Abstract
De spesifikke mekanismer hvordan lungekreft celler som epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) aktiverende mutasjoner kan overleve behandling med EGFR-tyrosinkinasehemmere (TKI) før de etter hvert få behandling-resistens genetiske mutasjoner er uklart. Den fenotypiske mangfoldet av kreftceller forårsaket av genetiske eller epigenetiske endringer (intratumor heterogenitet) overfører behandlingssvikt, og kan fremme svulst evolusjon gjennom darwinistisk utvalg. Nylig fant vi DDX3X som proteinet som ble fortrinnsvis uttrykt i murine melanoma med kreft stamcelle (CSC) -lignende fenotyper av proteom analyse. I denne studien ble transfektert vi PC9, humane lungekreftceller husing EGFR exon19 sletting, med cDNA som koder for DDX3X og fant at DDX3X, en ATP-avhengig RNA helikase, induserte CSC-lignende fenotyper og den epiteliale-mesenkymale overgang (EMT) sammen med tap av følsomhet for EGFR-TKI. DDX3X uttrykk var assosiert med oppregulering av Sox2 og økning av kreftceller som utviser CSC-lignende fenotyper, som forankringsuavhengig spredning, sterkt uttrykk av CD44, og aldehyd dehydrogenase (ALDH). EMT med bytter fra E-cadherin til N-cadherin ble også tilrettelagt av DDX3X. Enten ligand-uavhengig eller ligand-induserte EGFR fosforylering ble hemmet i lungekreftceller som sterkt uttrykt DDX3X. Mangel på EGFR signal avhengighet resulterte i resistens mot EGFR-TKI. Videre fant vi en liten ikke-klebende undergruppe som sterkt uttrykt DDX3X ledsaget av de samme stamcellelignende egenskaper og EMT i foreldre PC9 celler. Den unike subpopulasjon manglet EGFR-signalisering og var meget motstandsdyktige mot EGFR-TKI. Som konklusjon, våre data indikerer at DDX3X kan spille en avgjørende rolle for å indusere fenotypiske mangfold, og at behandling rettet mot DDX3X kan overvinne primære motstand mot EGFR-TKI som skyldes intratumor heterogenitet
relasjon:. Nozaki K, Kagamu H, Shoji S, Igarashi N, Ohtsubo A, Okajima M, et al. (2014) DDX3X induserer Primær EGFR-TKI Resistance Basert på intratumor heterogenitet i lungekreft celler som EGFR-aktive mutasjoner. PLoS ONE 9 (10): e111019. doi: 10,1371 /journal.pone.0111019
Redaktør: Pier Giorgio Petronini, Universitetet i Parma, Italia
mottatt: 10 mars 2014; Godkjent: 26 september 2014; Publisert: 24 oktober 2014
Copyright: © 2014 Nozaki et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in-Aid for Scientific Research fra departementet for utdanning, vitenskap og kultur i Japan (# 20590915 # 23591141 # 24591157, # 26293196), og av forskningsmidler fra Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. de bevilgende myndighet hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Konkurrerer interesser:. Denne studien ble finansiert delvis av Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer
Innledning
behandlinger målretting signal avhengighet forårsaket av onkogene driver mutasjon har ført til enestående resultater i klinisk setting. Bruken av epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) tyrosin kinase hemmere (TKI) har styrket seg betydelig progresjonsfri overlevelse i lungekreftpasienter som bærer aktiverer EGFR mutasjoner; imidlertid, er det likevel vanskelig å oppnå en kur for lungecancer, spesielt hos pasienter med fremskreden fase sykdom [1], [2]. Den fenotypiske mangfoldet av kreftceller er basert på både genetiske og nongenetic faktorer og resultater i overlevelse av behandlingsresistente celler. Faktisk, reflekterer mest ervervet resistens valg av kreft celler som stokastiske motstandsgivende genetiske endringer. Men mekanismene gjennom hvilke kreftceller overleve til erverv av ytterligere mutasjoner er uklart. Sharma et al. viste at en liten undergruppe reversibelt narkotika tolerant celler eksisterte i alle undersøkte kreftceller og at narkotika tolerant celler opptrådt som mor celler, som gir opphav til resistente celler som flere mutasjoner [3].
DEAD /H (Asp-Glu-Ala-Asp /His) boks polypeptid 3, X-bundet (DDX3X) er et medlem av DEAD-boksen familie på ATP-avhengig RNA heli og ligger på X-kromosomet [4]. DEAD-box heli har flere funksjoner, blant annet RNA-spleising, mRNA eksport, transkripsjonen og translasjonell regulering, RNA forfall, ribosom biogenesis, og miRNA regulering [5], [6]. Således er DDX3X antas å være involvert i den epigenetisk regulering av genekspresjon. Vår forrige proteom analyser identifisert DDX3X som et protein fortrinnsvis uttrykt i renset CD133
+ B16 melanomceller, som besatt kreftstamcelle (CSC) -lignende eiendommer [7], [8]. Selv om DDX3X ble opprinnelig rapportert å undertrykke tumorvekst ved å modulere
p21
waf /cip1
genekspresjon [9], DDX3X har også vist seg å være direkte korrelert med onkogenese [10], [11]. Nylig, hel-exome sekvensering identifisert DDX3X som et mål av driver genmutasjoner som medierer patogene β-catenin signalisering i medulloblastoma, som støtter CSC teori [12] -. [16]
I denne studien har vi søkt å undersøke hvilken rolle DDX3X i overdragelse EGFR-TKI motstand i lungekreftceller. Våre data antydet at DDX3X kan representere en roman terapeutisk mål for å overvinne intratumor heterogenitet i lungekreftpasienter husing EGFR-aktive mutasjoner.
Materialer og metoder
Kreftceller
PC9 celler lunge adenokarsinom celler som en EGFR exon 19 slettingsmutasjon, ble levert fra Riken Bioresource senter og holdt i dyrkningsmedium (CM) inneholdende RPMI 1640 medium supplert med 10% varme-inaktivert lipopolysakkarid (LPS) -qualified føtalt kalveserum (FCS), 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 1 mM natriumpyruvat, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycinsulfat (alle fra Life Technologies, Inc., Tokyo, Japan). HCC4006 lunge adenokarcinomceller huser en EGFR ekson 19 mutasjon ble kjøpt fra American Type Culture Collection og dyrket i CM.
Transfeksjon av PC9 celler med
DDX3X
cDNA
Transfeksjon av lungekreftceller med
DDX3X
cDNA ble utført ved hjelp av en Myc-FLAG-merket åpen leseramme (ORF) klone av menneskelig DDX3X transkripsjon variant en som transfeksjon-klar DNA (Origene Technologies, Inc., Rockville, MD , USA) i henhold til produsentens protokoll. Eksperimentelle celler ble inkubert med friskt medium inneholdende G418 (600 ug /ml, Promega, Madison, WI, USA), og mediet ble erstattet med friskt G418-holdig medium hver 3-4 dager inntil resistente kolonier ble identifisert.
knockdown av DDX3X av shRNA
knockdown av DDX3X ble utført ved hjelp av en shRNA lentiviral (pLKO.1-puro) plasmid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) med følgende DDX3X target sekvens: 5′-CCGGACGTTCTAAGAGCAGTCGATTCTCGAGAATCGACTGCTCTTAGAACGTTTTTTG. PC9 celler ble sådd ut i friskt medium, og hexadimethrine bromid (8 ug /ml) ble tilsatt til hver brønn. Cellene ble kotransfektert med den pLKO.1-puro plasmid pluss emballasjen vektoren i henhold til produsentens protokoll. Mediet ble forandret omtrent 16 timer etter transfeksjon, og cellene ble dyrket i ytterligere 48-72 timer. Eksperimentelle celler ble inkubert med friskt medium som inneholdt puromycin (2,0 ug /ml), og mediet ble erstattet med friskt puromycin-holdige medium hver 3-4 dager inntil resistente kolonier ble identifisert. Et minimum på fem puromycin-resistente kolonier ble plukket, og hver klon ble ekspandert for analysen. Effektiviteten av DDX3X knockdown ble bestemt ved immunoblotting.
Monoklonale antistoffer (mAbs) og flowcytometri
PE-konjugert anti-CD44 (IM7), anti-E-cadherin (67A4), og anti-vimentin (GF2); fluorescein (FITC) konjugert anti-N-cadherin (8C11) ble kjøpt fra BD Pharmingen (San Diego, California, USA). Analyse av celleoverflate fenotyper ble gjennomført ved direkte immunfluorescens-fargingen av 0,5-1 x 10
6-celler med de ovenfor nevnte fluoroforen-konjugert mAb og deretter behandlet med 1% paraformaldehyd. I hver prøve, ble 1 × 10
4 celler analysert ved hjelp av en FACSCalibur flyt microfluorometer (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA). PE-konjugerte subklasse-matchet antistoffer som brukes som isotype kontroller ble også kjøpt fra BD Pharmingen. Prøvene ble analysert med Cellquest-programvare (BD).
Immunoblotting assay
Cellene ble høstet og lysert i Nonidet P-40 buffer inneholdende en protease-inhibitor blanding (Sigma). Like mengder protein ble utsatt for natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgel gelelektroforese (SDS-PAGE) på Mini-protean TGX Eventuelle kD Prefabrikkerte Gel (BioRad, Hercules, CA, USA) og deretter overført til polyvinylidendifluorid membraner (Millipore, Billerica, MA, USA). Immunoblot fra tumorcellelysatene ble probet med antistoffer mot DDX3X (Sigma), EGFR, fosfo-EGFR (Tyr1068), fosfo-EGFR (Tyr1173), fosfo-EGFR (Tyr845), Akt, fosfo-Akt, ERK1 /2, fosfo ERK1 /2, og β-aktin (Sigma). Alle antistoffer med unntak av anti-DDX3X og anti-β-actin ble innkjøpt fra Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA). Sekundære antistoffer som besto av anti-mus IgG (Bio-Rad) og anti-kanin-IgG konjugert til pepperrot-peroksidase (Abcam, Cambridge, MA, USA). Immunoreaktive proteinbånd ble visualisert ved hjelp av en ECL-kit (Pierce). Minst tre uavhengige eksperimenter ble utført for alle analyser.
Aldefluor analyser
ALDH aktivitet ble oppdaget ved hjelp av ALDEFLUOR kit (StemCell Technologies Inc., Vancouver, Canada) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt ble Aldefluor analyser utført ved å suspendere cellene i Aldefluor analysebuffer inneholdende 1,5 pM BODIPY-aminoacetaldehyd, en ALDH substrat. Cellene ble deretter inkubert i 30 minutter ved 37 ° C og analysert med en microfluorometer.
cellenes levedyktighet assays
totalt 5 x 10
4 tumorceller ble utsådd i 24-brønners plater på dag 0. Tjuefire timer etter såing, erlotinib eller kjøretøy ble lagt. Antall levende og døde celler ble telt med trypanblått flekker. % Overlevelse indikerer en prosentandel av levende celler, som utelukket trypanblått-farving, basert på den totale celle nummer i en brønn. Prøvene ble fremstilt i triplikat.
MTT-analyser
Tumorceller ble inokulert på 5 x 10
3-celler per brønn i flatbunnede 96-brønners kulturplater og dyrkes in CM. Etter en 24-timers inkubasjonsperiode for å tillate dem feste til kulturplater ble cellene behandlet med erlotinib i 48 timer. Kulturplatene ble sentrifugert i ikke-festede tumorceller, og mediet ble fjernet så mye som mulig og erstattet med 100 ul friskt medium. 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay for celle-levedyktighet ble utført ved tilsetning av 10 ul MTT-reagens per brønn i 2 timer ved 37 ° C, etterfulgt av tilsetning av 100 pl /brønn fargestoff oppløseliggjøre vaskemiddel reagens. Supernatanten ble aspirert og absorbans ble målt ved 570 nm. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
LSF /TCF Reporter Analyser
PC9 celler ble transient transfektert med lentivirus vektor TCF /LSF
Firefly
luciferase reporter konstruere og intern inkludert kontroll
Renilla
luciferase konstruere, eller ikke-induserbar
Firefly
luciferase reporter konstruere og intern kontroll
Renilla
luciferase konstruksjon (Cignal TCF /LSF reporter kit, Qiagen). -Celler ble transfektert med Lipofectamine 2000 og valgt i 2 dager i puromicin. Transfektert celle ble deretter sådd på nytt i 24 brønners plater ved 30,000 celler /brønn før behandling med rekombinant Wnt3a (100 ng /ml; R 0,05. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter
DDX3X mediert EGFR-TKI motstand
Siden stamceller utnytte stamcellespesifikk signalering.; Derfor kan CSC-lignende fenotyper være assosiert med aktivering av forskjellige andre enn EGFR-signalisering som resulterer i forandring av følsomheten til EGFR-TKI signalveier. Dermed neste vi undersøkte EGFR-TKI følsomhet av A-1 celler. Som vist på fig. 2A, en betydelig motstand mot 48-timers behandling med EGFR-TKI erlotinib ble observert i A-1-celler. Knockdown av DDX3X restaurert følsomhet for EGFR-TKI (Fig. 2B). Selv om det ble observert reduksjon i% levedyktige celler i A-1-celler når cellene ble behandlet med erlotinib ved en konsentrasjon som er større enn 20 nM, var det ikke klart om cellene var døende eller ikke. For å teste om A-1 celler ble oppviser redusert levedyktighet eller bare redusert spredning følgende 72-h erlotinib behandling, døde celler ble farget med propidiumjodid (PI) og analysert med en microfluorometer. Mens antallet døde celler økt i de paren PC9 celler, ble det ikke påvist økning i A-1-celler (Fig. 2C). Dette fenomenet ble bekreftet ved å telle antall celler i tre dager ved hjelp av trypanblått-utelukkelse-metoden (fig. 3A). Antallet av døde PC9 celler ble signifikant økt i nærvær av erlotinib ved konsentrasjoner høyere enn 20 nM. I motsetning til dette, A-1-celler stanset prolifererende når de utsettes for erlotinib ved konsentrasjoner større enn 20 nM, men døde A-1 celleantall var ikke forskjellige fra de i ubehandlede celler, selv etter tre dager med eksponering til 2000 nM erlotinib. Alle andre kloner som ble utviklet for å overuttrykker DDX3X utstilt samme motstand som erlotinib som A-1 celler (fig. 3B).
A. MTT analyse av foreldrenes PC9 celler og A-1 celler. Kreftceller ble behandlet med den angitte konsentrasjon av erlotinib i 48 timer. Prøvene ble fremstilt i triplikat. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. B. MTT analyse av foreldre PC9 celler, A-1 celler, og A-1 celler med knockdown av DDX3X. Kreftceller ble behandlet med den angitte konsentrasjon av erlotinib i 48 timer. Prøvene ble fremstilt i triplikat. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. C. Flowcytometri analyse av kreftceller behandlet med 20 nM erlotinib i 72 timer.
A. Totalt 5 × 10
4 tumorceller ble sådd i 24-brønners plater på dag 0. Tjuefire timer etter såing, erlotinib eller kjøretøy ble lagt på de angitte konsentrasjoner. Antall levende og døde celler ble telt med trypanblått flekker. % Overlevelse indikerer en prosentandel av levende celler, som utelukket trypanblått-farving, basert på den totale celle nummer i en brønn. Prøvene ble fremstilt i triplikat. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. * Blir brukt til å indikere betydning. B.% Overlevelse av kreftceller behandlet med 20 nM erlotinib ble demonstrert. A-1, 2, 3, 4 og 5 indikerer klone tallene som ble transfektert med cDNA som koder for DDX3X. Den% overlevelse viser prosentandelen av levende celler som ekskluderte trypan blåved, basert på total celle nummer i en brønn. Prøvene ble fremstilt i triplikat. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. **
p
. 0,001
DDX3X redusert EGFR signalering i kreftceller husing EGFR-aktive mutasjoner
overlevelse og spredning av PC9 celler er avhengig av EGFR signaliserer avhengighet fordi PC9 celler besitter driver mutasjoner i
EGFR
gen som øker tyrosin kinase aktivitet [18], [19]. Derfor analyserte vi enten EGFR signale var påvirket av DDX3X overekspresjon. I samsvar med tidligere rapporter, ble Tyr1068 av EGFR fosforylert i paren PC9 celler og mock-transfektanter, selv i fravær av EGF (figur 4A.); imidlertid nesten ingen EGFR fosforylering ble påvist i A-1-celler. I tillegg knockdown av DDX3X i A-1 celler restaurert EGFR fosforylering. For å bekrefte at dette fenomenet ikke var begrenset til PC9 cellelinje, transfektert vi HCC4006, en human lunge adenokarsinom huse en EGFR ekson 19 sletting, med cDNA som koder DDX3X (HCC4006 S1, HCC4006 S2). HCC4006 S1 og S2 også mistet EGFR fosforylering (Fig. S1B). EGFR besitter flere Tyr rester som gjennomgår fosforylering. For eksempel binder GRB2 adapteren aktivert protein EGFR ved fosforylert Tyr1068 [20], og fosforylert Tyr1173 gir et forankringsstedet for SHC scaffoldprotein, som er involvert i mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) signal aktivering [21]. I tillegg kan Tyr845 bli fosforylert av andre kinaser, herunder Src, og har vist seg å være fosforylert i mange gefitinib-resistente mutanter EGFR [22] – [24]. Derfor vi neste undersøkte fosforylering statene disse tre tyrosinrester (Tyr845, Tyr1068, og Tyr1173) i nærvær av EGF. Interessant, fant vi redusert fosforylering av alle undersøkte tyrosinrester i EGFR i A-1 celler (Fig. 4B).
A. Immunblotting-analyse av EGFR, fosfo-EGFR (Tyr1068), og DDX3X i kreftceller uten EGF tilskudd. B. Immunoblotting analyse av fosfor-EGFR på Tyr1068, Tyr1173, og Tyr845 i foreldre PC9 celler og A-1 celler. C. Kinetisk analyse av EGFR-signalisering i paren PC9 celler og A-1-celler. EGFR, fosfo-EGFR (Tyr1068), Akt, fosfo-Akt, ERK1 /2, og fosfo-ERK1 /2-nivåene ble analysert ved immunoblotting ved 0, 15, 30, 60, 120, og 900 minutter etter tilsetning av 100 ng /ml EGF.
i nærvær av 100 ng /ml EGF, EGFR fosforylering (Tyr1068) ble økt i foreldre PC9 celler (fig. 4C). I motsetning til dette ble ligand-induserte EGFR fosforylering og etterfølgende ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) fosforylering betydelig svekket i A-1-celler.
I tillegg til å være regulert ved fosforylering, EGFR kan generere signalisering gjennom fosforylering av annen human epidermal vekstfaktor-reseptor (HER) familie proteiner ved å danne heterodimerer. Krysstale av Met med EGFR-signalveien er også blitt vist å være involvert i EGFR-TKI motstand [25]. Derfor testet vi om HER2, HER3, HER4, og Met ble fosforylert. Det ble imidlertid ingen forskjeller i fosforylering statene HER2 eller Met funnet mellom foreldre PC9 celler og A-1 celler (Fig. S1C, D). I tillegg HER3 og HER4 ble ikke fosforylert i disse cellene (data ikke vist).
En liten undergruppe PC9 celler sterkt uttrykt DDX3X og utstilt CSC-lignende fenotyper
Samler bevis har vist at nesten alle kreftceller viser bemerkelsesverdig variasjon i fenotyper basert på genetisk og epigenetisk heterogenitet [26]. Hvis DDX3X spiller faktisk en rolle i å indusere en stamcellelignende tilstand og signal svitsjing, en mindre bestand av DDX3X-overekspresjon foreldre PC9 celler kan eksistere. Derfor, siden A-1 celler viste en tendens til å spre seg i et forankringsuavhengig, undersøkte vi en mindre undergruppe av ikke-festede PC9 celler. Overraskende nok tilfestede populasjonen av paren PC9 celler viste nesten den samme grad av DDX3X uttrykk som A-1-celler (Fig. 5A). Vi undersøkte uttrykk for ALDH, en antatt CSC markør (Fig. 5B). Selv om bare 0,47% av heft PC9 celler uttrykte ALDH, 23,0% av ikke-festede celler utstilt ALDH aktivitet. På den annen side, 15,8% av adherente A-1-celler og 23,8% av ikke-adherente A-1-celler ble ALDEFLUOR positive. Det er sannsynlig at ALDEFLUOR-positive celler finnes bare i cellepopulasjonen som sterkt uttrykker DDX3X. Videre er de fleste ikke-adherente celler, men ikke heftende celler viste sterk ekspresjon av CD44, en annen antatte CSC markør (fig. 5C).
A. Immunoblotting analyse av DDX3X uttrykk i tilhenger og ikke-festede foreldre PC9 celler og A-1 celler. B. ALDEFLUOR analyser ble utført ved å suspendere cellene i Aldefluor analysebuffer inneholdende 1,5 pM BODIPY-aminoacetaldehyd, en ALDH substrat. Cellene ble deretter inkubert i 45 minutter ved 37 ° C og analysert i henhold til produsentens instruksjoner. C. Flowcytometri analyse av heft og ikke-festede foreldre PC9 celler og A-1 celler. Histgrams indikere CD44 uttrykk. Stiplede linjer angir isotypekontroll, tynne linjer angir adherente celler, og de tykke linjer indikerer ikke-adherente celler. D. Flow-cytometri-analyse av ikke-fraksjonerte, adherente og ikke-adherente celler avledet fra paren PC9 celler og A-1-celler. X-aksen indikerer fluorescensintensitet av E-cadherin, og Y-aksen indikerer fluorescensintensitet av N-cadherin. E. Flow-cytometri-analyse av ikke-adherente celler isolert fra foreldre PC9 og A-1-celler. Histogram tomter vise vimentin uttrykk på gated N-cadherin + celler.
Det ble vist at under EMT, er E-cadherin downregulated mens nevrale cadherin (N-cadherin) er oppregulert, referert til som cadherin switch og at cadherin bryter fremmer kreftinvasjon og metastase via økende kreftcelle motilitet [27] – [30]. Derfor undersøkte vi om E /N cadherin switch ble indusert av DDX3X. Som vist på fig. 5D, 15,5% av ikke-fraksjonerte A-1-celler og 7,0% av ikke-fraksjonerte paren PC9 celler uttrykte N-cadherin, og dermed er det sannsynlig at N-cadherin ekspresjon ble fremmet ved DDX3X. Adherente celler ble E-cadherin enkelt positiv og N-cadherin
+ celler tilhørte tilfestede cellepopulasjon. Interessant, 43,1% av ikke-festede foreldre PC9 cellene uttrykte både E-cadherin og N-cadherin og 29,2% var E-cadherin
N-cadherin
+. Det virker som ufullstendig cadherin switch skjedde i foreldrenes PC9 celler. I motsetning til 42,3% av ikke-adherente A-1-celler ble N-cadherin enkelt positiv og 10,8% var E-cadherin
+ N-cadherin
+. 21,7% av gated N-cadherin
+ i foreldre PC9 celler, og 47,7% av gated N-cadherin
+ i A-1 celler uttrykte vimentin (Fig. 5E). Til sammen en unik undergruppe som var under EMT eksistert i ikke-festede celler av både A-1 og foreldre PC9 og at DDX3X tilrettelagt E /N cadherin switch fulgt av vimentin uttrykk.
tilfestede cellepopulasjon av foreldre PC9 manglet EGFR signalering og oppviste motstand mot EGFR-TKI
Som vist i fig. 6A, alle ikke-adherente celler manglet EGFR-fosforylering som A-1-celler. Videre er den ikke-tilfestede populasjonen av paren PC9 celler var resistente mot EGFR-TKI erlotinib, i likhet med vedheftende A-1-celler (Fig. 6B). Fordi ikke-festede celler kan inneholde døde celler, undersøkte vi de prosenter av døende celler med PI farging. Fig. 6C viser at 28,5% av heftforeldre PC9 celler ble døende etter 72-h erlotinib behandling. I motsetning til dette var andelen av døende celler var bare 14,1% i ikke-festede celler PC9. Deretter dyrkes vi paren PC9-celler i nærvær av økende konsentrasjoner av erlotinib (opp til 3000 nM) for å oppnå resistente celler. Etter tre måneders eksponering for erlotinib, etablerte vi R-PC9 celler, som var i stand til å overleve i CM inneholder 3000 nM erlotinib. Fig. 7A viser at R-PC9 celler var signifikant motstandsdyktig overfor erlotinib. R-PC9 celler utstilt sterke uttrykk for DDX3X (Fig. 7B). Samlet våre data viser at foreldre PC9 cellene inneholdt en mindre befolkning stille sterke uttrykk for DDX3X, CSC-lignende fenotyper, EMT, og primær motstand mot EGFR-TKI. Den mindre befolkning kan overleve lenge behandling med EGFR-TKI.
A. Immunblotting-analyse av EGFR og fosfo-EGFR (Tyr1068) i adherente og ikke-adherente kreftceller. B. MTT-analyser ble anvendt for å måle celleproliferasjon i adherente og ikke-adherente celler og PC9 A-1-celler etter behandling erlotinib. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Prøvene ble fremstilt i triplikat. **
P
0,001. C. Flow cytometri analyse med PI farging ble brukt til å undersøke døende celler.
A. MTT-analyser ble anvendt for å bestemme spredning av adherente og ikke-adherente PC9 celler, så vel som R-PC9 celler som ble oppnådd ved langvarig eksponering for økende konsentrasjoner av erlotinib. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Prøvene ble fremstilt i triplikat. * Indikerer signifikante forskjeller ved to-veis ANOVA og ad hoc-analyse. B. Immunoblotting analyse av DDX3X uttrykk i foreldre PC9 celler og R-PC9 celler.
β-catenin signale indusert av DDX3X
Selv om A-1 celler manglet EGFR fosforylering og påfølgende signal viste de nesten samme proliferasjonsrate som foreldre PC9 celler
in vitro
. Det er sannsynlig at EGFR-signalisering er erstattet av andre signalveier. Stamceller utnytte spesifikke signalveier som Wnt /β-catenin eller pinnsvin, i stedet for reseptor typen tyrosin kinase signal; dessuten en viss undergruppe av CSC vedlikehold er avhengig av Wnt /β-catenin signalering [31], [32]. DDX3X er nødvendig for Wnt /β-catenin signalering, og mutert DDX3X har vist seg å spille en rolle i sykdomsfremkallende β-catenin signalisering i medulloblastom [13], [33]. Derfor vi neste analysert Wnt /β-catenin signalering. TCF /LSF luciferase reporter analysen viste at β-catenin signal ble fremmet i A-1 celler i nærvær eller fravær av Wnt3a (Fig. S1E).
Diskusjoner
I denne studien har vi undersøkt hvilken rolle DDX3X i oppkjøpet av EGFR-TKI motstand i lungekreftceller. Våre resultater viser at kreftceller som bærer EGFR-aktive mutasjoner kunne slå av EGFR-signalering og mister EGFR signal avhengighet. Tyr rester i EGFR av lungekreftceller som overuttrykker DDX3X var ikke fosforylert, selv i nærvær av EGF. Dette var en uventet og overraskende funn fordi EGFR-aktiverende mutasjoner bevirke at EGFR kinase-domenet til å forbli i den aktive konformasjon, selv i fravær av ligander, noe som resulterer i fosforylering av tyrosin-rester på den C-terminale hale segmenter. Den nøyaktige mekanisme som DDX3X hemmer fosforylering av tyrosinrester i EGFR er uklart. Det er imidlertid lite sannsynlig å være involvert fordi ikke bare tyrosinrester kastet autofosforylering i C-terminal tail segmenter, men også Tyr845 i kinasedomenet, som også kan fosforyleres av Src hemning av tyrosin-kinase-aktivitet, var ikke fosforylert. Observasjonen at DDX3X mediert Wnt /β-catenin signal er konsistent med en fersk rapport som beskriver Wnt-avhengige stimulering av kasein kinase 1 og promotering av bustete fosforylering av DDX3X i pattedyrceller [33]. Videre analyser hel-exome identifisert DDX3X som en komponent av patogene β-catenin signalering, i Wnt undergruppe medulloblastom [12] – [14]. Til sammen våre nåværende data og disse tidligere studier indikerer at DDX3X er en kritisk komponent i Wnt /β-catenin signalveien, og at signal veksling fra EGFR avhengighet til p-catenin signal kan være forårsaket av DDX3X i lungekreft celler husing EGFR aktive mutasjoner.
DDX3X er en RNA helicase som er høyt konservert fra gjær til mennesker og modulere strukturen av RNA [34]. Således er RNA helikaser antas å delta i RNA-transkripsjon, spleising, og oversettelse. Humant DDX3 har to nært beslektede gener, DDX3X og DDX3Y, som er kodet i X- og Y-kromosomer, respektivt. DDX3Y er unikt uttrykt i kjønnsceller, og er essensiell for spermatogenese [35]. Interessant, fant vi at DDX3X indusert økning av kreftceller ledsaget av stamceller-lignende fenotyper som oppregulert uttrykk for Sox2, ALDH, og CD44. Videre forankring uavhengig spredning, cadherin bytter fra E-cadherin til N-cadherin, vimentin uttrykk, ble observert i disse cellene. I samsvar med våre funn har tumorer som bærer oppregulert DDX3X blitt rapportert å oppvise stilk-lignende egenskaper og /eller tegn på EMT i melanom, brystkreft, leukemi og [8], [10], [12], [36]. Spesielt, medulloblastom, hvori DDX3X har vist seg å virke som en driver gen, er lik i utseende og differensiering potensial til nevrale stamceller og forløperceller. Men det er unikt funn som ubehandlet lunge adenokarcinomceller inneholdt en undergruppe sterkt uttrykker DDX3X og ledsaget av signal svitsjing, CSC-lignende fenotyper, og bevis på EMT.
I sammendraget, denne studien ga den første demonstrasjonen som DDX3X indusert tap av EGFR signal avhengighet resulterer i motstand mot EGFR-TKI, ledsaget av CSC-lignende egenskaper og forekomst av EMT i lungekreft celler som EGFR aktiverende mutasjon.
