning på tvers av ulike laboratorier [44]. Utviklingen av standardiserte assys som kan brukes for companion diagnostics er i fokus i det nyetablerte EU-IMI konsortium kalt CANCER-ID (www.Cancer-id.eu).
Mange debatten pågår om CTCs kan brukes som flytende biopsier guiding individualisert behandling beslutninger [10]. Bruke AdnaTest
® og CellSearch
® vi var i stand til å oppdage relevante terapeutiske mål som
EGFR Twitter /EGFR. Signaler for
EGFR Twitter /EGFR på CTCs korrelerte ikke i vår studie mellom AdnaTest
® og CellSearch
® (tabell 2), noe som trolig skyldes ulike CTC populasjoner er tatt med våre analyser . Dette viser igjen komplementaritet av begge analysene.
Oppsummering, vi kunne vise at en kombinasjon av ulike CTC analyser øker forekomsten av CTCs i en uselektert gruppe mCRC pasienter. En signifikant korrelasjon til OS kunne bare sees når begge analysene ble slått sammen (p = 0,013). Disse funnene kan bidra til å etablere CTCs som på-behandling biomarkører for klinisk rutine i fremtidige studier.
