Abstract
Til tross for sine bivirkninger, docetaxel (DTX) forblir en første-linje behandling mot kastrering resistent prostatakreft (CRPC). Derfor, strategier for å øke sin anti-tumor effekt og redusere dens bivirkninger er kritisk nødvendig. Målretting av det konstituerende endoplasmatiske retikulum (ER) stress i kreftceller blir etterforsket som et chemosensitization tilnærming. Vi antok at det samtidig induksjon av ER-stress og undertrykkelse av PI3K /AKT overlevelse veien vil være en mer effektiv tilnærming. I en CRPC cellelinje, C4-2B, observerte vi signifikant (p 0,005) forbedring av DTX-indusert cytotoksisitet følgende coexposure til thapsigargin og en AKT-inhibitor. Imidlertid, siden disse to midlene ikke er klinisk godkjent, undersøkte vi hvorvidt en kombinasjon av nelfinavir (IFV) og curcumin (CUR), kjent for å målrette mot begge disse metabolske reaksjonsveier, kan likeledes øke DTX cytotoksisitet i CRPC celler. Innen 24 timer etter eksponering til fysiologiske konsentrasjoner av NFR (5 mm) og CUR (5 mm) en signifikant (p 0,005) forbedret cytotoksisitet var tydelig med lav konsentrasjon av DTX (10 nM). Dette 3-legemiddelkombinasjon raskt økt apoptose i aggressive C4-2B celler, men ikke i RWPE-1-celler eller i primær prostata epitelceller (prec). Sammenlignende molekylære studier viste at dette 3-legemiddelkombinasjon forårsaket en mer markert suppresjon av fosforylert-AKT og høyere induksjon i fosforylert-eIF2α i C4-2B celler, sammenlignet med RWPE-1-celler. Akutt eksponering (3-9 timer) på denne 3-legemiddelkombinasjonen intensiveres ER-stress indusert pro-apoptotiske markører, dvs. ATF4, CHOP, og TRIB3. At mye lavere konsentrasjoner, kroniske (3 wks) eksponering mot disse tre agentene drastisk redusert kolonidannende enheter (CFU) av C4-2B celler.
In vivo-studier som anvender
mus inneholdende C4-2B tumorxenografter viste signifikant (p 0,05) forbedring av DTX s (10 mg /kg) anti-tumor-virkning etter coexposure til IFV (20 mg /kg) og amp; CUR (100 mg /kg). Immunhistokjemisk (IHC) analyser av tumorsnitt indikert redusert Ki-67 flekker og økt TUNEL intensitet hos mus eksponert for 3-legemiddelkombinasjonen. Derfor undergraving ER-stresset mot apoptose ved hjelp av adjuvant behandling med NFR og CUR kan chemosensitize de CRPC cellene til DTX terapi
Citation. Mathur A, Abd Elmageed ZY, Liu X, Kostochka ML, Zhang H, Abdel- Mageed AB, et al. (2014) undergraving ER-stress mot apoptose av Nelfinavir og Curcumin Coexposure forsterker Docetaxel Effekt hos kastrering resistent prostatakreft celler. PLoS ONE 9 (8): e103109. doi: 10,1371 /journal.pone.0103109
Redaktør: Allen Gao, UC Davis Comprehensive Cancer Center, USA
mottatt: 27 januar 2014; Godkjent: 12 juni 2014; Publisert: 14. august 2014
Copyright: © 2014 Mathur et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse studiene ble støttet med tilskudd fra det amerikanske forsvarsdepartementet, til DM (# PC080811) og til A.B.A. (# PC081598), og midler fra Louisiana Cancer Research Consortium (LCRC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den nest største årsaken til kreft dødsfall hos menn i USA. Initial behandling av lokaliserte svulster består av kirurgi og strålebehandling, etterfulgt av androgen deprivasjon terapi (ADT). Imidlertid er ADT bare effektivt for et gjennomsnitt på 18-24 måneder og gjentakelse av kastrering motstandsdyktig prostatakreft (CRPC) dikterer sykelighet og dødelighet hos pasienter [1]. Selv om de nyere og mer potent androgen reseptor (AR) antagonister, f.eks MDV-3100 (enzalutamide), har vist noen lover, er allerede møtt motstand i klinikken [2]. Derfor kjemoterapi med taxaner er fortsatt det stoffet for pasienter med aggressiv og metastaserende CRPCs. Men en trygg og effektiv strategi for å forsterke effekten av taxaner representerer et udekket klinisk behov.
Docetaxel (DTX), en anti-microtubule agent, ble godkjent av US FDA som bærebjelke behandling mot CRPC [3 ]. Selv om utgangspunktet effektive, har DTX-basert regime bare vist en median overlevelse på 18-20 måneder og svarprosent på bare 50%. I tillegg viser DTX betydelige bivirkninger hos pasienter med komorbide tilstander, som mandat å redusere dosen som øker muligheten for utvalg for resistente kloner. Nyere studier har vist at resistensutvikling etter langvarig behandling med DTX kan oppstå på grunn av oppregulering av PI3K /AKT signalisering i celler CRPC [4], [5]. Derfor nedregulering av PI3K /AKT signalisering i CRPC cellene skal forsterke effekten av denne kjemoterapeutisk middel [6].
aggressiv kreft celler er også i stand til å rømme kjemoterapi ved å modulere mester regulatoriske mekanismer, som dikterer deres overlevelse eller død avgjørelse staking evner. I dette henseende, har kontroll av proteintranslasjon via utsøkt regulerte ER-spenning kaskade blitt vist å fremme tumorcelleoverlevelse og flukt fra apoptose [7]. En direkte forbindelse mellom aggressiv fenotype tumor og økt ekspresjon av den ER-spenning markør, BiP /grp78, er blitt dokumentert [8] – [10]. Faktisk har flere nyere rapporter slått fast at ER-stress kan legge til rette for vedvarende tumorvekst og deres terapeutiske motstand. Derfor har forskere antydet at målretting av ER-spenning kan være en potent strategi kjemosensibiliserende [11] – [13]. Wu et al, (2009) viste at det ER-stress-indus methylseleninic syre (MSA) sensitizes PC-3 celler til den cytotoksiske effekten av paclitaxel og DTX [11]. Naturlige forbindelser som epigallocatechin gallate, en polyfenolforbindelsen i grønn te kan forbedre kjemoterapi effekt i glioblastom celler ved å øke ER-stress [14]. Imidlertid har effekten av samtidig nedregulering av PI3K /AKT overlevelse sti og oppregulering av ER-stress indusert apoptose som en potent chemosensitization tilnærming ikke testet.
Studier gi klare bevis for kryss-forhandlingene mellom flere signaloverføringsveier som regulerer celle skjebne beslutninger følgende ER-stress induksjon i kreftceller [7], [15] (se fig. 1A for en detaljert beskrivelse). En mild grad av ER-stress aktiverer en overlevelse respons kalt utbrettet Protein Response (UPR). Men undergraver alvorlig ER-stress dette UPR mot en pro-apoptotiske sti, som er diktert av uttrykket av ER-stress indusert transkripsjonsfaktorer ATF4 og CHOP, og ER-stress indusert død sensor TRIB3. Interessant under mild ER-stress, lavt TRIB3 nivåer fungere som en negativ regulator av ATF4 og CHOP som favoriserer celle overlevelse. Men under kraftig ER-stress, høye nivåer av ATF4 og CHOP øke TRIB3 uttrykk og en parallell undertrykkelse av AKT, som begunstiger apoptose [16] – [18]. Derfor synes TRIB3 å fungere som en master molekylær bryter «for å overleve
vs.
Død signalering i kreftceller gjennomgår ER-stress (Fig. 1B). Således, farmakologiske midler som induserer høye nivåer TRIB3 bør sensitivisere cancerceller til kjemoterapi.
(A). Under normale homeostatiske forhold, er det ATF6, IRE1 og Perk proteiner bundet til BIP /grp78 på ER membranen. En utfoldet protein respons (UPR) utgivelser disse ER-stress transdusere fra BIP. Utgitt ATF6 translocates til kjernen til å forsterke XBP-en genuttrykk. Parallell aktivering av IRE1 muliggjør skjøting av XBP-1 mRNA, som koder for en transkripsjonsfaktor som stimulerer flere spennings induserbare gener. Utgitt PERK aktiverer eIF2α, som deretter hindrer oversettelse av cap-avhengige proteiner for å ytterligere beskytte celler fra UPR progresjon. Dermed kryss-forhandlingene mellom disse ER-stress transdusere handle via parallelle veier for å lette celleoverlevelse og gjenopprette celle homeostase etter en mild og forbigående ER-stress. Men under langvarig eller alvorlig ER-stress, hetten uavhengig oversettelse av ATF4 fortsetter. Nuclear ATF4 nivåer deregulere cellulær homeostase ved å styrke uttrykk for ER-stress døds sensorer, hogge og TRIB3. (B). TRIB3 fungerer som «molekylær bryter» som tilsier celle overlevelse eller celle død beslutninger følgende ER-stress. Lave nivåer av TRIB3 funksjoner via en negativ feedback-loop for å undertrykke ATF4 og hogge uttrykk, og dermed gjør celleoverlevelse (venstre panel). Men høye nivåer av TRIB3 nedregulerer den AKT overlevelse vei, men ikke undertrykke ATF4 og CHOP som fortsetter å produsere ukontrollerte nivåer av TRIB3. Denne ubalansen subverts UPR og ER-stress svar fra en survival mode mot apoptose (høyre panel).
Thapsigargin (Tg), en velkjent ER-stress-indus kan bevisstgjøre PC-3 celler til både paclitaxel og DTX [11]. I tillegg kan AKT-inhibitor (Akti-IV) sensibiliserer både HeLa og SKOV3-cellelinjer til cisplatin og etoposid [19]. Imidlertid kan disse eksperimentelle forbindelser ikke brukes hos pasienter fordi de viser betydelige
in vivo
toksisitet [11], [19]. Videre er klinisk godkjennelse av nye midler som sikkerhets- mål AKT og ER-spenning ville være en kostbar og tidkrevende prosess. I denne forbindelse blir medikament reposisjonering ferd med å bli en meget tilfredsstillende anti-kreft og kjemosensibiliserende strategi [20]. Vi undersøkte om to godkjente farmakologiske midler, dvs. nelfinavir og curcumin, kjent for å målrette ER-stress og AKT trasé, kan øke DTX anti-tumor effekt mot CRPC celler.
Nelfinavir (NFR) er en av de første HIV-1-protease-inhibitorer (HPI) for å være klinisk godkjent [21], [22], og blir nå reposisjoneres som et anti-cancermiddel, samt (ClinicalTrials.gov). Tallrike studier har vist at IFV kan både chemosensitize og radiosensibilisere en rekke forskjellige tumorceller [23] – [28]. Dens sensibiliserende virkning har vært knyttet til induksjon av ER-spenning og hemming av AKT-reaksjonsveien [28]. Faktisk, ritonavir, en annen HPI med lignende virkningsmekanisme, ble også vist å øke anticancer virkningene av DTX i en meget aggressiv PCa-cellelinje, DU-145 [29]. Imidlertid er de sensibiliserende virkningene av IFV bare oppviste ved konsentrasjoner på ≥10 uM, noe som er høyere enn dets trygge og fysiologisk oppnåelige nivåer, dvs. 4,5-6 uM [30], [31]. Følgelig kan kombinasjonen av IFV med en annen sikker forbindelse som tilsvarende er rettet mot ER-stress og AKT trasé være mer effektive.
Curcumin (CUR) er den aktive komponenten i
Curcuma longa
, en East -Indian anlegget. Dette phytochemical har kjent anti-inflammatorisk og anti-kreft egenskaper og en rekke laboratorier undersøker det nytte som et tillegg til kjemoterapi [32]. Faktisk CUR har blitt vist å inhibere den PI3K /AKT reaksjonsvei og induserer lave nivåer av ER-spenning spesifikt på kreftceller [33], [34]. I lungecancerceller, CUR viste synergistiske anti-tumoreffekter i kombinasjon med DTX [35]. Nylig, CUR ble også vist å utløse celledød i tykktarm kreft celler via ER-stress indusert autofagi [36]. Imidlertid, i likhet med IFV,
in vitro kjemosensibiliserende
virkninger av CUR var tydelig bare ved høye konsentrasjoner (≥10 uM), som er vanskelig å oppnå
in vivo product: [37], [38 ]. Derfor hypotese vi at CUR og NFR kombinasjonen bør potent øke deres individuelle kjemosensibiliserende evner.
Undersøkelser ved hjelp C4-2B celler (en CRPC cellelinje) viste signifikant økt anti-tumor effekt av DTX følgende coexposure til NFR og CUR . Mekanistisk, dette 3-stoff kombinasjonen synergized å undertrykke AKT og indusere ATF4, CHOP og TRIB3 nivåer. Begge våre
in vitro Hotell og
in vivo
funn klart implisere potensialet for adjuvant behandling med fysiologisk oppnåelige konsentrasjoner av NFR og CUR å forsterke effekten av DTX i CRPC pasienter.
Materialer og metoder
Cell kultur
C4-2B celler, en beinmetastatisk CRPC underlinjen stammer fra LNCaP, var en slags gave fra Dr. Leland Chung laboratorium (Emory University) [39] . Disse cellene ble dyrket i RPMI-1640 medium (Cellgro, Manassas, VA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) fra Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA) og 1% penicillin /streptomycin antibiotisk oppløsning (Cellgro). Den RWPE-1-celler, en ikke-tumorigen human prostatisk epitelcellelinje udødeliggjort med humant papillomavirus (HPV-18), ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC; # CRL-11609). Disse cellene ble dyrket i keratinocytt serumfritt medium (K-SFM) supplementert med epidermal vekstfaktor (EGF), og bovint hypofyse-ekstrakt, alt oppnådd fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Primære menneskelige prostata epitelceller (PREC) ble oppnådd fra ATCC (# PCS-440-010) og ble dyrket i prostata epitelceller basal medium og kosttilskudd (ATCC, # PCS-440-030 og # PCS-440-040). Benmargen stamceller (BM-MSC) ble innhentet fra stamcellekjernefasiliteten ved Tulane University (New Orleans, Louisiana) og ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 20% FBS og antibiotika. Alle celler ble opprettholdt ved 37 ° C, i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO
2.
Reagenser
Nelfinavir mesylat (IFV) pulver ble ekstrahert og renset fra 250 mg tabletter ( Agouron legemidler, San Diego, CA). Curcumin (CUR) ble hentet fra Acros Organics (Fair Lawn, NJ). Docetaxel (DTX) og Thapsigargin (Tg) ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO) og AKT-inhibitor (Akti-IV; Katalognr 124005.) Ble oppnådd fra Calbiochem (Billerica, Massachusetts). For
in vitro
studier, ble alle legemidler oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO). Primære antistoffer mot total-AKT og fosfo-AKT, total eIF2α og fosfor-eIF2α, og mot menneskelig BIP /grp78, PARP og CHOP, ble alle kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Antistoffer mot humant TRIB3 og ATF4 var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California), antistoff mot humant β-Actin var fra Fisher Scientific (Waltham, MA) og mot Ki-67 var fra Spring biovitenskap (Pleasanton, CA). Alle sekundære antistoffer, slik som geit anti-mus, geit anti-kanin og bovin anti-geit, ble alle kjøpt fra Santa-Cruz Biotechnology.
Celleviabilitet analysen
MTT [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid] assay ble anvendt for å bestemme cellenes levedyktighet etter eksponering for testforbindelsene [40]. I korte trekk ble celler sådd ut i 96-brønners plater og tillatt å holde seg over natten. Ønskede konsentrasjoner av forbindelser, alene eller i forskjellige kombinasjoner, ble tilsatt til cellene i 3 replikate brønner. Etter 24-72 timers inkubering, ble MTT (Sigma) tilsatt til hver brønn og inkubert i 3 timer og formazankrystaller ble påvist ved lilla farge. Prosent overlevelse ble beregnet ved å måle absorbansen ved 540 nm ved anvendelse av en plateleser μQuant fra Bio-Tek (Seattle, WA).
DNA fragmenteringsanalyse
DNA-fragmentering assay ble utført i henhold til tidligere publiserte studier [41]. I korthet ble celler i 10 cm vev-kulturskåler ble behandlet med de ønskede konsentrasjoner av DTX, IFV og CUR, alene og i kombinasjon. Cellene ble høstet etter 24 timer i en cellelyseringsbuffer {0,2% Triton-X-100, 10 mM Tris-Cl (pH 7,4) og 10 mM EDTA (pH 8,0)}, etterfulgt av behandling med 100 ug /ml RNase A (Sigma ) og 0,5 mg /ml proteinase-K (Sigma). Med lav molekylvekt-DNA ble ekstrahert ved tilsetning av like volumer av fenol, kloroform og isoamyl-alkohol (25:24:1) og i tillegg av kloroform og isoamylalkohol (24:1). Ekstrahert DNA ble utfelt med etanol (300 mM NaCl og 100% iskald etanol), gjenoppløst i 1 x TE (Tris /EDTA) buffer og elektroforert på en 2% agarosegel inneholdende etidiumbromid (0,1 ug /ml). DNA-fragmentering ble visualisert under UV-lys ved hjelp av Antall Én programvare (Bio-Rad, Hercules, CA).
Caspase-3-analysen
EnzChek Caspase-3-analysen Kit (molekylære prober; Eugene, OR) detekterer apoptose ved å måle proteolytisk spaltning av et amino-metylkumarin (AMC) avledet fluorescerende substrat, Z-DEVD-AMC. I korthet ble celler i 10 cm petriskåler ble behandlet med DTX, IFV og CUR, alene og i kombinasjon. Celler ble høstet ved 24 timer, lysert, og Caspase-3-assay ble utført i henhold til produsentens protokoller. Mener fluorescensstyrkene ble målt ved hjelp av en Flx800 mikroplateleser (BioTek) med eksitasjon og emisjonsbølgelengder satt til 360 ± 20 nm og 460 ± 20 nm, henholdsvis.
Western immundeteksjon
Hele cellelysater ble høstet på ulike tidspunkter (30 minutter til 9 timer) etter eksponering for DTX, NFR og CUR behandlinger ved hjelp 1X cellelyse buffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Proteiner ble kvantifisert ved hjelp av BCA protein assay reagens (Thermo Scientific, Rockford, IL). Omtrent 30 ug protein ble fraksjonert på 10% SDS-PAGE-geler fra Bio-Rad (Hercules, CA) og overført til en PVDF-membran. Ikke-spesifikk binding ble blokkert ved å inkubere membraner med en blok-CH kjemiluminescens blocker (Millipore) og hybridisert med ønskede primære antistoffer (1:1,000 fortynning) over natten ved + 4 ° C og deretter med HRP-merket sekundære antistoffer (1:5,000 fortynning) i 1 time ved romtemperatur. Band ble oppdaget ved hjelp av forbedret chemiluminescence (ECL) og SuperSignal West Pico substrat (Thermo Scientific). Band intensiteter ble kvantifisert ved hjelp av Image-J-programvaren (NIH) og densitometrisk verdi for hvert protein ble normalisert til de tilsvarende p-aktin nivåer i hver prøve.
Colony Forming Units analysen
C4 2B celler ble sådd i 6 cm retter med 200 celler /fatet. Drugs, alene eller i kombinasjon, ble tilsatt etter 48 timer og behandlingene ble utført i 3 replikate brønner. Både NFR og CUR var opp to ganger i uken og DTX var opp igjen en gang i uken sammen med fersk vekstmedier. Etter tre uker ble kolonier fast med 100% etanol og farget med metylenblått, og kolonidannende enheter (CFU) ble nummerert ved hjelp av Antall Én programvare (Bio-Rad).
Tumor xenograft studier
Alle forsøksprotokoller som involverer forsøksdyr ble utført i samsvar med NIH retningslinjer og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Tulane University (IACUC; Protocol # 4295).
in vivo
antitumor effekt av DTX, alene eller i kombinasjon med NFR og CUR, ble bestemt i tumorxenotransplantater i atymiske nakne mus (NCI, Frederick, MD). For hver mus (4 uker gamle), C4-2B-celler (2 x 10
6) ble resuspendert i 100 ul serumfritt medium og ble injisert subkutant (sc) sammen med 100 ul Matrigel (BD Biosciences, San Jose, California). Når tumorer nådde et volum på 50-75 mm
3 (ca. 2 uker etter injeksjonen) ble dyrene randomisert til behandling med enten bærer, DTX (10 mg /kg), eller med DTX (10 mg /kg) + IFV (20 mg /kg) + CUR (100 mg /kg) ved intraperitoneal (ip) injeksjon. Før hver injeksjon ble narkotika nyoppløst i deres respektive bærere [23], [43], [44]. DTX ble gitt en gang i uken, og NFR og CUR ble administrert 5 dager /uke. Tumor størrelser ble målt to ganger i uken ved hjelp av en verniercaliper og svulstvolum ble beregnet ved hjelp av formelen, 0,5 × lengde × bredde
2 [45]. Vekten av hver mus ble målt og forhold av tumorvolum til totalvekten ble beregnet ved hvert tidspunkt. Svulster ble skåret ut ved slutten av behandlingsperioden (4 uker), parafin-innleiret og seksjonert for immunhistokjemisk (IHC) farging.
Immunhistokjemi
Tumorene ble fiksert i 10% nøytral buffret formalin for 24 timer etterfulgt av 70% etanol og ble deretter innstøpt i parafin. Seksjoner (~ 5 mikrometer) ble kuttet og farget med hematoxylin og eosin (H E). IHC for Ki-67 uttrykk ble utført for å bestemme antall prolifererende celler. I korthet snitt ble deparaffinized, hydrert, og antigen gjenvinnes ved anvendelse av 10 mM citratbuffer (pH 6,0). Snittene ble først blokkert med 3% H
2o
2 og deretter med 1,5% blokkerende serum (Vectastain ABC kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Seksjonene ble deretter inkubert med anti-Ki-67-antistoff i 30 minutter ved romtemperatur. Etter to vaskinger i PBS ble snittene inkubert med biotinylert sekundært antistoff og deretter med enzymet reagens (Vectastain ABC kit, Vector Laboratories). Seksjonene ble farget med diaminobenzidine (DAB) og kontra hjelp Hematoxylin atom flekk (Vector laboratorier; # H-3401). Permanent montering media ble tilsatt og Ki-67 farging ble visualisert og tatt til fange ved hjelp av en Eclipse E-400 mikroskop (Nikon Instruments, Melville, New York). I hvert lysbilde, ble 5 forskjellige felt visualisert for Ki-67 fargede celler og kvantifisert ved hjelp av Image-J programvare
TUNEL analysen
Dette deadend Colorimetric TUNEL analysen kit (Promega;. Madison, WI) ble anvendt for å bestemme apoptotiske celler i tumorsnitt, i henhold til produsentens protokoller. Denne analysen måler biotinylert nukleotid-inkorporering i DNA, som deretter visualisert ved HRP-merket streptavidin og DAB. Farging ble visualisert ved Eclipse E-400 mikroskop og bildene ble tatt mellom 4 ulike felt i hver svulst seksjon.
Synergy besluttsomhet
CalcuSyn programvare (Biosoft, Cambridge, UK) ble brukt til å beregne kombinasjonen indeksen (CI) basert på Chou-Talalay metoden [46]. Denne metoden er basert på median-effekt ligning som innbefatter Michaelis-Menton, Hill og Henderson-Hasselbalch-ligninger og gir et kvantitativt mål for additiv (CI = 1), synergistisk (CI 1) eller antagonistisk (CI 1) effekter.
Statistisk analyse
Statistiske analyser ble utført med GraphPad Prism versjon-4.00-programvare (San Diego, California, USA). Resultatene er uttrykt som standardavvik av middel (± SEM). Vesentlige endringer fra kontroller ble bestemt av en to-tailed t-test og p-verdier på 0,05 ble vurdert som signifikante
Resultater
Kombinert eksponering for Thapsigargin og AKT-inhibitor sensitizes C4. -2b celler til DTX-indusert cytotoksisitet
for å ta vår sentrale hypotese at samtidig målretting av ER-stress og AKT trasé vil medføre chemosensitization av CRPC celler, må vi først undersøkt om Tg og Akti-IV coexposure kan sensitiv C4 -2b celler til DTX-indusert cytotoksisitet (fig. 2A). Effekten av økende medikamentkonsentrasjoner og tiden for eksponering ble først registrert ved MTT-analyser. På 72 timer post eksponering, IC
50 verdier for DTX, Tg og Akti-IV var 35,8 nM, 80,8 nM og 5,5 mikrometer, henholdsvis (Tabell S1 i File S1). Mulige synergieffekter av legemiddelkombinasjonen ble så undersøkt ved hjelp av konsentrasjoner lavere enn sine respektive IC
50 verdier. Coexposure studier viste tydelig at kombinasjonen av DTX (10 nM), Tg (25 nM) og Akti-IV (2,5 uM) resulterte i en signifikant (p 0,0005) reduksjon i C4-2B celleoverlevelse, sammenlignet med DTX alene ( fig. 2B). Fremtidige studier ble utført for å undersøke om coexposure til to sikre og godkjente midler, dvs. NFR og CUR, kan likeledes øke DTX sensibilisering av C4-2B celler.
(A). Samtidig induksjon av ER-stress ved Thapsigargin (Tg) og undertrykkelse av AKT av en Akt-inhibitor (Akt-I), kan gjøre kreftceller som er mottakelige for de cytotoksiske handlingene til kjemoterapi. (B). Cytotoksiske effektene av DTX, alene eller i kombinasjon med Tg og /eller Akt-I, på C4-2B cellenes levedyktighet. Coexposure til Tg (25 nM) og Akt-I (2,5 uM) forbedret DTX (10 nM) indusert cytotoksisitet ved 72 timer etter behandling (n = 3). Feilfelt representerer ± SEM verdier og vesentlige forskjeller er vist som P-verdier (***, p 0,0005).
Coexposure til fysiologisk-oppnåelige konsentrasjoner av NFR CUR sensitizes C4-2B celler til DTX-indusert cytotoksisitet
IC
50 verdier for DTX, NFR eller CUR ble beregnet etter eksponering for enkelte legemidler for 24, 48 og 72 timer (tabell S1 i File S1 ). En konsentrasjon og tidsavhengig undertrykkelse i celleoverlevelse (MTT-assay) ble observert. I senere studier ble sub-IC
50 konsentrasjoner av stoffene som brukes i 2- eller 3- legemiddelkombinasjoner og celle-overlevelse ble overvåket i forskjellige celletyper (A) C4-2B, (B) RWPE-en, ( C) BM-MSC og (D) Prec (fig. 3). Selv etter 24 timer IC
50 for DTX, IFV og CUR alene viste seg å være 590,5 nM, 30,3 uM og 59 uM, henholdsvis, en signifikant økning (p 0,0005) ble observert i C4-2B cytotoksisitet når DTX var anvendes i kombinasjon med IFV og CUR. Interessant, den raske cytotoksisiteten observert i C4-2B celler var ikke tydelig i den ikke-tumorigene RWPE-1-celler, eller i de primære celler, dvs. BM-MSC og PrECs. Kombinasjonen indeks (CI) analyse viste en verdi på 0,045 i C4-2B celler, noe som antyder en sterk synergistisk effekt av 3-medikamentkombinasjon. Imidlertid ble CI verdier for RWPE-1 celler og BM-MSC funnet å være mye høyere, dvs. henholdsvis 0,527 og 0,639,. Videre er CI-verdien i Prec celler var 2,074, noe som tyder på en antagonistisk effekt. Lignende studier i en annen aggressiv PCa cellelinje, PC-3, også indikert signifikant (p 0,0005) økning i DTX sensibilisering følgende coexposure både NFR og CUR (tabell S1 i File S1 og Fig S1A i File S1.). Interessant imidlertid, i motsetning til i C4-2B celler, legemiddel synergisme i PC-3-celler ble bare observert ved 72 timer etter behandling. Samlet utgjør disse resultatene klart indikerte at coexposure til NFR og CUR kan raskt og synergi øke DTX-indusert cytotoksisitet i CRPC linjen C4-2B, men ikke i den ikke-tumorigent linje, RWPE-en. Derfor ble det molekylære mekanistiske undersøkelser utført for å avgrense differensial handlinger av denne 3-legemiddelkombinasjonen i begge cellelinjer.
Cytotoksiske effekter av DTX (10 nM), alene og i kombinasjon med IFV (5 uM) og /eller CUR (5 uM), er vist i de følgende fire celletyper (A) C4-2B, (B) RWPE-1, (C) Prec og (D) BM-MSC. Celleviabilitet analyser ble utført ved 24 timer etter eksponering, og prosent endring i celleoverlevelse, sammenlignet med ubehandlede celler (kontroll), ble bestemt. De MTT-analyser ble utført i 3 replikate brønner og alle forsøk ble gjentatt minst tre uavhengige ganger (n = 3). Feilfelt representerer ± SEM og vesentlige forskjeller mellom DTX-bare og DTX + NFR + CUR gruppe er vist som P-verdier (***, p 0,0005, **, p 0,005)
Differential effektene av NFR CUR kombinasjonen på DTX-indusert apoptose i C4-2B og RWPE-1 celler
Vi overvåkes om differensial cytotoksisitet i C4-2B
vs.
RWPE1 celler etter behandling med 3-legemiddelkombinasjonen skyldes forskjeller apoptose (fig. 4). Cellulær apoptose ble evaluert ved flere teknikker så som DNA-fragmentering (fig 4A 4F). DNA-fragmentering analyse viste at de enkelte legemidlene ikke induserer apoptose; imidlertid en økning i ladde mønsteret var tydelig når DTX ble kombinert med enten NFR eller CUR og apoptose ble ytterligere forbedret med 3-legemiddelkombinasjonen. Selv om tilsvarende DNA fragmenteringsmønstre var tydelig i RWPE-1-celler, AMC analysen klart demonstrert en signifikant høyere Caspase-3-aktivitet i C4-2B celler sammenlignet med RWPE-1-celler. Hverken IFV eller CUR alene ble funnet å øke produksjonen AMC; Derimot økte deres kombinerte eksponering Caspase-3-aktivitet, og dette var tydelig selv i fravær av DTX cotreatment. Videre, selv om IFV eller CUR alene kan øke Caspase-3-aktivitet i DTX eksponerte celler, ble den mest signifikante økninger observert når både IFV og CUR ble anvendt i kombinasjon med DTX (sammenlign spor 5 og 8). Data fra PARP cleavage analyser ytterligere bekreftet dette differensial effekt av legemiddelkombinasjonen på apoptotisk celledød. I C4-2B celler, ble en 9-dobling observert innen 9-timer etter eksponering; imidlertid ble bare en 2,3 ganger økning sett i RWPE-1-celler. Derfor, kombinert eksponering til IFV og CUR øker dypt DTX-indusert apoptose av C4-2B cellene.
Induksjon av apoptose i C4-2B (A, C, D) og RWPE-en (B, E, F) celler etter behandling med DTX (10 nM), alene og i kombinasjon med IFV (5 uM) og /eller CUR (5 uM) ble evaluert ved DNA-fragmentering (A og B), Caspase-3-assay (C og E ) og PARP-spaltning (D og F). De DNA-fragmentering og caspase-3-analyser viser apoptose etter 24 timer etter eksponering. Endringer i PARP cleavage ble målt til 9 timer etter eksponering. Den rakner mønster av fragmentert DNA var indikasjon på apoptose, noe som ble ytterligere bekreftet ved øket AMC utgitt av aktivert kaspase-3 (n = 3) (*, p 0,05). Ekspresjon av både total og spaltet PARP ble bestemt ved Western blot analyser. Pilene indikerer spaltet PARP nivåer. Fold endringer i PARP-spaltning i stoffet utsettes cellene (kolonnene 2-8) sammenlignet med ubehandlede celler (spor-1) er vist etter normalisering med respektive p-aktin nivåer.
Kombinert behandling med DTX, NFR CUR opphever PI3K /AKT signalering i C4-2B celler
For å løse de underliggende mekanismene som er involvert i chemosensitization av 3-medikamentkombinasjon, vestlige immuno-deteksjons- studier ble utført for å overvåke både AKT-aktivering og uttrykk for flere ER- Stress markører (fig. 5 og fig. S2 i File S1). Innledende studier ble utført for å overvåke tid og doseavhengige virkninger av DTX, alene eller i kombinasjon med IFV og /eller CUR, i C4-2B-celler (fig. S2 i File S1). For å bestemme deres tidsmessige virkninger på AKT signalveien, ble C4-2B cellene først utsettes for medikamenter fra 30 minutter til 6 timer og deretter stimulert med insulin-lignende vekstfaktor-1 (IGF1, 10 ng /ml) i 15 min. Både total AKT (t-AKT) nivåer og AKT fosforylert ved serin-473 (p-AKT) ble bestemt. Sammenlignet med ikke-stimulerte celler, ble p-AKT økte med 3-4 ganger følgende IGF1 stimulering (ikke vist). I C4-2B celler, kan p-AKT undertrykkelse sees innen 30 minutter av eksponering, og var tydelig innen innen 3 timer. Interessant, selv om DTX alene var i stand til å øke p-AKT nivåer innen 30 min, denne økningen i AKT overlevelse veien ble ikke sett i celler coexposed til NFR CUR. De IGF-1 indusert p-AKT nivåer ble nesten avskaffet på 6 timer etter legemiddeleksponering (Fig. S2A i File S1). Hverken konsentrasjonen eller tidspunktet for legemiddeleksponering var i stand til å endre total AKT (t-AKT) nivåer i hver celletype.
