Abstract
Fettvev er nå ansett som en endokrin organ involvert i metabolske og inflammatoriske reaksjoner. Adiponectin, et 244-aminosyre peptidhormon, er assosiert med insulinresistens og karsinogenese. Curcumin (diferuloylmethane) er hoved curcuminoid av den populære indiske krydder, gurkemeie. Curcumin besitter antitumorvirkninger, inkludert inhibering av neovaskularisering og regulering av cellesyklusen og apoptose. Men effekten av adiponectin og curcumin på ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) fortsatt uklare. I denne studien evaluerte vi ekspresjonen av adiponectin i parvise tumorer og normalt lungevev fra 77 pasienter med NSCLC ved hjelp av sanntids-polymerase kjedereaksjon, western blotting, og immunhistokjemi. Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse viste at pasienter med lav adiponectin uttrykk forhold (mindre enn 1) hadde signifikant lengre overlevelsestid enn de med høy ekspresjon forhold ( 1) (
p
= 0,015). Curcumin hemmet trekkfugl og invasiv evne til A549 cellene via hemming av adiponectin uttrykk ved å blokkere adiponectin reseptoren 1. Curcumin behandling også hemmet
in vivo
tumorvekst av A549 celler og adiponectin uttrykk. Disse resultatene tyder på at adiponectin kan være en prognostisk indikator på NSCLC. Effekten av curcumin i å redusere trekkfugl og invasiv evne til A549 celler ved å hemme adiponectin uttrykk er sannsynligvis mediert gjennom NF-kB /MMP veier. Curcumin kan være en viktig potensiell adjuvant terapeutisk middel for lungecancer i fremtiden
relasjon:. Tsai J-R, Liu P-L, Chen, Y-H, Chou S-H, Cheng, Y-J, Hwang J-J, et al. (2015) Curcumin hemmer ikke-småcellet lungekreft celler metastaser gjennom Adiponectin /NF-kB /MMP signalveien. PLoS ONE 10 (12): e0144462. doi: 10,1371 /journal.pone.0144462
Redaktør: Jeremy J.W. Chen, Institute of Biomedical Sciences, TAIWAN
mottatt: 18 august 2015; Godkjent: 18 november 2015; Publisert: 10.12.2015
Copyright: © 2015 Tsai et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering: Denne studien ble støttet av tilskuddene NSC 100 – 2320 – B – 037-012 – MY2 fra National Science Council of ROC, Taiwan til Jong-Rung Tsai.. The National Science Council of R.O.C, Taiwan er en statlig organisasjon som er ekstern til forfatternes universitetet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er fortsatt den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet over hele verden og i Taiwan. Til tross for store fremskritt i forståelsen av lunge kreftutvikling og i nye behandlinger i de siste tiårene, er fortsatt den samlede fem års overlevelse dårlig. Innovativ forskningsinnsats må bli omdirigert for å undersøke mulige markører for prognose, mekanismer av lunge kreftutvikling, og adjuvant behandling.
Fettvev er i dag ansett som en endokrin organ som utskiller flere cytokiner (adipokines) [1], inkludert adiponektin og leptin. Adiponectin er et 244-aminosyre-polypeptid som modulerer en rekke metabolske prosesser som glukoseregulering og fettsyre katabolisme [2]. Det utøver betydelige virkninger på metabolismen og lipogenese, samt for regulering av humane inflammatoriske responser [3]. Hos voksne er adiponectin konsentrasjoner omvendt korrelert med fettprosent og insulinresistens [4]. Adiponectin har antidiabetika, anti-aterogene, anti-inflammatorisk og anti-angiogene egenskaper [5].
Rollen adiponectin i kreftutvikling er kontroversielt [5]. I fedme-assosiert malignitet som livmorkreft, postmenopausal brystkreft, tykktarmskreft, nyrekreft, og hematologisk kreftsykdom, er adiponectin uttrykk positivt korrelert med risikoen for malignitet. Videre har lave adiponectin konsentrasjoner er rapportert i mage og prostatakreft [6]. Men i ikke-fedme-assosiert kreft, for eksempel lungekreft, er serum adiponectin ikke en viktig prediktor for risiko [7].
adiponectin reseptorer 1 og 2 handle direkte på kreftcellene ved å binde og aktivere adiponectin reseptorer og nedstrøms signalveier [5]. Adiponectin besitter anti-angiogenese og antitumor-egenskaper, noe som skjer gjennom caspase-mediert endotel celle apoptose [8]. Det kan også hemme levertumorvekst og metastase ved å undertrykke tumor angiogenese og downregulating den ROCK /IP10 /matriksmetalloproteinase (MMP) -9 pathway [9].
Det er adiponectin en potensiell markør for prostatakreft progresjon [ ,,,0],10]. I kondrosarkom, medierer den migrering av humane kondrosarkom celler av den transkripsjonelle oppregulering av alpha2beta1 integrin og aktivering av AdipoR reseptoren, AMPK, p38 og NF-kB trasé [11]. Likevel, dens rolle i lungekreft er fortsatt uklart [12,13]. Petridou et al. rapportert at sirkulerende adiponectin nivåer ikke er korrelert med lungekreft etapper [14]. Uttrykket av adiponectin reseptor 1 er en gunstig prognostisk faktor for lungekreft [15].
Curcumin (diferuloylmethane), et naturlig stoff hentet fra
Curcuma longa
, har vært brukt siden antikken i Orienten som en helbredende agent for ulike sykdommer. Curcumin har flere farmakologiske virkninger, inklusive anti-inflammatorisk [16], [16] antioksidant, antimikrobiell [17] og kreft effekter [18-21]. Dens kreft effekter er manifestert under celledeling, invasjon, metastasering, apoptose, og angiogenese [22]. For eksempel kan curcumin indusere cellulær apoptose i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [23,24]. Den molekylære grunnlaget for sin anticarcinogenic effekten skyldes dens effekt på flere mål, inkludert transkripsjonsfaktorer, vekstregulerende midler, adhesjonsmolekyler apoptotiske gener, angiogenese regulatorer, og cellulære signalmolekyler [25]. Selv curcumin hemmer lungekreft celle migrasjon og invasjon via Rac-1 eller Wnt /B-catenin trasé, reguleringsmekanisme av curcumin i lungekreft er fortsatt ukjent.
De fleste lungekrefttilfellene er diagnostisert på et avansert stadium når behandlingen er relativt ineffektiv. Hvordan øke tilgjengelige kjemoterapeutiske behandlinger med annen tilleggs urte medisiner, noe som kan redusere bivirkninger og toksisitet uten at det går terapeutisk effekt, har blitt en populær tilnærming i de siste tiårene. Curcumin er en slik potensiell kandidat. Denne studien utforsket diagnostiske og prognostiske roller adiponectin i NSCLC. Ved hjelp av
in vitro
A549 cellekultur og en dyremodell, viste vi den potensielle rolle curcumin for behandling av lungekreft. Den nøyaktige molekylære mekanisme av curcumin i mediering adiponectin effekt ble også undersøkt. Følgelig vil potensialet for curcumin som en adjuvant agent i lungekreft behandling også utforskes.
Resultater
Demografiske data og adiponectin uttrykk i NSCLC pasienter
Av de 77 NSCLC pasientene i denne studien, 58 (75%) hadde histologisk bekreftet adenokarsinom og 19 (25%) hadde plateepitelkarsinom. Gjennomsnittsalderen var 61,6 ± 10,3 år (range, 36-78 år). Adiponectin ekspresjon ble ikke korrelert med tumor (T), lymfeknuter (N), og trinn. NSCLC pasienter med metastaser hadde signifikant høyere adiponektin uttrykk ratio (tabell 1). Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viste at NSCLC pasienter med et lavt adiponectin uttrykk forholdet hadde en betydelig lengre overlevelsestid enn de med høy adiponectin uttrykk ratio (
p
= 0,015) (fig 1). Multivariate justert risikoforhold ble beregnet fra Cox regresjon med tilleggsvariablene kjønn (mannlige kontra kvinnelige), metastaser, tumor, spredning til lymfeknuter, og stadier (tabell 2). Den høye adiponectin uttrykket gruppen hadde en 2,40 ganger høyere dødsrisiko (
p
= 0,04) enn den lave uttrykk gruppen.
Expression nivåer av adiponektin, adiponectin reseptorer, og MMP i NSCLC pasienter
uttrykk nivåer av adiponectin, adiponektin reseptorer, og MMP av NSCLC pasienter ble analysert (fig 2). Immunhistokjemisk farging og western blotting av lungekreft vev viste en økt uttrykk av adiponectin og adiponectin reseptor 1 i lungekreft vev enn i normalt lungevev (figur 2A-2C). Alle MMP’er ble også øket i lungen kreftvev enn i den normale lungevevet (figur 2D-2F).
(A) Prøver (lungekreft og de tilsvarende normale tilstøtende lungevev) ble analysert med antistoffer mot adiponektin , adiponectin reseptor 1, og adiponectin reseptor 2 ved immunhistokjemisk farging (DAB farging og hematoxylin kontra). For negative kontroller ble antistoffet erstattet med kontroll IgG. (B-C) Expression nivåer av adiponectin, adiponectin reseptor 1, og adiponectin reseptor 2 i tre par lungekreft og normalt vev analysert ved Western blotting. (D-F) Gelatin zymografi ble brukt til å analysere aktiviteten av MMP-2 /MMP-9, MMP-1 /MMP-3 og MMP-13 /MMP-14. *
p
0,05 vs. normalt lungevev, med representative data fra tre forskjellige pasienter med NSCLC. T, svulst; N, normal; ADN, Adiponectin; AdipoR1, adiponectin reseptor 1; AdipoR2, adiponectin reseptor 2.
cytotoksiske effekten av curcumin på uttrykk for adiponectin og adiponectin reseptorer i A549 celler
A549 celler ble behandlet med ulike konsentrasjoner av curcumin. MTT-analysen viste at curcumin hadde en cytotoksisk effekt på A549-cellelinjer ved konsentrasjoner 75 pM (figur 3A). Western blotting viste også at uttrykket av adiponectin i A549 cellene betydelig redusert ved en konsentrasjon på curcumin 50 uM (figur 3B). Proteinet ekspresjon av adiponectin reseptor 1 og adiponectin reseptor 2 endret seg ikke med curcumin behandling selv ved høye konsentrasjoner. Transfeksjon av A549-celler med adiponectin vektor eller liten interfererende RNA (siRNA) plasmid med hell økes eller dempet ekspresjonen av adiponectin, som demonstrert ved polymerase kjedereaksjon (PCR) og Western blotting (fig 3C og 3D).
(A) Cellelevedyktigheten ble analysert ved MTT-assay. Den cytotoksiske effekten av curcumin var tydelig ved konsentrasjoner 75 mikrometer. (B) Expression nivåer av adiponectin, adiponectin reseptor 1, og adiponectin reseptor 2 i A549 celler ble analysert ved western blotting på ulike curcumin konsentrasjoner. (C-D) Eksogene induksjon og stanse av adiponectin uttrykk i A549 celler. Adiponectin mRNA /protein uttrykk i A549 celler økt betydelig etter eksogene adiponectin uttrykk som analyseres ved real-time PCR. Adiponectin uttrykk sunket betraktelig etter siRNA-mediert adiponectin stanse. NC-siRNA tjente som en negativ kontroll. Representative bilder av tre uavhengige forsøk. *
p
0,05 vs. kontroll. Analysene ble utført i tre eksemplarer.
Effekter av curcumin og adiponectin på trekkfugl og invasiv evne til A549 celler
Cellular migrasjon ble analysert ved sår scratch analysen, mens invasivitet ble bestemt av Matrigel-belagte Boyden kammeret analysen. Sammenlignet med kontrollgruppen, og den vandrende invasiv evne til A549-celler ble signifikant inhibert med curcumin behandling på en doseavhengig måte (
p
0,05) (figur 4A og 4B). På den annen side, rekombinant adiponectin økte invasiv og vandrende evne til A549-celler på en doseavhengig måte (
p
0,05) (Fig. 4C og 4D)
(A) Cellular migrasjon ble bestemt ved bruk av scratch såret analyse og analysert ved hjelp av Wimasis WimScratch programvare. Den vandrende evne til A549-celler ble hemmet signifikant ved økning curcumin dosering sammenlignet med kontrollgruppen (
p
0,05). (B) Invasivitet ble bestemt av Matrigel-belagte Boyden kammeret analysen. Curcumin betydelig redusert invasiv evne til A549-celler (
p
0,05) når curcumin konsentrasjonen var 25 uM. (C-D) Anvendelsen av rekombinant adiponectin (rADN) økte betydelig trekkfugl og invasiv evne til A549 celler (
p
0,05). Resultatene fra tre uavhengige eksperimenter er vist; analysene ble utført i tre eksemplarer.
Regulatoriske roller adiponectin reseptor-en og adiponectin reseptor 2 i migrasjon og invasivitet av A549 celler
A549 celler ble transfektert med adiponectin siRNA, adiponektin reseptor en siRNA og adiponectin receptor 2 siRNA plasmid. Plasmid transfeksjon betydelig redusert uttrykket nivåer av adiponectin, adiponectin reseptor 1, og adiponectin reseptor 2 i A549-celler, som bekreftet ved Western-blotting (fig 5A-5C). Dempe den adiponectin uttrykket ikke påvirker ekspresjonen av både adiponectin reseptor 1 og 2 reseptoren, men tie ekspresjon av reseptoren adiponectin en blokkerte virkningen av adiponectin, som forbedret vandrende og invasive evne til A549-celler. Imidlertid, tie ekspresjon av adiponectin reseptor 2 ikke motvirke effekten av adiponectin på migrering og invasivitet av A549-celler (figur 5D og 5E).
(A-C) Uttrykket nivåene av adiponectin, adiponektin reseptor 1, og adiponectin reseptor 2 ble analysert ved western blotting etter transfeksjon med adiponectin vektor eller stanse ved siADN, siAdipoR1, og siAdipoR2. (D-E) Den trekkfugl og invasive evne til A549-celler ble hemmet etter stanse av adiponectin reseptor 1 uttrykk ved transfeksjon med siAdipoR1.
Regulatoriske veier av curcumin i adiponectin uttrykk
de A549-celler ble behandlet med forskjellige typer av inhibitorer, inkludert inhibitorer av PI3K /AKT og MAP-kinase-reaksjonsveier {PI3K (LY294002; 10 uM), AKT (API-59; 3 uM), og MAPK-inhibitorer [PD98059 (10 pM) , SB203580 (10 uM), og SP600125 (10 uM) for ERK, p38-MAPK, og JNK, henholdsvis]} i 1 time og senere med curcumin (50 uM) i 24 timer. ERK og p38 pathway hemmere blokkeres den hemmende effekten av curcumin på adiponectin uttrykk (Fig 6A). Videre rekombinant adiponectin øket ekspresjon av AKT (figur 6B). Elektroforetiske mobilitet shift analyse (EMSA) viste at adiponectin regulert NF-kB uttrykk gjennom AKT pathway (Fig 6C).
(A) A549 celler ble behandlet med ulike PI3K /AKT og MAP kinase pathway hemmere {(PI3K (LY294002, 10 mm), AKT (API-59; 3 mm), MAPK hemmere [PD98059 (10 mm), SB203580 (10 mm), og SP600125 (10 mm) for ERK, p38-MAPK, og JNK, henholdsvis] } i 1 time og senere med curcumin (50 uM) i 24 timer. adiponectin-ekspresjon ble analysert ved western blotting. (B) AKT-ekspresjon ble analysert ved western blotting med forskjellige konsentrasjoner av rekombinasjon adiponectin. (C) aktiviteten av p65 /p50 av A549 celler ble analysert ved EMSA etter behandling med rekombinant adiponectin eller AKT inhibitor (API-59; 3 mm). henholdsvis
Co-immuno-nedbør (Co-IP) assay
Denne analysen viste at adiponectin besto av monomer, dimer, og multimer (fig 7A). Curcumin og stanse adiponectin transfeksjon hell redusert uttrykk av adiponectin monomer og dimer. Curcumin også redusert p65 ekspresjonen, som vist med Co-IP og EMSA-analyser (figur 7B og 7C). Forbedret adiponectin uttrykk ved transfeksjon med adiponectin også økt NF-kB uttrykk. Adiponectin kan translocate til kjernen til å binde med atom p65.
(A) A549 celler behandlet med curcumin, forstummet, eller transfektert med adiponectin ble lysert og adiponectin var co-immunoutfelt hjelp adiponectin antistoff. Immunoblotting med de angitte antistoffer bekreftet ko-utfelling av adiponectin monomer, dimer, og multimer. (B) Co-immunoutfelling ble utført ved anvendelse av anti-adiponectin og anti-P65-antistoffer. Den p65 elute ble separert på SDS-PAGE og immunoblottet med de tilsvarende antistoffer, som viste betydelig assosiasjon av adiponectin med p65-komponenten. (C) Aktivering av NF-kB ved overekspresjon eller stanse av adiponectin ble bestemt av EMSA. Adiponectin økte kjernefysiske translokasjon av p65 /p50 og NF-kB aktivering, men stanse adiponectin uttrykk hatt motsatt effekt.
In vivo Hotell og
in vitro
effekten av adiponectin på MMP uttrykk
Transfeksjon med adiponectin vellykket økt uttrykket nivåer av MMP-2, -9, -1 og -14 i A549 celler. Men den uttrykk for MMP-3 og -13 ikke endre med forbedret eller taushet adiponectin uttrykk (Fig 8).
Gelatin zymografi ble brukt til å analysert virksomheten til MMP-2 /MMP-9, MMP- 1 /MMP-3 og MMP-13 /MMP-14. (A-F) Virksomheten til MMP-9, -1 og -14 ble økt etter overekspresjon av adiponectin og minsket med stanse av adiponectin. Uttrykk av MMP-3 og -13 endret ikke uavhengig av adiponectin styrking eller stanse.
In vivo
effekten av curcumin på tumorvekst og uttrykk av adiponectin og MMP
Curcumin behandling signifikant redusert
in vivo
tumorvekst og adiponectin ekspresjon sammenlignet med kontrollgruppen (DMSO) (
p
0,05) (figur 9A og 9B), men uttrykk for både adiponectin reseptor 1 og receptor 2 ikke endre (figur 9C). Curcumin behandling også signifikant reduserte nivåer av alle MMP’er, med unntak av MMP-1 som forble upåvirket, sammenlignet med kontrollgruppen (figur 9D-9F).
(A) Tumorstørrelser på curcumin-behandlede mus var betydelig redusert sammenlignet med de i kontrollgruppen etter 14 dager. (B) Tumor adiponectin ekspresjon av curcumin-behandlede mus ble betydelig redusert sammenlignet med kontrollgruppen. (C) Uttrykk for både adiponectin reseptor 1 og receptor 2 i curcumin-behandlede mus ikke endre
in vivo
. (D-F) Expression nivåer av MMP-2, -9, -3, -13 og -14 ble redusert med curcumin behandling
in vivo
. MMP-1 uttrykk ble ikke endret.
Diskusjoner
Kjemoterapi er fortsatt den primære behandling for avansert lungekreft [26], selv om målrettet terapi er mer populært. Alvorlige bivirkninger av cellegift vanligvis begrense deres klinisk anvendelse. Følgelig er klinikere stadig mer interessert i urtemedisin siden de siste tiårene på grunn av sin sikkerhet og effektivitet som en adjuvant behandling. Curcumin, en fenolisk forbindelse avledet fra planten
Curcuma longa
, har vært brukt i århundrer for sin anti-inflammatorisk, Kjemopreventivt og potensielle kjemoterapeutiske egenskaper. Inntil nå viser gjeldende bevis for at curcumin kan blokkere kreftcelle spredning, transformasjon, og invasjonen [27]. Denne studien viste at curcumin kan hemme den vandrende og invasive kapasitet på A549-celler
in vitro
på en doseavhengig måte. Videre curcumin også betydelig redusert
in vivo
tumorvekst.
Tumor invasjon og metastasering er en komplisert flertrinnsprosess som involverer etterlevelse, nedbrytning av den omkringliggende matrise, migrasjon, spredning, og angiogenese [ ,,,0],28]. Curcumin har høy naturlig antimetastatic evne. Det kan redusere invasjonen av B16F-10 melanomceller ved å hemme ekspresjon av MMP-2 og MMP-9 og forbedre ekspresjonen av antimetastatic proteiner (E-cadherin og vev inhibitorer av MMP-2) [29,30]. I en xenograft tumormodell av prostata eller brystkreft, curcumin viste også høy antimetastatic virkning ved å undertrykke ekspresjonen av MMP-9, NF-kB, og cyklooksygenase-2 [31,32]. I denne studien kan curcumin hemmer migrasjon og invasjon av A549 på en doseavhengig måte
in vitro
. I vår xenograft modell med A549, kan curcumin betydelig redusere tumorvekst og har en lignende undertrykkende effekt av ekspresjonen av MMP’er, med unntak av MMP-1 og -13.
Fettvev er ansett som et endokrine system som kan utskiller en rekke hormoner og cytokiner, som er kjent som adipocytokines [33]. Adiponectin representerer den mest rikelig fettvev protein med insulin-sensibiliserende, anti-inflammatorisk og anti-aterogene egenskaper [34,35]. I tillegg kan adiponectin spille en rolle i utviklingen og progresjonen av forskjellige typer av maligne tilstander [35]. Serumet adiponectin nivå er omvendt forbundet med faren for fedmerelaterte maligniteter, inkludert bryst, endometrial, og prostata cancer, men det er positivt korrelert med magekreft og leukemi [35].
imidlertid den prognostiske rolle av sirkulasjons adiponectin i lungekreft er fortsatt kontroversielt [12,14]. I denne rapporten har adiponectin uttrykk ikke relatere til kreft TN og stadier lunge. Lungekreftpasienter med lav adiponectin uttrykk forholdet viste lengre overlevelse enn de med høy ekspresjon. Dermed kan adiponectin uttrykk være en prognostisk faktor av NSCLC.
I denne studien har vi også vist at NSCLC pasienter med metastaser har betydelig høyere adiponektin uttrykk forhold enn de uten metastaser. Overekspresjon av adiponectin ved transfeksjon kan øke invasive og metastatisk evne til A549-celler, kanskje gjennom aktivering av MMP’er (1, 9, 14). Adiponectin kan hemme colon [36,37] og lever [37] kreftcellemigrasjon, men fremmer prostata og livmorkreft vekst. Derfor rolle adiponectin i karsinogenese er variabel i ulike kreftcelletyper
Så langt har tre typer adiponectin reseptorer er identifisert. De to viktigste reseptorene AdipoR1 og AdipoR2 og en reseptor ligner på cadherin familien. AdipoR1 og AdipoR2 er sju transmembranproteiner som kan megle fettsyreoksidasjon og glukoseopptak via adiponectin bindende. Funksjonelle adiponectin reseptorer er vanligvis uttrykt i lunge epitelceller. Ved hjelp av immunhistokjemisk farging, Jamshid et al. viste at ekspresjon av AdipoR1 og AdipoR2 er lavere i NSCLC vev enn i normalt lungevev. Her viste vi en økt AdipoR1 protein uttrykk og immunhistokjemisk farging i NSCLC vev. Dempe den AdipoR1 uttrykket kan blokkere effekten av adiponectin på migrasjon og invasivitet av A549 celler. Blokkering av AdipoR2 uttrykket påvirket ikke den vandrende evne til A549-celler.
Curcumin har blitt en effektiv adjuvant middel i cancerterapi som det kan modulere aktiviteten av flere transkripsjonsfaktorer og deres signalveier [38]. Det kan indusere cellulær apoptose gjennom aktivering av p38-reaksjonsveien i lungekreft og eggstokk-tumor [39]. Men det regulatoriske rolle curcumin i adiponectin uttrykk er fortsatt uklart. Vi viste at curcumin hemmer adiponectin uttrykk gjennom p38 og ERK veier. Videre kan adiponectin indusere aktivering av AKT vei, som også er involvert i aktivering av NF-kB veien i lungekreft.
I konklusjonen, kan adiponectin være en roman potensiell prognostisk markør for NSCLC. Bortsett fra klassiske kjemoterapi,
in vivo Hotell og
in vitro
resultater bekrefte at curcumin kan brukes som en adjuvant agent i lungekreft behandling i fremtiden. Imidlertid kan dårlig absorpsjon, metabolisme, og biotilgjengeligheten av curcumin begrense klinisk anvendelse. Flere formuleringer er utarbeidet som inneholder nanopartikler, liposomer, miceller og fosfolipid komplekser, som kan øke biotilgjengeligheten og fremme lenger sirkulasjon, bedre permeabilitet, og motstand mot metabolske prosesser av curcumin [40].
Materialer og Metoder
Tumor prøvetaking
NSCLC og tilsvarende normale vev ble samlet fra 77 pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon mellom 2004 og 2011 ved Divisjon for Thoracic Surgery, kirurgisk avdeling, Kaohsiung Medical University Hospital. Vevsprøvene ble umiddelbart plassert i flytende nitrogen for forsendelse til laboratoriet og deretter lagret i -80 ° C fryseboks til RNA isolering og proteinekstraksjon. Komplett staging prosedyrer, inkludert bryst radiografi, bronkoskopi, computertomografi av hjernen og brysthulen, sonography, og bein scintigrafi, ble utført for å bestemme nøyaktig tumoregenskaper i henhold til TNM International Staging System for lungekreft [41]. Alle pasientene ble fulgt opp fram til mars 2012. Detaljer om deres demografiske og overlevelsesdata ble oppdatert.
Etikk uttalelse
koahsiung medisinske universitetet sykehusets Institutional Review Board for forskning godkjent studieprotokollen (KMUH -IRB-990357). Alle deltakerne gitt skriftlig informert samtykke.
RNA ekstraksjon og real-time PCR
Total RNA ble isolert fra frosset lunge svulst vev av NSCLC pasienter og tilsvarende normale tilstøtende lunge vev. RNA isolert fra normalt lungevev, lungetumorvevet, og lungekreftceller ble analysert ved hjelp av sanntids-PCR, som ble utført som beskrevet tidligere [42]. Følgende primere for real-time PCR ble utformet med Primer Express-programvaren (RealQuant, Roche, Mannheim, Tyskland) ved hjelp av publiserte sekvenser: menneskelig adiponectin følelse primer: 5′-GGT GAT GGC AGA GAT GGC AC-3 «og adiponektin antisens primer : 5’GCC TTG TCC TTC TTG AAG AG-3 «og menneskelig GAPDH følelse primer: 5′-AGC CAC ATC GCT CAG ACA-3′ og GAPDH antisens primer: 5»-GCC CAA TAC GAC CAA ATC C-3 « .
Fluorescens data ble kjøpt i slutten av utvidelsen. Smelte-analyse ble utført for alle produkter for å bestemme spesifisiteten til forsterkning. I tillegg ble PCR-produktene elektroforese på 1% agarosegeler for å bekrefte tilstedeværelse av riktig bånd størrelser. Den relative ekspresjon ble beregnet som et forhold av uttrykket i det lungekreft vevet sammenlignet med ekspresjon i normalt tilstøtende vev (tumorlesjon /normalt vev en, høy ekspresjon, og mindre enn en, lav ekspresjon) [42-44 ].
Immuno-histokjemisk farging
vevsprøver ble dissekert fra humant lungevev, fiksert i 4% bufret formalin løsning over natten, i parafin, og kuttet i 5-mikrometer tykkelse seksjoner. De parafinsnitt ble de-paraffinized med xylen og farget med anti-human adiponectin (GeneTex, Irvine, CA, USA), adiponectin reseptor 1 (AdipoR1), og adiponectin reseptor 2 (AdipoR2) (Santa Cruz, CA, USA). Etter vasking med fosfatbufret saltløsning (PBS), ble seksjonene inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. For fargereaksjoner, ble diaminobenzidine (DAB) brukt og kontra med hematoksylin. For negative kontroller ble antistoffet erstattet med kontroll IgG.
Western blotting
Western blotting ble utført som beskrevet tidligere [42], hvoretter membranene ble behandlet med PBS inneholdende 0,05% Tween 20 og 2% skummet melk i 1 time ved romtemperatur og inkubert separat med muse-anti-human adiponectin (GeneTex, Irvine, CA, USA), AdipoR1, AdipoR2, p65, p50, MMP’er (2, 9, 1, 3, 13, 14) (Santa Cruz, CA, USA), Histone H1, AKT /Pakt, P38 /pP38 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), og β-aktin (Abcam, Cambridge, MA, USA) i 1 time. Etter vasking ble membranene inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert kanin-anti-geit eller mus IgG ved romtemperatur. Immundeteksjon ble utført ved hjelp chemiluminescence reagent pluss NEN og eksponering for Biomaks MR Film (Kodak, Rochester, NY, USA).
Culture of NSCLC celler
Lung adenokarsinom A549-celler (ATCC CCL-185) ble dyrket i kolber som inneholdt F12K vekstmedium supplementert med 5% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin, og 100 pg /ml streptomycin ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2.
Dempe uttrykket av adiponectin, adiponectin reseptor 1, og adiponectin reseptor 2 i A549 celler
siRNA, homolog en bestemt dobbel-strandet 21-nukleotid RNA-sekvens til målet genet, var brukes til å slå av uttrykk for AdipoR1, og AdipoR2. Menneskelig adiponectin siRNA følelse primer: 5′-GUG UGG GAU UGG AGA CUU ATT-3 «og antisense primer: 5’UAA HiG UCC AAU CCC ACA CTT»-3 (Santa Cruz, CA); human AdipoR1 siRNA forstand primer: 5′-GGA CAA CGA UCU CUA GCU ACA-3 «og antisense-primer: 5′-UCU AGC AGA UAG UCG UUG UCC-3′; og AdipoR2 siRNA følelse primer: 5»-GGA Guu UCG UUU CAU GAU CGG-3 «og antisense primer: 5′-CCG AUC august AAA CGA AAC UCC-3». ble brukt (Sigma-Aldrich, Singapore)
stanse effekten av siRNA transfeksjon ble vurdert av real-time PCR og immunoblotting. I korthet ble cellene dyrket i et seks-brønners plate og transient transfektert med 20 nM siRNA ved hjelp 8μL SIPORT Amine (Ambion, Austin, TX, USA) for en total transfeksjon volum på 0,5 ml. Etter inkubering ved 37 ° C under 5% CO
2 i 5 timer, 1,5 ml av den normale vekstmedium ble tilsatt, og cellene ble inkubert i 48 timer.
MTT-assay for celle-levedyktighet
MTT-analyser ble utført som tidligere beskrevet [42].
in vitro
migrasjon /invasjon analyser
vandrende evne av cellene ble analysert i en monolag denudasjon assay som tidligere beskrevet [42]. Den konfluente celler ble såret ved å skrape med en 100-mL pipette tips, som ribbet en stripe av monolaget som var 300 mikrometer i diameter. Vi vasket kulturen to ganger med PBS og tilsatt 5% FBS som et medium. Etter 24 timer, vil celler migrert inn i ribbet området og ble fotografert. Områdene ble analysert ved hjelp av Wimasis WimScratch programvare, en ny generasjon web-basert image verktøy for celle migrasjon analyse. Edge deteksjonsteknikker kan lett gjenkjenne forkanten og gapet området. Brukere kan laste opp bildene og analysen vil starte automatisk.
Cellular invasjonen ble kvantifisert ved hjelp av en modifisert Matrigel Boyden kammeret analysen. Den BioCoat Matrigel invasjonen kammeret (BD Biosciences, Bedford, MA) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. -Celler (4 x 10
4) i serumfrie media ble sådd ut på Matrigel-belagte filtre. I de nedre kamre, ble 5% FBS tilsatt som et kjemotiltrekkende. Etter inkubering i 24 timer, ble membranen vasket en kort stund med PBS og fiksert med 4% paraformaldehyd. Den øvre side av membranen ble tørket forsiktig av med en bomullsdott. Membranen ble deretter farget ved hjelp av hematoxylin og fjernet.
